产品编号 KT110700724/KT110700796 MALBAC 白金微量 RNA 扩增试剂盒 产品名称 通用名 :MALBAC 白金微量 RNA 扩增试剂盒 英文名 :MALBAC Platinum Single Cell RNA Amplification Kit 包装规格 24 测试 / 盒,96 测试 / 盒 产品描述 MALBAC 白金微量 RNA 扩增试剂盒能在 5-6 小时内, 由 1-2000 个细胞或 10 pg-20 ng 经提取的真核生物总 RNA 为起始, 特异性针对其中的 mrna 进行逆转录, 并以 MALBAC Template-switching 专利技术在 cdna 的 3 端添加一段带有表达定量分子标签的接头序列, 通过该接头序列进行后续的 PCR 扩增, 获得全长 cdna 扩增产物, 有效避免了 cdna 合成过程中的 3 偏好性和基因组 DNA 与 rrna 的污染, 同时表达定量分子标签可辅助基因表达量计算, 在完整扩增 mrna 序列信息的同时保留链来源信息, 对基因表达进行精确定量 一般情况下, 一个反应视投入量可以扩增出 2-50 ng 高质量全长双链 cdna 本试剂盒可获得 95% 以上的逆转录与扩增成功率, 全长 cdna 扩增产物可无缝衔接主流测序平台, 如 Illumina Ion torrent PGM Ion Proton 测序仪, 下机数据 (2.5M Reads) 可检测到 90% 以上的基因表达, 基因表达一致性超过 90%, 扩增无明显偏倚, 且需要的样本投入量更少 预期用途 本产品主要用于单细胞 RNA-Seq 前的样本扩增 单细胞 RNA-Seq 是指通过对单个细胞的 mrna 进行逆转录和 PCR 扩增, 使用高通量测序手段, 对单细胞中 mrna 进行基因表达定量 功能富集 代谢通路等分析 本产品可以解决传统 RNA 逆转录与扩增技术在早期胚胎发育 干细胞 癌症 免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题, 是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具, 极大地拓展了 RNA-Seq 的应用范围 : 极微量样品的表达分析 ( 单个细胞 ) 胚胎早期发育研究 肿瘤细胞异质性研究 免疫细胞群研究 干细胞分化研究 产品原理 本产品可实现高效且均一的全长转录本扩增 单细胞 ( 或极微量细胞 ) 经热裂解后释放总 RNA, 在逆转录酶的作用下对其中 mrna 进行逆转录并获得 cdna 第一链, 而后以 MALBAC Template-switching 专利技术在 cdna 的 3 端添加一段接头序列, 并进行 Template-switching, 而后以接头区段为引物锚定位点进行指数扩增, 以获得符合下游分析或文库构建要求的高质量全长 cdna 其核心技术为专利的 MALBAC Template-switching 技术, 可在完整扩增 mrna 全长序列信息的同时保留链来源信息, 同时对表达量进行精确定量 ( 打断方法构建文库 ), 为 RNA-Seq 下游实验或分析提供充足的材料 主要组成成分 1 / 6
组分 标签名 KT110700624 (24 反应 ) KT110700696 (96 反应 ) 细胞裂解液 Cell Lysis Buffer 36 μl/ 管 1 管 144 μl/ 管 1 管 逆转录缓冲液 RT Buffer 319.2 μl/ 管 1 管 1276.8 μl/ 管 1 管 逆转录酶混合液 RT Enzyme Mix 40.8 μl/ 管 1 管 163.2 μl/ 管 1 管 指数扩增反应液 PCR Mix 720 μl/ 管 1 管 1440 μl/ 管 2 管 无 RNA 酶水 RNase Free H2O 1mL/ 管 1 管 1mL/ 管 1 管 储存条件及有效期 -20 保存, 有效期 :24 个月 如需多次使用, 可依据需求按比例分装冻存, 避免反复冻融 自备物品 1. 