2013 年 3 月 Vol. 31 No. 3 March 2013 Chinese Journal of Chromatography 270 ~ 274 技术与应用 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1123. 2012. 10038 高效液相色谱 串联质谱检测牛奶中的甲状腺素 王宗义 1 ꎬ 杨定忠 2 ꎬ 冀梦瑶 1 ꎬ 贾昌喜 1 1 ꎬ 黄漫青 (1. 北京农学院食品科学与工程学院农产品安全检测与控制北京市重点实验室 ꎬ 北京 102206ꎻ 2. 天津博纳艾杰尔科技有限公司 ꎬ 天津 300462) 摘要 : 建立了高效液相色谱 串联质谱 ( HPLC MS / MS) 检测牛奶中甲状腺素 3ꎬ3 ꎬ5ꎬ5 四碘 L 甲腺原氨酸 ( T4)ꎬ 3ꎬ3 ꎬ5 三碘 L 甲腺原氨酸 (T3) 和 3ꎬ3 ꎬ5 三碘 L 甲腺原氨酸 (rt3) 的方法 ꎮ 样品用乙腈提取 ꎬ 离心 ꎬ 上清液经氨 水碱化和 Cleanert PAX 固相萃取小柱净化 ꎬ 在 Zorbax Eclipse XDB C18 (150 mm 2 1 mmꎬ 3 5 μm) 色谱柱上 以 0 1% (v / v) 乙酸水溶液和甲醇为流动相等度洗脱分离 ꎬ 以电喷雾正离子 (ESI + ) 模式电离 ꎬ 多反应监测 ( MRM) 模式质谱检测 ꎬ 内标法定量 ꎮ 结果表明 ꎬ 甲状腺素的检出限 ( LOD) 不大于 0 03 ng / gꎬ 定量限 ( LOQ) 不大于 0 1 ng / gꎻ 在考察的浓度范围内线性关系良好 ( r 2 > 0 998)ꎻ 回收率为 80 61% ~ 101 7%ꎬ 相对标准偏差 ( RSD) 为 1 48% ~ 9 70%ꎮ 室温下样品溶液中的甲状腺素保持稳定 ꎮ 对 5 个牛奶样品的测定结果显示 ꎬT3 含量为 0 59 ~ 1 30 ng / gꎬ RSD 为 2 06% ~ 7 70%ꎻ T4 和 rt3 未检出 ꎮ 该方法具有样品处理简单 ꎬ 灵敏度高 ꎬ 重现性好 ꎬ 定性和定 量结果可靠等特点 ꎬ 为牛奶中甲状腺素的测定和相关质量安全评价提供了可靠手段 ꎮ 关键词 : 高效液相色谱 串联质谱 ꎻ 甲状腺素 ꎻ 牛奶 中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 :1000 8713(2013)03 0270 05 Determination of thyroid hormones in milk by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry WANG Zongyi 1 ꎬ YANG Dingzhong 2 ꎬ JI Mengyao 1 ꎬ JIA Changxi 1 ꎬ HUANG Manqing 1 (1. Beijing Key Laboratory of Agricultural Products Safety Detection and Controlꎬ College of Food Science and Engineeringꎬ Beijing University of Agricultureꎬ Beijing 102206ꎬ Chinaꎻ 2. Bonna Agela Technologiesꎬ Tianjin 300462ꎬ China) Abstract: A method of high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( HPLC MS / MS) was developed for the determination of thyroid hormones in milk including 3ꎬ3 ꎬ5ꎬ5 tetraiodothyronine ( T4) ꎬ 3ꎬ3 ꎬ5 triiodothyronine ( T3) and 3ꎬ3 ꎬ5 triiodothyronine ( rt3). The sample was extracted with acetonitrile and centrifugedꎬ then the up layer was alka lized with