应用与环境生物学报 2011,17 ( 6): 923~929 Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 2011-12-25 DOI: 103724/SPJ1145201100923 摘要 好氧反硝化菌及其在生物处理与修复中的应用研究进展 * 丁炜 1, 3 朱亮 1 徐京 1 冯丽娟 1 徐向阳 1, 2** ( 1 浙江大学环境工程系杭州 310058) ( 2 浙江大学 - 西澳大学水环境综合管理与保护联合研究中心杭州 310058) ( 3 中国石化集团上海工程有限公司上海 200120) Progress of Researches on Aerobic Denitrifiers and Their Application in Bioremediation * DING Wei 1, 3, ZHU Liang 1, XU Jing 1, FENG Lijuan 1 1, 2** & XU Xiangyang ( 1 Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) ( 2 ZJU-UWA Joint Centre in Integrated Water Management and Protection, Hangzhou 310058, China) ( 3 SINOPEC Shanghai Engineering Company Limited, Shanghai 200120, China) Abstract In recent years, researchers have focused on aerobic denitrifiers because of their outstanding growth characteristics and functions for simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification The isolated strains and their growth characteristics were reviewed in this paper, and the denitrification performance, influencing factors and action mechanisms were also summarized Furthermore, the application of aerobic denitrification in environmental bioremediation was discussed Researches demonstrate that aerobic denitrifiers have obvious technological advantage in nitrogen removal, but the mechanism and factors of aerobic denitrification require further study for its application in environmental bioremediation Fig 2, Tab 2, Ref 53 Keywords aerobic denitrifier; heterotrophic nitrification; biological nitrogen removal; environmental bioremediation CLC X172 好氧反硝化菌因其生长特性与同步异养硝化好氧反硝化功能, 为环境生物脱氮提供了崭新的技术思路 综述 了已分离获得的好氧反硝化菌类群及其生长特性, 重点阐述了好氧反硝化菌生物脱氮性能 影响因素与好氧反硝化 机理, 探讨了好氧反硝化在环境生物修复领域的应用 已有研究表明, 好氧反硝化菌在环境生物脱氮方面具有明显的 技术优势, 但有关好氧反硝化反应机理 影响因素等仍待解析, 以期为好氧反硝化菌固定化 活性持留以及受污染环 境水体修复等研究提供理论依据 图 2 表 1 参 53 关键词好氧反硝化菌 ; 异养硝化 ; 生物脱氮 ; 环境生物修复 CLC X172 随着工业和社会经济快速发展, 自然界的氮素平衡逐渐被打破, 不仅造成了严重的环境污染与经济损失, 甚至威胁到人类健康与生态安全 为此, 国内外研究者陆续发现生物脱氮具有高效 稳定等特点, 确立了传统的生物硝化反硝化理论 传统理论认为, 生物脱氮由两步反应协同完成 硝化反应与反硝化反应, 但每步反应均需要相应功能微生物及严格的环境条件 : 在好氧条件下, 自养细菌将氨氮转化为亚硝态 / 