试剂 :1 PBS 缓冲液 ; 2. 仪器 : 离心机 涡旋混匀仪 PCR 仪 单细胞分选相关仪器 产品特点 极低起始量 : 单个细胞 ( 或 10pg total RNA); 极高效率 :mrna 逆转录与扩增后可获得 2-50 ng 高质量全长 cdna; 操作简单 : 单管操作,3 步完成 实验流程仅需 5-6 小时即可完成 适用领域 本试剂盒可解决传统 RNA 逆转录与扩增技术在早期胚胎发育 干细胞 癌症 免疫等研究领域中存在的样 品量极低或细胞异质性的问题 样本要求 1. 样本起始量本试剂盒是针对单细胞或极微量细胞的转录组扩增设计的, 使用 Oligo dt Primer 扩增带 polya 序列的 RNA 兼容多种样品类型 :1-2000 个哺乳动物细胞, 或其他无细胞壁结构的真核细胞 ;10 pg-20 ng 纯化后的总 RNA ( 请注意, 如以微量 RNA 为起始, 强烈建议在试剂盒中无 RNA 酶水中 49:1 掺入 RNase Inhibitor, 配置成 Mix, 作为 RNA 稀释 Buffer); 不适用于原核细胞 ; 不适用于固定后的细胞 2. 样本收集方式 FACS 分选 激光捕获显微切割 (LCM) 针吸活检 微流体技术方式获得的单细胞均可利用本试剂盒进行转录组扩增 3. 样本预处理由于细胞的基因表达是瞬时变化的, 细胞类型 细胞活性及细胞所处周期的不同, 都会显著影响最终的 cdna 产出 请确定细胞的获取方式对细胞活性的影响, 我们建议在每次收集完细胞样品后对细胞活性进行鉴定, 死亡的细胞会发生明显的 RNA 降解并导致反应失败 鉴定合格后建议立即进行反应, 不适当的保存条件会导致细胞中的 RNA 降解 为避免细胞准备过程中外源 RNA 的污染, 建议在实验前对细胞进行清洗, 清洗液为不含 Mg 2+ 和 Ca 2+ 的无菌 1 PBS 溶液 实验准备 1. 预扩增样本准备区的隔离为避免样本受外界因素干扰或 RNA 酶的污染, 在实验前, 细胞样本的准备过程需在单独隔离的实验室或专门工作区完成, 并预备专用的实验材料和仪器, 例如, 移液器 移液管 PCR 管 1.5 ml 的离心管 离心管 2 / 6
架 离心机 漩涡混和仪和实验服等 ; 请将扩增产物与试剂盒中其他试剂分开储存 所有的下游分析处理, 如 DNA 纯化 测序前的准备工作, 请在另一实验室进行 2. 对照组 DNA 样本阳性对照配置 : 如以细胞为起始, 可将同批 ( 处理方式相同 ) 的约 100 个细胞作为阳性对照 ; 如以核酸为起始, 可用同批 ( 处理方式相同 ) 的 1 ng 总 RNA 为阳性对照 阴性对照配置 : 取 3.5μL 无 RNA 酶水, 加入到含 1.5μL Cell Lysis Buffer 的 PCR 管中, 作为阴性对照 使用方法 注意 : 由于单细胞转录组扩增实验全程在同一 PCR 管中进行且裂解反应体积较小, 因此加液操作时, 移液 器吸头不要接触管中液体, 避免将单细胞或核酸裹挟出反应体系 ; 移液时请沿管壁小心添加, 勿剧烈吹打 以免产生气泡 ; 反应前请进行短暂离心 ( 掌上离心机,3-4 秒 ), 确保反应体系中的液体和模板混合充分 使用前请将含酶的组分置于冰浴中, 无酶组分可在用前置于冰上解冻 步骤一 : 获取单细胞 ( 或微量细胞 ) 及细胞裂解 1. 细胞稀释 : 将细胞用 1x PBS 缓冲液 ( 以下 PBS 均指 1 PBS 缓冲液 ) 稀释, 离心 重悬, 处理为细胞悬 液, 密度为 ~20 个细胞 /μl; a. 组织处理方法 : 将组织在液氮中磨碎, 每 20-30 mg 组织加约 600 μl PBS,12,000 rpm (~13,400 g) 离心 1 分钟, 得到细胞沉淀, 弃上清并吸取细胞沉淀, 用 1x PBS 稀释处理成细胞悬液 ; b. 