技术手册 上海普洛麦格生物产品有限公司 Eastep RT Master Mix Kit 产品目录号 : LS2050, LS2052, LS2054 1
目录 1. 产品描述... 3 2. 试剂盒特点... 3 3. 产品组分及储存条件... 4 4. 一般注意事项... 4 5. 操作步骤... 5 1) RNA 样本处理... 5 2) 逆转录反应... 6 3) Real-Time PCR... 7 4) 终点法 RT-PCR... 7 6. RNA 模板... 7 1) 制备方法... 7 2) RNA 样本中混有基因组 DNA 处理方法... 8 3) 基因组 DNA 残留鉴定... 8 7. 常见问题... 8 2
1. 产品描述 Eastep RT Master Mix 是从 Total RNA 或 Poly(A+)RNA 合成第一链 cdna 的优质逆转录反应试剂 本产品为 5X 预混液, 主要成份包含高效率逆转录酶 M-MLV MgCl2 dntp Oligo(dT)15 Primer Random Primers RNase inhibitor 和反应缓冲液, 只需添加模板 RNA 和水即可迅速地开始反应 本产品适用于高效合成全长的 cdna 模板和快速合成 Real-Time PCR 用短链片段 cdna 模板, 对扩增 2kb 左右的片段效率更高 如需 Real-Time PCR 检测, 推荐与本公司生产的 Eastep qpcr Master Mix 共同使用, 以达到更好的反应灵敏度 此外, 由于本产品中加入 gdna Remover 能有效去除 RNA 模板中的 gdna 污染, 使实验数据更准确 2. 试剂盒特点 简单 : 完全预混型试剂, 只需添加模板 RNA 和水即可 ; 快速 : 最快可在 15min 内高效合成 Real-Time PCR 用短链片段 cdna 模板, 同时该产品也适用于高效合成全长的 cdna 模板 ; 均一 : 使用了 Oligo(dT)15 Primer 和 Random Primers 两种逆转录引物, 可对 RNA 的整个区域进行均一的逆转录反应 ; 兼容性好 : 具有与 Real-Time PCR 试剂的高兼容性, 与本公司生产的 Eastep qpcr Master Mix 共同使用时, 能达到更好的检测灵敏度 ; 逆转录温度范围广 : 可根据 RNA 模板的不同选择 37-50 进行实验 ; 3
3. 产品组分及储存条件 目录号反应次数名称规格 Eastep RT Master Mix (5X) LS2050 50 次 (10μl 反应体系 ) gdna Remover 1.5ml 20μl 10X DNase I buffer Dilution buffer 1ml Eastep RT Master Mix (5X) 400μl 1.5mX2 LS2052 200 次 (10μl 反应体系 ) gdna Remover 20μl 10X DNase I buffer Dilution buffer 1ml Eastep RT Master Mix (5X) 400μl 1.5mX2 LS2054 200 次 (10μl 反应体系 ) ( 含 No-RT Control) gdna Remover 10X DNase I buffer 20μl Dilution buffer 1ml No-RT Control 存储条件 : -20 保存 如需频繁使用, 可 4 存放 3 个月, 避免反复冻融 4. 一般注意事项 以下为使用本产品时应注意事项, 使用前需采取以下措施 : 1) 为避免样本 DNA 和 RNA 交叉污染, 进行逆转录和 PCR 扩增时应使用指定专门区域和移液器 ; 2) 配戴一次性干净手套和口罩操作, 操作过程中避免讲话 ; 3) 使用 Nuclease-free 的试剂 带滤芯 Tip 头 灭菌的 Nuclease-free 薄壁 PCR 管 ; 4) 本产品在使用前应轻微离心将 5X 反应液收集至管底, 小心吹打混匀, 然后放置于冰上待用 ; 4