硝态氮 ; 随后在缺 / 厌氧条件下, 异养细菌将亚硝态 / 硝态氮进一步转化为气态产物脱除 其中, 研究者普遍认为只有在缺 / 厌氧条件下, 反硝化酶系才具有活性, 生物反硝化过 收稿日期 :2010-11-01 接受日期 :2010-12-01 国家科技支撑计划项目 (Nos 2006BAJ08B01,2010BAJ25B00) 和浙江省重大科技项目 (Nos 2008C13007,2008C13020) 资助 Supported by the National Key Technology R & D Program of China (Nos 2006BAJ08B01, 2010BAJ25B00),, and the Major Science and Technology Project of Zhejiang, China (Nos 2008C13007, 2008C13020) 通讯作者 Corresponding author (E-mail: xuxy@zjueducn) 程才能正常进行 [1] 然而,1980 年 Meiberg 等在 Hyphomicrobium X 氧化二甲胺 / 三甲胺过程发现, 该菌株在好氧条件下具有反硝化功能 [2] 随后,Robertson 等在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出一株好氧反硝化菌 Thiosphaera pantotropha( 现名脱氮副球菌 Paracoccus denitrificans), 该菌株在利用氨氮过程中未出现 明显的亚硝氮积累, 具有同步异养硝化与好氧反硝化功能 [3] 此后, 陆续有文献报道从不同及废水处理系统中分离筛选出大量具有好氧反硝化功能的微生物, 为同步硝化反硝化生物脱氮新技术奠定了基础 [4~11] 本文即综述了国内外已筛选分离的主要好氧反硝化菌类群及其生长特性, 重点阐述了好氧反硝化的作用机理 影响因素以及其在环境生物修复中的应用, 并对今后的研究与应用方向作了展望 1 分离获得的好氧反硝化菌主要类群 好氧反硝化菌 (Aerobic denitrifier) 是一类在有氧条件
924 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 17 卷 下利用周质硝酸盐还原酶 (Periplasmic nitrate reductase) 等好氧反硝化酶进行脱氮反应的异养微生物, 其分布广泛, 可适应多种生境, 多为好氧或兼性好氧 迄今为止, 已分离获得大量具有好氧反硝化功能的菌株 ( 表 1), 主要分属副球菌属 (Paracoccus) 假单胞菌属 (Pseudomonas) 产碱杆菌属 (Alcaligenes) 和芽孢杆菌属 (Bacillus) 等 目前, 研究报道较全面的菌种包括最早从废水脱硫和反硝化处理系统分离获得的 T pantotropha(p denitrificans) [3, 12], 从猪场养殖废水分离获得 可耐受 92% 高浓度氧分压的 Pseudomonas stutzeri SU2 [13~14], 从处理猪场废水活性污泥系统分离获得的 Alcaligenes faecalis No 4 [15~17], 以及从脱氮除磷活性污泥和 中均分离得到的 Microvirgula aerodenitrificans [18~19] 2 好氧反硝化菌的生长特性 与传统的反硝化细菌相比, 好氧反硝化菌具有以下生长特性 :1) 有氧生长, 大多数菌种可耐受 3 mg/l 以下的溶解氧, 部分菌种在高氧气分压下也具有反硝化活性, 少数可耐受 5~6 mg/l 溶解氧浓度 [13, 20~21] ( 表 1);2) 大多好氧反硝化菌同时具有异养硝化及代谢难降解有机物的能力 [3, 10, 15] ; 3) 生长周期短, 生长速率远大于自养菌 [22], 例如文献报道 Nitrosomonas europaea 的最大比增长速率约为 003~005 h -1, 而在同等生长条件下 T pantotropha 的最大比生长速率高达 04 h -1, 有效弥补了其异养脱氮活性相对较低的缺陷 [3] ;4) 环境 适应性强 (ph DO 等条件 ), 对高浓度有机物和氮的耐受力强 [15] ;5) 反硝化气态产物一般为氧化亚氮 (N 2 O), 少数为氮气 (N 2 ) [5] 3 好氧反硝化反应机理 为更好地阐明好氧反硝化过程机理及强化其脱氮过程的关键因子, 研究者分别从降解酶系统 电子呼吸链等角度对部分模式菌株进行了功能研究 [6, 32, 35] 从两种反硝化菌的酶系统考虑, 研究者分析发现整个反硝化过程涉及到 4 种还原酶, 分别为硝酸盐还原酶 (Nitrate