单层培养细胞处理方法 : 以 P1000 移液器将贴壁细胞轻轻吹下,12,000rpm (~13,400 g) 离心 1 分钟, 得 到细胞沉淀, 弃上清并吸取细胞沉淀, 以 1xPBS 稀释处理成细胞悬液 ; c. 细胞悬液处理方法 :12,000rpm (~13,400 g) 离心 1 分钟, 得到细胞沉淀, 弃上清并吸取细胞沉淀, 用 1xPBS 稀释处理成细胞悬液 注意 : 尽量除尽细胞培养基, 细胞培养基可能抑制细胞裂解并影响 RNA 质量 尽量使细胞充分悬浮并计数, 计数不准确可能影响单细胞分离 2. 细胞裂解 : 将单细胞加入含有 1.5μL Cell Lysis Buffer 的 PCR 管中 ; 注意 : 含有单细胞样本的 PBS 溶液体积不得超过 3.5μL, 严格的体积控制 (5μL, 如不足请以无 RNA 酶 水补齐 ) 有助于逆转录反应的顺利进行 3. 将 13.3 N μl 的 RT Buffer 置于 PCR 管中 (N 为反应的数量 ); 4. 在预热的 PCR 仪中孵育样本和 RT Buffer(RT Buffer 中千万不可加逆转录酶 ), 条件如下 : 温度 时间 72 3 min 立即置于 0 2 min 步骤二 : 逆转录获得双链全长 cdna 5. 吸取 1.7*N μl 的 RT Enzyme Mix 加入到上一步 72 处理后的 RT Buffer 中, 标记为 RT Mix, 手动混 匀, 离心 ; 6. 在每份细胞裂解产物中, 加入 15μL RT Mix, 瞬时离心后立即置于冰上, 在预热的 PCR 仪上孵育样 本, 条件如下 : 温度 时间 循环 42 90 min 1 50 2 min 42 2 min 10 70 15 min 12 Forever 1 步骤三 : 指数式扩增反应 3 / 6
7. 将 30 μl PCR Mix 加入到上一步的逆转录产物中 ( 此时溶液体积为 50 μl), 混匀后放入 PCR 仪中扩增, 反应条件如下 : 温度 时间 循环 98 3 min 1 98 20 s 68 15 s 18* 72 6 min 72 5 min 12 Forever 1 * 扩增循环数参考 : 总 RNA 细胞 参考循环数 10-20ng 1000-2000 7-8 1ng 100 11-12 100pg 10 14-15 10pg 1 17-18 上表参考循环数是以 GM12878 细胞为测试样本得到的参考数据 由于不同的细胞 RNA 含量存在较大差 别, 请根据样品酌情增减扩增循环数, 首次测试一种细胞时, 我们强烈建议设置循环数梯度, 确定最佳循 环数 扩增产物检测 1. 纯化本试剂盒使用的逆转录酶保护系统能使逆转录酶稳定地进行工作, 但会使常规纯化磁珠结块, 如直接使用磁珠纯化, 会影响纯化质量, 我们推荐以下两种纯化方式结合使用 : 首先使用柱纯化去除逆转录酶保护系统 : 推荐产品为 DNA Clean & Concentrator -5( 货号 : D4013) 或其他等效产品 ( 需自行测试 ), 产物回溶于 50μL Elution Buffer 中 ; 而后使用磁珠纯化进行小片段去除 : 在上步得到的 50μL 产物中加入 Agencourt AMPure XP beads( 货号 : A63881) 或其他等效产品 ( 需自行测试 ), 酒精清洗后, 磁珠回溶于 17.5μL Elution buffer, 取 15μL 储存 2. cdna 扩增产物检测 cdna 扩增产物的产量与片段分布是判断实验是否成功的重要指标, 推荐使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行检测 取 1 μl 纯化后的 cdna 扩增产物合理稀释后, 使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 和 High Sensitivity DNA Chip 进行检测, 操作说明见 High Sensitivity