5. 操作步骤 材料准备 : 灭菌的 Nuclease-free 薄壁 PCR 管, 0.2ml; 移液器与 Nuclease-free 的带滤芯 Tip 头 ; 用 Nuclease-free 水稀释的高质量 RNA 模板 ; 冰水浴 ; PCR 仪 ; 特异性引物 ; Taq DNA polymerase 或 GoTaq Hot Start Polymerase (Cat.# M5001) 及相关的缓冲液,MgCl2,dNTP; PCR Master mix 如 GoTaq Green Master Mix (Cat.# M7122) 或 GoTaq Colorless Master Mix (Cat.# M5133); qpcr system 如 Eastep qpcr Master Mix (Cat.# LS2062) 或 GoTaq qpcr Master Mix (Cat.# A6001) 或 Plexor qpcr System (Cat.# A4011); 1) RNA 样本处理 ( 去除基因组 DNA) 1.1 初次使用时将 gdna Remover 与 10X DNase I buffer 混合配制成 5X gdna Remover Master Mix*: 组分 gdna Remover 10X DNase I buffer Nuclease free water 体积 (μl) 10μl 50μl 40μl *5X gdna Remover Master Mix 在 -20 条件下保存至少可稳定 3 个月以上, 用户可根据实验需求配制 5X 工作液的体积 1.2 去除 RNA 样本中 gdna 反应体系配制 : 组分 5X gdna Remover Master Mix RNA Template 体积 /μl 1μl 1μg 加水至 5μl 将反应液轻轻地混合均匀后, 在 37 条件下温育 10 分钟, 然后在 70 条件下热变性 5 分钟后立即置于冰上冷 却 ; 用户可根据需要, 扩大反应体系 5
2) 逆转录反应 请在冰上按下表配制逆转录反应液 : 组分 体积 (10μl 反应体系 ) Eastep RT Master Mix,5X 2μl RNA template 100ng-1μg 加水至 10μl 对于易形成高级结构的 RNA 可预先将 RNA 模板 70 加热处理 5 分钟, 之后立即置于冰上, 可以提高逆转 录的效率 初次实验时, 建议进行条件摸索 ( 如进行该步骤, 请先不要加入 5X RT Master Mix); 在制备 Real-Time PCR 的 cdna 模板时, 建议 10μl 体系加入 RNA 的量为 100ng 为了获得良好的扩增曲线和扩增效率以及基因表达丰度, 10μl 体系 RNA 的加入量可增加至 500ng; 如 cdna 模板浓度较高时, 可使用 Dilution buffer 或 对逆转录产物进行梯度稀释, 稀释后的逆转录产物上样体积可达到 Real-Time PCR 反应总体积的 20%; 对于用逆转录产物进行基因克隆, 可根据实验需求提高 RNA 模板的用量,20μl 体系加入 RNA 的量最多可达 2.5μg; PCR 引物至少跨越一个内含子, 以区分 mrna 和基因组 DNA 的扩增片段, 如果某些基因无法设计跨内含子的引物, 建议用 DNase I 再次处理 RNA 模板, 具体方法见 6.RNA 模板 ; 进行逆转录阴性对照时, 可用 No-RT Control 代替 5X Eastep RT Master Mix, 通过与逆转录阴性的对照, 可确认信号是否来自 cdna LS2050,LS2052 产品包装不提供 No-RT Control, 用户可根据自已需求单独购买 No-RT Control( 目录号 :RM103A) 或者购买含 No-RT Control 包装的 LS2054 产品 ; 轻柔混匀反应液进行逆转录反应, 反应条件如下 : 温度 时间 37 15min( 逆转录反应 ) 98 5min( 逆转录酶失活反应 ) 4 Hold 本产品最适逆转录温度为 37, 也可设置 42 进行逆转录反应,50 逆转录酶效率有所下降, 一般情况下 推荐使用 37 或 42 进行逆转录反应 ; 对于用逆转录产物进行基因克隆, 建议延长逆转录时间至 1hr; 反应结束后, 如需频繁使用, 逆转录产物置于 4 保存 长期保存需放置于 -20 ; 6