reductase,nar) 亚硝酸盐还原酶 (Nitrite reductase,nir) 一氧化氮还原酶 (Nitric-oxide reductase,nor) 和一氧化二氮还原酶 (Nitrous-oxide reductase,nos) [36] 相比厌氧反硝化菌, 好氧反硝化菌的细胞内存在不受溶解氧抑制的反硝化酶系统 ( 图 1) 研究表明菌株的好氧反硝化能力与其特殊硝酸盐还原酶的表达密切相关 硝酸盐还原酶 (Nar) 具有两种不同的形式 : 一种是膜结合硝酸盐还原酶 (Membrane-bound nitrate reductase,m-nar), 它在厌氧环境优先表达, 但对氧 分子敏感, 有氧条件下其活性易受抑制 ; 另一种周质硝酸盐还原酶 (Periplasmic nitrate reductase,p-nar) 则具有较强的耐氧能力 [6, 9] 从电子呼吸链角度来看,Robertson 等研究认为厌氧反硝化时电子在向氧原子传递的过程中存在 瓶颈 ( 图 1), 而在好氧反硝化过程电子可在细胞色素 c(cyt c) 和细胞色素 aa3(cyt aa3) 传递从而解除氧气对反硝化电子呼吸链途径的抑制, 使得过剩的还原力通过周质硝酸盐还原酶传递给硝酸盐 (NO 3- ), 将其还原为亚硝酸盐 (NO 2- ) [3] 此外,T pantotropha 可诱导或使用额外的细胞色素, 则电子同时在多 条细胞色素支链流动, 从而打破 瓶颈, 使其可在不同底物 条件下生长增殖 [3] Kong 等提出好氧反硝化菌中可能存在一 种能以醌氢类 (QH 2 ) 为电子供体 不受氧分子抑制的硝酸 盐还原酶 (Oxygen resisted nitrate reduetase,ornar), 以及一 种以细胞色素 bc1(cyt bc1) 为电子供体且不受氧分子抑制的 亚硝酸盐还原酶 (Oxygen resisted nitrite reductase,ornir), 从 而在有氧条件下可将醌类的电子传递给硝酸盐分子将其还 原, 同时接受 Cyt bc1 的电子生成 NOx 完成整个呼吸过程 [6, 37] 此外,Chen 等从电子分配角度研究了 Pseudomonas aeruginosa 好氧反硝化过程电子受体 氧和硝酸根的竞争影响, 发 现反硝化过程接收每个电子的能量得率是氧气呼吸途径的 69% [35] 只有在较低溶解氧条件下 (<005 mg/l), 增大溶解 氧方能促进有氧呼吸, 溶解氧的增大只微弱增强其对反硝化 的抑制, 厌氧时菌株的表观细胞得率明显减小, 缺少 NO 3 - 或 O 2 都会降低其生长率和反硝化率 [32, 35] 可见, 好氧反硝化菌包含两种硝酸盐还原酶, 反硝化和 有氧呼吸系统并存,NO 3 - 和 O 2 同时被还原, 反硝化作用则可 能以电子受体的角色与有氧呼吸形成辅助或竞争关系 [15, 38, 39] 明 晰了好氧反硝化过程途径及机理, 有助于我们从酶系统 电子呼吸链及基因角度, 优化获得更高效的好氧反硝化菌 筛选方法 现有文献报道的好氧反硝化菌的筛选方法主要 有施加一定选择压 ( 如间歇曝气 ) 或采用选择性培养基驯 化富集, 而高效的菌种筛选方法是微生物强化技术应用的 关键 [4, 8] Carter 等依据周质及膜结合硝酸盐还原酶生化特 性的严格区别, 利用还原性甲级紫精 (MV+) 和还原性苯甲 基紫精 (BV+) 分别作为电子供体, 以区分周质和细胞质中 硝酸盐还原酶的活性位点, 采用此种方法在 4 种中 筛选到多种好氧反硝化功能微生物 [9] 孔庆鑫等利用氰化钾 (KCN) 作为呼吸抑制剂, 终止呼吸链中电子由细胞色素 aa3 (Cytaa3) 向氧的传递, 从而抑制氧作为电子受体的呼吸反 应, 同时结合曝气状态下氧分子对相关酶的表达或活性的 抑制, 使好氧反硝化菌更易被选择性筛选 [6, 37] 4 异养硝化 好氧反硝化同步偶联 好氧反硝化系统的存在, 使得反硝化菌与硝化菌能够同 时生长于好氧环境, 在单一构筑物内即可实现同步硝化反硝 化, 大大节省了工程投资, 并在系统碱度维持等方面更具经 济性 不仅如此, 陆续有研究者发现某些好氧反硝化菌同时 具有异养硝化功能, 即在有机物存在下通过不同酶系的协同 作用完成硝化与反硝化两个过程, 将氨氮直接转化为气态产 物去除 ( 图 2), 单一微生物即可完成脱氮过程 [3, 33~34] Richardson 等研究认为同步异养硝化 好氧反硝化的脱 氮机理为 : 在好氧环境下, 菌体利用氨单加氧酶 (AMO) 将 氨氮氧化为羟胺, 进而在异养硝化菌特有的不含血红素的羟 胺氧化酶 (HAO) 作用下转化为亚硝酸盐或 N 2 O; 同时, 体系 中的硝酸盐在周质硝酸盐还原酶 (NAP) 等的作用下转变为 亚硝酸盐, 最终转化为 N 2 O 或 N 2 脱除 [40~42] 但这并不是此类细 菌同步异养脱氮的唯一途径 对 Alcaligenes faecalis no 4 的研 究发现, 只有很少的氨氮转化成亚硝氮, 主要的反硝化是通 过氨氧化而成的羟胺脱除, 反应终产物 90% 为氮气 (N 2 ) [15]