concentrated ammonia water and cleaned up with a Cleanert PAX cartridge. The chromatographic separation was carried out on a Zorbax Eclipse XDB C18 column (150 mm 2 1 mmꎬ 3 5 μm) with the mobile phase of 37% water containing 0 1% (v / v) acetic acid and 63% of methanol with an isocratic elution mode at a flow rate of 0 3 ml / min. The mass spec trometry detection was performed in positive electrospray ionization and monitored using multi ple reaction monitoring (MRM) mode (m / z 652 0 / 605 5 and 652 0 / 478 6 for T3 and rt3ꎻ m / z 777 7 / 731 7 and 777 7 / 604 9 for T4ꎻ m / z 784 0 / 737 9 and 784 0 / 639 4 for T4 13 C 6 ). The an alytes were identified by their retention times and relative abundance ratios of the characteristic product ionsꎬ and quantified by internal standard method. The method was linear with the cor relation coefficients (r 2 ) greater than 0 998 in the concentration ranges investigated. The limits of detection ( LODs) were not more than 0 03 ng / gꎬ and the limits of quantification ( LOQ) were not more than 0 1 ng / g for the analytes. The recoveries were 80 61% - 101 7% with the relative standard deviations ( RSDs) of 1 48% - 9 70%. The results of five real milk samples 通讯联系人. Tel:(010)80799170ꎬE mail:jcxbac@ sohu. com. 基金项目 : 北京农学院基础科学基金重点资助项目 (2067516001). 收稿日期 :2012 11 12
第 3 期王宗义 ꎬ 等 : 高效液相色谱 串联质谱检测牛奶中的甲状腺素 271 showed that the contents of T3 were 0 59-1 30 ng / g with the RSDs of 2 06% - 7 70%ꎬ and T4 and rt3 weren t found. The method presents many merits including simple sample pretreat mentꎬ high sensitivityꎬ good reproducibility and unequivocal confirmation and quantification for the analytes. It could be used to monitor the levels of thyroid hormones in the milk for safety quality evaluation. Key words: high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( HPLC MS / MS) ꎻ thyroid hormoneꎻ milk 甲状腺素 (TH) 是维持人和动物体正常生理功能的重要激素 ꎬ 包括 3ꎬ3 ꎬ5ꎬ5 四碘甲腺原氨酸 (T4)ꎬ 3ꎬ3 ꎬ5 三碘甲腺原氨酸 (T3) 和无生理活性的 3ꎬ3 ꎬ5 三碘甲腺原氨酸 (rt3)ꎮ 早在上世纪 70 至 80 年代就已经证实人乳和牛乳中存在微量甲状腺素 [1ꎬ2] ꎬ 并且证实注射 T3 会使大鼠和兔子奶中的 T3 水平显著升高 [3ꎬ4] ꎮ 给奶牛注射 THꎬ 或饲喂碘化酪蛋白 ( 活性物质为 TH)ꎬ 能显著提高奶牛产奶量 [5ꎬ6] ꎬ 但这是否对牛奶质量安全产生影响 ꎬ 尚不清楚 ꎮ 因此 ꎬ 建立牛奶和奶粉中 TH 的检测方法对开展相关研究和质量安全评价具有重要意义 ꎮ 关于 TH 的检测有大量报道 ꎬ 应用最多的是免疫分析相关方法 [7ꎬ8] 高效液相色谱法( HPLC) [9] 液相色谱 质谱法 ( LC MS) [10] 和液相色谱 串联质谱法 ( LC MS / MS) [11] 等 ꎮ IA 相关方法具有简便 快速和成本低等特点 ꎬ 但用于测定游离 TH 时容易受到其他蛋白质和抗体的干扰 [12] ꎮ HPLC 法对低 TH 含量试样特异性和检出能力不足 ꎮ LC MS 法和 LC MS / MS 法由于在特异性 检出限和可靠性方面都具有突出的优势 ꎬ 特别是 LC MS / MS 法 ꎬ 近年来在 TH 的临床检验上受到重视 [12] ꎬ 但使用 LC MS / MS 检测牛奶样品中的 TH 尚未见报道 ꎮ 本文通过选择和优化样品处理方法和分析条件 ꎬ 建立了牛奶中 TH 的 LC MS / MS 的检测方法 ꎬ 为相关研究和乳品质量安全评价提供了可靠手段 ꎮ 1 实验部分 1. 1 仪器 材料和试剂 Agilent 6410 Triple Quad LC / MS 系统 ( 美国 )ꎻ H 1850R 离心机 ( 长沙湘仪离心机仪器有限公司 )ꎻ AWL 1002 U 艾科浦超纯水系统 ( 重庆顺洋企业发展有限公司 )ꎻ 12 孔固相萃取装置 BF 2000 氮气吹干仪 0 2 μm 针式过滤器 ( 北京八方科技有限公司 )ꎻ Cleanert PAX 固相萃取小柱 ( 3 mlꎬ 60 mg)( 天津博纳艾杰尔科技有限公司 )ꎻ 50 ml 塑料离心管 ( BD Biosciences 公司 )ꎮ HPLC 级甲醇 乙腈 ( Burdick & Jacksonꎬ Honeywell 公司 )ꎻ HPLC 级乙酸 分析纯甲酸 氨水 ( 北京化学试剂公司 )ꎻ T3ꎬ rt3 和 T4(Sigma 公司 )ꎻ T4 13 C 6 (Toronto Re search Chemicals Inc. )ꎮ 牛奶样品购自北京昌平回龙观地区超市 ꎮ 1. 2 溶液的配制分别称取 25 mg T3 rt3 和 T4ꎬ 2 5 mg T4 13 C 6 于 25 00 ml 容量瓶中 ꎬ 加 100 μl 氨水 ꎬ 用甲醇溶解并定容至刻度 ꎬ 得到 T3 rt3 T4 质量浓度均为 1 g / L 和 T4 13 C 6 质量浓度为 0 1 g / L 的单标准储备液 ꎮ 1 mg / L 的 T4 13 C 6 内标溶液用甲醇稀释储备液获得 ꎮ 移取适量体积的 T3 rt3 和 T4 单标准储备液用甲醇定容至 100 0 ml 容量瓶中 ꎬ 得到混合标准溶液 ꎮ 分别移取适量体积的混合标准溶液与固定体积的内标溶液混合 ꎬ 用甲醇 水 (3 2ꎬ v / v) 溶液稀释至适当浓度 ꎬ 得系列标准工作液 ꎮ 1. 3 样品处理 1. 3. 1 提取称取 5 g ( 约 5 ml) 牛奶样品于 50 ml 塑料离心管中 ꎬ 加入 25 μl 1 mg / L 的 T4 13 C 6 内标溶液 ꎬ 加入 15 ml 乙腈 ꎬ 摇匀 ꎬ 置于离心机中以 8 000 r / min 的转速离心 5 minꎬ 取上清液备用 ꎮ 1. 3. 2 固相萃取净化 Cleanert PAX 固相萃取小柱经 3 ml 甲醇和 3 ml 水活化后 ꎬ 上接 20 ml 大体积盛样管 ꎬ 关闭阀门 ꎬ 将 1 3 1 节所得上清液完全倾入大体积盛样管中 ꎬ 用移液枪注入 500 μl 氨水 ꎬ 静置 1 min 使其混合均匀 ꎬ 打开阀门和真空泵 ꎬ 在负压作用下 ꎬ 使样品提取液缓慢流过小柱 ꎬ 用 3 ml 甲醇清洗小柱并抽干 ꎬ 最后用 3 ml 甲酸 甲醇溶液 (1 49ꎬ v / v) 洗脱小柱 ꎬ 收集洗脱液于 5 ml 塑料离心管 ꎬ40 下氮气吹干 ꎬ 用 0 50 ml 甲醇 水溶液 (3 2ꎬ v / v) 复溶 ꎬ 待测 ꎮ 1. 