3) Real Time PCR 本产品合成的 cdna 模板可直接用 或用 Dilution buffer 稀释后进行 Real-Time PCR 为了获取良好的扩增曲线, 建议用户先对逆转录 (RT) 产物稀释后再进行检测 ; 稀释样品时, 可根据预估的待测基因表达量, 选择合适的稀释倍数 如样本中基因丰度较低时用 1:5, 基因丰度较高时可用 1:10(RT 产物 : Dilution buffer), 样本稀释也可用 代替 Dilution buffer; 进行 Real-Time PCR 检测时, 上样量不超过反应体积的 20%, 如不进行 RT 产物稀释, 建议 20μl 体系加入 RNA 模板的量为 200ng; 客户可根据目标基本表达量的预测值及 cdna 模板起始浓度调整稀释倍数后进行实验, 以获得更准确的实验结果 进一步相关的信息请参考 Eastep qpcr Master Mix 操作手册 ; 4) 终点法 RT-PCR 本产品适用于终点法 PCR 扩增反应,cDNA 模板无需稀释可直接作为 PCR 模板使用 在进行常规 PCR 扩增获取全长的基因克隆中, 通过调整优化 MgCl2 dntp 引物以及缓冲液等浓度来消除逆转录产物对后续 PCR 扩增的影响,cDNA 模板上样量可达到 PCR 反应体积的 20% 配制 PCR 预混液时应充分考虑 RT 产物中各缓冲液成分 ( 如离子强度 MgCl2 dntp) 对 PCR 反应的影响 客户在进行 PCR 反应时, 加入的 Mg 2+ dntp 和缓冲液的量应考虑加入的 RT 产物模板中这些成分的含量, 在实验中进行适当调整 例如 : PCR 体系中 RT 产物含 20μl, 则 5 PCR 缓冲液只需加入 16μl, 如 5μl RT 产物加入 95μl PCR 混合液中, 则 5XPCR 缓冲液需加入 19μl, 其余的成份同样考虑 6. RNA 模板 RNA 模板的完整性以及纯度决定 RT 反应 cdna 模板的合成量, 而制备 RNA 的关键在于抑制细胞或组织中的 RNase 和防止所用器具及试剂中的 RNase 的污染 因此, 在整个实验过程中必需采取措施以减少 RNA 的降解, 相关注意事项详见 4. 一般注意事项 1) 制备方法 : 获取高质量的 RNA 建议用 GTC 法 ( 异硫氢酸胍法 ) 推荐使用本公司 Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒 ( 目录号 :LS1040) 制备 RNA 模板, 纯化的 RNA 建议用灭菌的 来洗脱 7
2) RNA 样本中混有基因组 DNA 处理方法 : 目前市售的 RNA 提取试剂盒制备的 RNA 样本残留有数量不等的基因组 DNA, 为了实验结果的精确性, 可通过以下三种方法解决这个问题 : 设计引物时考虑跨足够长的内含子, 引物设置在两个外显子上 ; 当内含子较短时, 而 Real-Time PCR 本身检测的片段较短, 可利用 cdna 和基因组片段长度不同其熔解温度具有差异的特点, 结合熔解曲线的 Tm 值来判断 ; 内含子较短或不能设计跨内含子的引物时, 可参照上述操作步骤的第一步对 RNA 样品进行去 gdna 处理 ( 见本章 1.1-1.2) 推荐使用本公司生产的 Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒 ( 目录号 :LS1040) 提取 Total RNA, 以获得更好质量的 RNA 及更好试剂兼容性 3) 基因组 DNA 残留鉴定 : 不进行逆转录反应, 用 Real-Time PCR 法或终点法 PCR 鉴定 RNA 样本中基因组残留 : 设计跨内含子或不跨内含子的引物选取上述两种方法之一或两种方法对用 DNase I 再次消化前后的两个 RNA 样本进行检测 ; 对于跨内含子引物有扩增产物的基因片段, 通过琼脂糖凝胶电泳或熔解曲线也能判断产物的来源 ; 7. 