6 期丁炜等 : 好氧反硝化菌及其在生物处理与修复中的应用研究进展 925 副球菌属 Paracoccus 假单胞菌属 Pseudomonas 产碱杆菌属 Alcaligenes 芽孢杆菌属 Bacillus Microvirgula 丛毛单胞菌属 Comamonas 陶厄氏菌属 Thauera 柠檬酸菌属 Citrobacter 草螺菌属 Herbaspirillum 硫杆菌属 Thiobacillus 苍白杆菌属 Ochrobactrum 肠杆菌属 Enterobacter 单胞菌属 Sphingomonas Diaphorobacter 代尔夫特菌属 Delftia 普罗维登斯菌属 Providencia 种属 Bacterial species 泛养硫球菌 ( 脱氮副球菌 ) Thiosphaera pantotropha (Paracoccus denitrificans) 表 1 已分离好氧反硝化菌来源及生长环境 Table 1 The source and growth condition of the isolated aerobic denitrifiers 来源 Source 脱硫反硝化系统 Desulfurization and denitrification system 好氧环境 Oxic condition 碳氮比 C/N 年份 Year [3, 12] 30%~80% c - 1983 Paracoccus sp 0~75 a - 2000 [4] 施氏假单胞菌猪场废水处理系统 [14, 23] 92% d - 2001 Pseudomonas stutzeri SU2 Piggery wastewater treatment system Pseudomonas stutzeri TR2 稻田 污水厂 土壤 Rice ponds, domestic wastewater, soil 39 b 24 2003 [5] Pseudomonas stutzeri G3 活性污泥 Activated sludge 40±10 a 3 2008 [24] 恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida 活性污泥 Activated sludge 22~61 a 9~18 2007 [8] Pseudomonas putida AD-21 土壤 Soil 50~60 a 8 2008 [21] Pseudonocardia ammonioxydans H9T 海岸沉积物 Coastal sediments 05~15 a 6~12 2008 [25] 产碱假单胞菌 Pseudomonas alcaligenes AS-1 猪场废水处理系统 Piggery wastewater treatment system [13, 23] 92% d - 2001 Pseudomonas chloritidismutan X31 活性污泥 Activated sludge - - 2006 [26] Pseudomonas sp K50 稻田 污水厂 土壤 Rice ponds, domestic wastewater, soil 39 b 24 2003 [5] Pseudomonas spc3 活性污泥 Activated sludge 8~10 a 55~60 2007 [27] Pseudomonas spzw2 生物陶粒反应器 Bio-ceramic media reactor - - 2009 [28] 反硝化产碱菌 Alcaligenes denitrificans T25 稻田沉积物 Paddy sediments 2~4 a - 1999 [11] Alcaligenes strain P5 活性污泥 Activatedsludge 2% d - 2001 [29] 粪产碱杆菌 Alcaligenes faecalis No 4, Alcaligenes faecalis L1 Alcaligenes faecalis ZW5 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 活性污泥 Activated sludge - 8~10 2005 [15~17] 生物陶粒反应器 Bio-ceramic media reactor 粪便处理系统 