4 色谱 质谱条件色谱条件 : Zorbax Eclipse XDB C18 色谱柱 (150 mm 2 1 mmꎬ 3 5 μm)ꎬ Zorbax Eclipse Plus C18 预柱 (12 5 mm 2 1 mmꎬ 5 μm)ꎮ 流动相为 0 1% ( v / v) 乙酸水溶液 甲醇 (37 63ꎬ v / v)ꎬ 流速为 0 3 ml / minꎬ 等度洗脱 10 minꎮ 进样体积
272 色谱第 31 卷 5 μlꎮ 质谱条件 : 电喷雾电离源正离子模式 ( ESI + )ꎬ 多反应离子监测 ( MRM) 方式检测 ꎬMRM 参数见表 1ꎮ 干燥氮气温度为 300 ꎬ 流速为 10 L / minꎻ 雾化气 压力 137 931 Pa(20 psi)ꎻ 喷雾毛细管电压 4 000 Vꎮ TH 表 1 TH 的多反应监测质谱参数 Table 1 MS parameters of multiple reaction monitoring (MRM) for TH Precursor ion (m / z) Product ion (m / z) Fragmentor voltage / V Collision energy / ev T3ꎬ rt3 652. 0 605. 5 145 25 478. 6 145 40 T4 777. 7 731. 7 165 25 604. 9 165 40 T4 13 C 6 784. 0 737. 9 165 25 quantitative ion. 2 结果与讨论 2. 1 色谱 质谱条件的确定 639. 4 165 25 由于 TH 分子中都含有相对较大的弱极性基 团 ꎬ 再通过酸性流动相抑制羧基电离造成的色谱峰 拖尾 ꎬ 因此容易实现 TH 在 C18 柱上的分离 ꎮ 本实验以甲醇 乙酸水溶液为流动相 ꎬ 通过等度洗脱 ꎬ 在 1 4 节条件下实现了对 T3ꎬ rt3 和 T4 的满意分离 ꎬ 实际样品按 1 3 节的方法处理后 ꎬ 没有观察到明显的离子抑制效应 ꎮ 图 1a 和图 1b 分别为混合标准溶液和牛奶样品溶液的 MRM 色谱图 ( 只给出了定量离子对 )ꎮ 采用质谱检测 T3ꎬ rt3 和 T4 时使用电喷雾源的正 负离子模式均可 ꎬ 但在本色谱条件下以正离子模式电离更灵敏 ꎬ 故选用 ESI + 模式检测 ꎮ TH 的 MRM 检测的优化参数如表 1 所示 ꎮ TH 的准分子离子 [M + H] + 的主要碎裂方式为脱甲酸 脱碘 脱氨 同时脱氨脱碘和同时脱甲酸脱碘等 ꎮ 当碰撞能较低时 ꎬ 主要碎裂方式为脱甲酸 ꎬT3 ( rt3) T4 和 T4 13 C 6 的子离子 m / z 606 m / z 732 和 m / z 738 有最高丰度 ꎬ 用作定量离子 ꎻ 随着碰撞能的增加 ꎬT3 (rt3) 和 T4 同时脱甲酸脱碘获得的子离子峰 m / z 478 6 和 604 9 增强 ꎬ 用作佐证离子 ꎻ 但随着碰撞能的增加 ꎬT4 13 C 6 的同时脱甲酸脱碘和同时脱氨脱碘峰都不明显 ꎬ 因此选择较低碰撞能时丰度较高的同 Fig. 1 图 1 (a) 混合标准溶液和 (b) 牛奶样品的 MRM 色谱图 MRM chromatograms of (a) a mixed standard solution of TH (4 μg / L for each) and T4 13 C 6 (50 μg / L) and (b) a milk sample solution 1. T4 13 C 6 ꎻ 2. T4ꎻ 3. T3ꎻ 4. rt3.