DNA Chip 操作手册 一般情况下, 根据使用的起始模板不同, 成功的反应产出 2-50 ng 扩增产物, 纯化成功的 cdna 核酸的峰图分布于 600-10000 bp, 主峰位于 2500 bp 左右, 阴性对照应无产物出现 产物保存 纯化产物请保存于 -20, 备用 建库方法 推荐以下两种建库方法 : 转座酶法建库 ( 读长和数据量由用户根据实际需要自行确定 ) 打断建库法 ( 如需表达绝对定量, 则建议采用打断建库法, 数据分析方法则需与我公司技术支持取得联系 ) 问题解决方案 4 / 6
问题 原因 措施 样本在收集过程中丢失 重新收集样本, 确保操作准确 无扩增产 起始样本中含有逆转录酶抑制剂或 RNA 酶 建议实验前应使用清洁的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保样本中不含抑制剂或 RNA 酶 物 酶失活 试剂盒除去 RNA 酶水外, 所有的组份都应该在 -20 的条件下保存 ; 试剂复融过程需在冰上进行, 使用前分装, 避免反复冻融 扩增产物 起始样本中含有逆转录酶抑制剂或 RNA 酶 建议实验前应使用清洁的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保样本中不含抑制剂或 RNA 酶 含量低避免细胞或总 RNA 因储存或准备方法不当造成 RNA 的降解 RNA 降解影响扩增效率 避免试剂盒的组份与其他扩增产物或模板接触, 并使用无核 酸酶和无核酸污染的实验耗材进行逆转录与扩增, 建议实验阴性对照试剂被外源性核酸污染前应使用清洁的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 并确保实产生了与验环境中不含有外源 RNA DNA 污染 实验组相操作台被外源性核酸污染使用核酸去污剂彻底清理操作台似产物阴性对照溶液被外源性核使用新阴性对照酸污染 注意事项 1. 操作前必须仔细检查所有样品, 应排除污染的样品 ; 2. 操作注意安全防护, 穿戴防护衣物 一次性手套 口罩 ; 所有直接接触过样本的物品应进行消毒后丢弃或再次使用, 同时防止操作者脱落细胞的污染 ; 3. 使用前, 试剂应混合均匀, 尽量避免反复冻融 ; 4. 所使用的接触试剂的材料均要求干燥 洁净, 以防止污染 操作过程中涉及的耗材如为一次性使用, 则不得重复使用 ; 5. 实验人员必须进行专业培训, 严格按照说明书操作 ; 6. 本试剂一次性使用, 不同批号试剂禁止交叉使用, 请勿使用过期试剂 ; 7. 样本应视为存在潜在的生物危害, 实验结束后作为潜在传染源处理 ; 8. 操作应尽量迅速, 减少准备过程中出现核酸污染或混入聚合酶抑制剂 ; 9. 避免样本因储存方法或准备方法不当造成的 RNA 降解 ; 10. 请严格按照试剂盒储存条件存放试剂盒各个组分, 防止由于储存不当导致的试剂失效或其他不良结果 ; 11. 本试剂盒仅供科研使用, 不用于临床诊断和其他用途 ; 12. 本试剂盒必须严格按照说明书进行操作, 由于不按说明书操作引起的损失和伤害 ( 相关法律特别要求的除外 ), 本公司不承担由此引发的任何责任 基本信息 生产企业 : 亿康基因科技有限公司地址 : 上海 : 上海市徐汇区田林路 888 号科技绿洲一期 1 楼 102 室,200233 北京 : 北京市海淀区永丰产业基地永澄北路 2 号院 1 号楼绿海大厦 C 座 302 室,100094 江苏 : 江苏省泰州市药城大道一号 TQB 大楼 5 楼,225300 苏州 : 江苏省苏州市工业园区星湖街 218 号生物纳米园 B7 楼 201 室,215000 邮箱 :technical@yikongenomics.com( 技术支持 ) info@yikongenomics.com( 咨询 ) 5 / 6
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