常见问题 现象 原因 解决方案 RNA 降解 灭菌的 Nuclease-free 薄壁 PCR 管, 带滤芯的 Tip 头, 配戴一次性干净手套和口罩操作, 所有试剂和耗材应为 Nuclease-free; RNA 储存在 -70, 并分装, 使用时冰上放置 ; 可在 RNA 样本中加入 RNase 抑制剂 RNasin; 对于低质量微量离心管可以吸附部分 RNA 样本, 尤其是 RNA 样本浓度过低或进行梯度稀释该现象更明显, 建议 : 全长 cdna 得率低样本稀释 将 RNA 样本用惰性载体稀释, 如 background RNA; 进行 RNA 模板稀释时, 应现用现配 ; RNA 样本保存时应使用高浓度 ; RNA 样本中可能含有以下抑制剂 :SDS,EDTA,polysaccharides, 抑制剂存在 heparin, guanidine thiocyanate 或其它盐, 使用 Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒 ( 目录号 :LS1040) 提取 RNA; 8
RT-PCR 产物长度高于预期值 RT-PCR 有杂带 RT-PCR 或 RT-qPCR 产物浓度低 进行 PCR 反应时, 引物退火温度过高, 建议 : 进行梯度 PCR 以确定一个合适的退火温度, 也可利用 Promega 提供引物的 Tm 计算软件进行预测, http://www.promega.com/resources/tools/biomath-calculators#melt RNA 形成高级结构, 会抑制逆转录反应, 建议 : 在逆转录前对 RNA 样本 70 处理 5min, 并迅速置于冰上冷却后再 RNA 容易形成高级使用 ; 结构 可在 RT 混合液中加入 1M betaine,2% DMSO 或者 5% deionized formamide 以降低 RNA 的二级结构 ; 本试剂盒 MgCl2 的工作浓度为 4mM, 过高的 MgCl2 能引起长片段 cdna 的降解, 可用变性胶分析 32 P 标记的 cdna, 如有降解可使用含低浓度 MgCl2 的 MgCl2 浓度 RT 试剂逆转录得到 cdna, 高浓度 MgCl2 的 RT 试剂有利于获得短片段 cdna, 低浓度 MgCl2 的 RT 试剂有利于获得长片段的 cdna; 设计跨内含子的引物 ; 有基因组污染 使用 DNase I 再次对样本进行处理 ; 建议使用带滤芯的枪头 ; 出现其他 RNA 或 提取不同 RNA 模板时应分开 ; DNA 模板的交叉污 进行逆转录和 PCR 扩增时应指定专门区域和移液器 ; 染或基因组 DNA 配戴一次性干净手套和口罩操作 ; 污染 PCR 反应时使用 UNG 酶和 dutp 以消除气溶胶污染 ; 引物特异性弱 重新设计引物 ; 逆转录反应增加 RNA 样本的上样量, 进行 qpcr 时适当对 RT 产物用水进行稀释, 同时增加 RT 产物上样体积 ; 基因表达丰度低, 提高 qpcr 检测体积如由 20μl 体系增加至 50μl 体系, 同比例增加 cdna 模板上样量 RT 产物的上样体积 ; 低 RNA:cDNA 杂交降低 PCR 的效率, 可用 RNaseH 对 RT 产物进行消化后再进行 qpcr 检测 ; 该实验样本中不含该基因表达, 建议重新选择样本进行实验 ; 重新设计引物 ; 引物问题 退火温度不合适, 建议进行梯度 PCR 或用 Tm 计算软件进行预测 ; MgCl2 非最佳浓度, 建议对镁离子浓度进行优化 ; PCR 试剂问题 dntp 降解或浓度不正确, 建议使用新的试剂 ; 延伸时间过短, 可延长延伸时间 ; PCR 反应程序 增加循环数 ; 实验耗材与 PCR 不匹配的耗材如 PCR 管 ; 不同逆转录试剂所得到样本用不同 PCR 试剂盒进行检测时可能存在抑制因 RT 试剂与 PCR 试素, 建议 : 剂不匹配 降低 RT 产物的用量, 或对 RT 产物进行适当稀释上样 ; 使用同一家公司的配套产品进行实验 ; 9