第 3 期王宗义 ꎬ 等 : 高效液相色谱 串联质谱检测牛奶中的甲状腺素 273 时脱氨脱碘获得的子离子 m / z 639 4 作佐证离子 ꎮ 2. 2 样品处理条件的选择 [8] 文献中使用乙醇 ( 加氨水碱化 ) 提取牛奶中 的 TH 进行酶联免疫吸附 ( ELISA) 检测 ꎬ 本文对比 考察了甲醇 乙腈和三氯乙酸作提取剂时的提取效 果 ꎮ 实验发现 ꎬ 三氯乙酸虽有较好的蛋白质沉淀效 果 ꎬ 提取液可直接使用 Cleanert PCX ( 聚合物填料 强阳离子交换型 ) 小柱净化 ꎬ 但不能对牛奶中的 TH 进行有效提取 ꎻ 使用乙腈能有效地对 TH 进行提取 ꎬ 且较甲醇 乙醇有更好的蛋白质沉淀效果 ꎬ 有利于后 续离心分离和净化 ꎻ 因此本实验选择乙腈作提取剂 ꎮ 在提取时加入少量氨水 ꎬ 目的是对 TH 进行负离子 化 ꎬ 提高其在提取液中的溶解度和为后续使用 Cleanert PAX 小柱进行阴离子交换固相萃取净化 做准备 ꎮ 但实验发现 ꎬ 用乙腈提取时 ꎬ 不加氨水对 TH 的提取效率无影响 ꎬ 加入氨水反而不利于离心 除蛋白质时溶液的分层 ꎮ 因此 ꎬ 适量氨水在乙腈提 取后加入 ꎮ 2. 3 检出限 定量限和线性关系 由于牛奶中的 TH 是一种内源性物质 ꎬ 很难获 得不含 TH 的空白试样用于检出限 定量限的评定 ꎮ 因此本实验在经净化处理使样品溶液基质效应被有 效消除的基础上 ꎬ 通过与系列浓度标准溶液对应色 谱峰进行比较 ꎬ 分别以 3 倍和 10 倍信噪比对检出限 和定量限进行了估计 ꎬ 确定样品溶液中 TH 的检出 限和定量限分别小于或等于 0 3 和 1 0 μg / Lꎻ 按本 实验的样品处理方法进行换算 ꎬ 则液态奶中 TH 的 检出限和定量限分别小于或等于 0 03 和 0 1 ng / gꎮ 考虑到样品溶液中 TH 的可能浓度 ꎬ 对 1 ~ 100 μg / L (T4 13 C 6 为 50 μg / L) 的质量浓度范围进行了线性 考察 ꎬ 结果表明线性关系良好 ꎬ 见表 2ꎮ 表 2 样品溶液中 TH 的线性方程和相关系数 (r 2 ) Table 2 Regression equations and correlation coefficients (r 2 ) of TH in the sample solution TH Regression equation r 2 T3 y = 0. 7751x - 0. 0154 0. 9989 rt3 y = 0. 4484x + 0. 0059 0. 9998 T4 y = 0. 4860x + 0. 0109 0. 9996 y is the peak area ratio of analyte to internal standardꎻ x is the content ratio of analyte to internal standard. The mass concentration of internal standard (T4 13 C 6 ) is 50 μg / L. 2. 4 回收率 精密度和稳定性 分别向 24 支离心管中加入 5 0 g 牛奶和 25 μl 1 mg / L 的 T4 13 C 6 内标溶液 ꎬ 然后分为 4 组 ꎬ 每组 6 支 ꎬ 以第一组为空白 ꎬ 分别向第二组的牛奶中加入 T3 rt3 和 T4 均为 20 μg / L 的混合标准溶液 50 μlꎬ 向第三组的牛奶中加入 T3 rt3 和 T4 均为 200 μg / L 的混合标准溶液 50 μlꎬ 向第四组的牛奶中加 入 T3 rt3 和 T4 均为 200 μg / L 的混合标准溶液 200 μlꎬ 获得 TH 添加质量浓度分别为 0 0 20 2 00 和 8 00 ng / g 的牛奶样本 ( 其中内标 T4 13 C 6 均为 5 00 ng / g)ꎮ 按 1 3 和 1 4 节的方法进行样品处理 和进样分析 ꎬ 内标校准曲线定量 ꎬ 结果见表 3ꎮ 表 3 牛奶中 TH 的加标回收率和相对标准偏差 (RSD) (n = 6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of TH in milk samples (n = 6) TH Background / Added / Found / Recovery / % RSD / % T3 0. 73 0. 20 0. 93 98. 41 9. 07 2. 00 2. 56 91. 32 6. 40 8. 00 8. 60 98. 35 3. 80 rt3 NF 0. 20 0. 16 80. 61 6. 56 2. 00 1. 99 99. 34 5. 66 8. 00 8. 13 101. 7 5. 40 T4 NF 0. 20 0. 19 93. 09 8. 40 NF: not found. 2. 00 1. 98 98. 61 1. 48 8. 00 8. 08 101. 0 1. 84 样品溶液于实验室室温放置 ꎬ 首次进样后 ꎬ 又分 别于 24 48 和 96 h 后重新进样分析 ꎬ 通过对峰面积 进行方差分析 ꎬ 结果显示在 0 24 48 和 96 h 进样 ꎬ 同一浓度水平样品的峰面积之间无显著差异 ( α = 0 05)ꎬ 说明 TH 在样品溶液中比较稳定 ꎮ 2. 5 实际样品的测定 应用本方法对市售 5 个品牌的鲜牛奶和纯牛奶 样品进行了测定 ( 见表 4)ꎮ 结果显示 ꎬ 鲜牛奶和纯 牛奶中 T3 含量为 0 59 ~ 1 30 ng / gꎬ RSD 为 2 06% ~ 7 70%ꎬ 鲜牛奶中 T3 含量明显高于纯牛奶 ꎻ 鲜牛奶和纯牛奶中未检出 rt3 和 T4ꎮ 表 4 市售牛奶中 TH 的测定结果 (n = 6) Table 4 Results of TH in milks from market (n = 6) Sample T4 and rt3 / T3 / RSD of T3 content / % Fresh milk 1 NF 1. 09 2. 06 Fresh milk 2 NF 1. 30 2. 88 Pure milk 1 NF 0. 59 7. 70 Pure milk 2 NF 0. 75 5. 91 Pure milk 3 NF 0. 73 4. 80 NF: not found. 3 结论 本文建立了高效液相色谱 串联质谱测定牛奶 中甲状腺素 T3 rt3 和 T4 的检测方法 ꎮ 该方法具 有样品处理简单 ꎬ 灵敏度高 ꎬ 重现性好 ꎬ 定性和定量 结果可靠等特点 ꎬ 为牛奶中甲状腺素的测定和相关 质量安全评价提供了可靠手段 ꎮ
274 色谱第 31 卷 参考文献 : [1] Moller Bꎬ Bjorkhem Iꎬ Falk Oꎬ et al. J Clin Endocrinol Metabꎬ 1983ꎬ 56(1): 30 [2] Strbák Vꎬ Macho Lꎬ Kovác Rꎬ et al. Endocrinol Expꎬ 1976ꎬ 10(3): 167 [3] Koldovsky Oꎬ Krulich Lꎬ Tenore Aꎬ et al. Biol Neonateꎬ 1980ꎬ 37(1 / 2): 103 [4] Slebodzinski A Bꎬ Gawecka A. Endocrinol Expꎬ 1983ꎬ 17 (3 / 4): 243 [5] Khazali Hꎬ Khajavi Mꎬ Rokni H. Anim Sci Jꎬ 2000ꎬ 71(5): 481 [6] Sun Y Mꎬ Lu Lꎬ Zhao Z Sꎬ et al. Heilongjiang Journal of Animal Science and Veterinary Medicine ( 孙延鸣 ꎬ 陆良 ꎬ 赵 宗胜 ꎬ 等. 黑龙江畜牧兽医 )ꎬ 2002(7): 18 [7] Zhang W Yꎬ Guo J. Chinese Journal of Control of Endemic Diseases ( 张雯艳 ꎬ 郭杰. 中国地方病防治杂志 )ꎬ 2010ꎬ 25 (2): 130 [8] Todini Lꎬ Malfatti Aꎬ Salimei Eꎬ et al. J Dairy Resꎬ 2010ꎬ 77: 419 [9] Wang Zꎬ Lv Mꎬ Li Dꎬ et al. Acta Chromatogrꎬ 2008ꎬ 20(1): 59 [10] Wang Zꎬ Yang Wꎬ Chang Bꎬ et al. Chromatographiaꎬ 2011ꎬ 73: 143 [11] Higashi Tꎬ Ichikawa Tꎬ Shimizu Cꎬ et al. J Chromatogr Bꎬ 2011ꎬ 879: 1013 [12] Soldin O Pꎬ Soldin S J. Clin Biochemꎬ 2011ꎬ 44: 89