Night soil treatment system - - 2009 [28] 30% d 8 2005 [10] Bacillus spw2 鱼塘 Fish pond 2 a - 2005 [30] Microvirgula aerodenitrificans 活性污泥 Activated sludge - - 1998 [18~19] M aerodenitrificans Comamonas 睾丸酮丛毛单胞菌 Comamonas testosteroni Thauera rnechernichensis sp nov 异型枸橼酸杆菌 Citrobacter diversus Herbaspirillum sp Thiobacillus sp 人苍白杆菌 Ochrobactrum anthropi T23 Enterobacter sp Sphingomonas sp Diaphorobacter sp Delftia tsuruhatensis 雷氏普罗威登斯菌 Providencia rettgeri YL 0~75 a - 2000 [4] 0~75 a - 2000 [4] 活性污泥 Activatedsludge 22~61 a 9~18 2007 [8] 垃圾渗滤液处理系统 Landfill leachate treatment system 猪场废水处理系统 Piggery wastewater treatment system - - 1999 [31] 2~6 a 4~5 2001 [32] 活性污泥 Activatedsludge 22~61 a 9~18 2007 [8] 稻田沉积物 Paddy sediments 染料废水处理系统 Dye wastewater treatment system 0~75 a - 2000 [4] 2~4 a - 1999 [11] 0~75 a - 2000 [4] 0~75 a - 2000 [4] - 8 2007 [33] 活性污泥 Activatedsludge 22~61 a 9~18 2007 [8] 膜生物反应器 (MBR) 10 a 10 2005 [34] a: 溶解氧浓度 ;b: 溶解氧浓度 ;c: 空气饱和程度 ;d: 氧气饱和程度 ;-: 不详 a: Concentration of oxygen (ρ/mg L -1 ); b: Concentration of oxygen (c/μmol L -1 ); c: Air saturation level; d: Oxygen saturation level; -: Not clear
926 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 17 卷 [6, 32, 35] 图 1 好氧反硝化菌的反硝化作用过程及途径 ( 呼吸瓶颈, 氧抑制 ) [6, 32, 35] Fig 1 Denitrification progress and pathway of aerobic denitrifiers (the bottleneck, inhibition by O 2 ) 分离得到的 Acinetobacter spyy-5 并不能发生好氧反硝化, 但能在 3 d 内将氨氮由 9523 mg/l 降解至 129 mg/l, 降解率达到 986%, 同时未发现亚硝酸盐氮 硝酸盐氮积累, 其主要代 [41] 谢气体产物为 CO 2 和 N 2, 无 N 2 O 生成 最近报道的异养硝化菌 Acinetobacter calcoaceticus HNR 在整个脱氮过程中并无亚硝酸盐及硝酸盐的产生, 该菌株不能利用硝酸盐及亚硝酸盐, 系统内检测不到硝酸盐还原酶 (Nar) 和亚硝酸盐还原酶 (Nir), 氨单加氧酶 (AMO) 羟胺氧化酶 (HAO) 在该类菌 [22] 种利用羟胺直接脱除氨氮的过程中可能发挥重要作用 此外, 菌株 Alcaligenes faecalis no 4 在不同培养条件下均有约 40%~50% 的氨氮去除率, 其中至少一半转化为细胞内的 [15] 氮储存 Kim 等发现 Pseudomonas putida AD-21 的培养体系中氨氮主要同化为谷氨酸盐被菌体吸收, 而硝氮进行反硝化 [21] 脱除 这些研究表明氨氮主要作为氮源供菌体生长, 硝酸盐进行反硝化, 同时氨氮的存在能促进细胞生长和反硝化生 [20] 成 N 2, 防止 N 2 O 的积累 5 影响因素 图 2 同步异养硝化好氧反硝化作用过程 [40~42] Fig 2 Process of simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification [40~42] 在废水生物处理系统中, 溶解氧 (Dissolved oxygen, DO) 碳氮比 (C/N) 温度和 ph 是影响生物反应速率的主要 因素 [32, 43], 如系统 DO 水平直接影响反硝化有氧呼吸 [15, 38~39], 进水碳氮比 (C/N) 则关系到碳源利用效率和细胞生长 [32, 44] 51 溶解氧 (DO) 如前所述, 反硝化过程涉及到 4 种反硝化酶, 其合成和活性均受溶解氧的控制, 其中硝酸盐还原酶的耐氧能力最强, 而 N 2 O 和 / 或 NO 的生成几乎可被溶解氧完全抑制, 研究证实一氧化二氮还原酶 (Nos) 的溶解氧抑制浓度低于 02 mg/ L, 硝酸盐还原酶在 DO 高于 4 mg/l 时受到抑制 [32, 45] 因此, DO 浓度影响反应终产物的生成 低溶氧条件下, 硝酸盐还原 酶的活性较低, 会导致细胞生长率和反硝化率降低, 硝酸盐还原酶则处于休眠状态, 但有利于 N 2 生成 [10, 32] 高溶解氧条件下, 聚 -β- 羟基丁酸 (Poly-β-hydroxybutyrate,PHB) 得以积累利于快速脱氮, 较易发生同步硝化反硝化 (SND) [43] 但也有研究者认为好氧反硝化作用的启动并不依赖于相关酶系对氧气的敏感程度, 而是与调控转录水平的氧气或氧化还原 的敏感因子有关 [46] 通常筛选分离到的好氧反硝化菌具有一定的溶解氧阈值, 当 DO 浓度高于该值时对该菌种的反硝化效果有抑制作用 如表 1 所示, 大多数好氧反硝化菌可耐受 3 mg/l 以下的溶解氧, 部分菌种在高氧气分压下仍具有反硝化活性, 可耐受 5~6 mg/l 溶解氧 [20~21] 对 Pseudomonas sp C3 的研究表明, 溶 解氧对反硝化基本没有抑制作用, 在 DO 为 23~113 mg/l 范围内, 该菌株都可以选择硝酸盐作电子受体 [27] 上述好氧菌株的发现更利于好氧反硝化优势的体现 同时研究表明, 多数好氧反硝化细菌属兼性细菌, 可同时表达周质及膜结合硝酸盐还原酶活性, 因此周期性好氧 / 厌氧环境交替有利于其富集成为优势菌 [8, 14] Patureau 等研 究发现施加一定的选择压 ( 间歇曝气 ) 进行驯化, 好氧反硝化菌可得到有效富集 对溶解氧转变的适应性使其能更好应用于溶解氧波动的情况下, 消除过剩还原性物质 [4] 好氧菌株反硝化相关酶系的永久表达避免了普通反硝化菌在一段缺氧后重新诱导, 对曝气条件变化能快速适应, 具有很好应用潜力 52 碳源种类及碳氮比 (C/N) 有机碳源在整个脱氮过程中发挥重要作用 研究表明, 好氧反硝化菌可利用碳源范围较广, 包括某些难降解有机物 [29, 33] 在对有限资源进行竞争时, 混合营养 (Mixotrophy) 是决定菌种能否在竞争中取胜的重要因子, 代谢的灵活性和反应性在物种竞争中也占有重要作用 [47] 因此, 可利用基质的多样性使得好氧反硝化菌在系统中具备一定竞争优势 有关文献报道中, 研究 C/N 对好氧反硝化菌影响的范围较广, 在 2~24 之间 ( 表 1) 有研究表明 C/N 在 2~12 之间,C/N 越大则反硝化效果越好 [25] 分析其原因, 高 C/N 能够保证充足的碳源使反硝化作用更彻底, 同时周质硝酸盐还原酶的基因调控蛋白 FNR 对氧化还原反应敏感, 相对较高的 C/N 激活了好氧反硝化菌相关反硝化基因的表达 [15] 而低 C/N 时, 碳源快速消耗, 会造成硝化与反硝化之间的不均衡 [44] 另有部分研究结果显示, 对特定菌株, 在较小范围内即存在最佳 C/N 值, 此时的碳源浓度刚好能诱导足够反硝化酶, 继续增加碳源其反硝化活性不会继续增大 [15, 21, 27] 如 Huang 等认为在 1~7 范围
6 期丁炜等 : 好氧反硝化菌及其在生物处理与修复中的应用研究进展 927 内,C/N 值为 5 是 Citrobacter diversus 的最适碳氮比, 高 C/N 下 总体氮去除率增加但大多用于菌体合成而被消耗 [32] Bernat 等研究证实在好氧条件下的活性污泥可利用细胞内 PHB 做 唯一碳源进行反硝化, 外加乙酸盐作为碳源时, 其好氧反硝 化活性得到明显提升 [32, 43] 对细胞内碳源的有效利用, 为低 碳氮比废水的有效处理也提供了一条新的途径 研究筛选 适宜低 C/N 的好氧反硝化菌种, 可针对特定水质发挥其应用 优势 53 其它影响因素对 Pseudomonas sp C3 的好氧反硝化性能的研究发现, ph 值对其反硝化能力影响显著 [27] 不同 ph 值下, 反硝化效 能不同 在中性及偏碱 (ph 7~9) 的条件菌株 C3 有较好的反 硝化效果 ( 脱氮率 59%~93%), 但在酸性 (ph 6) 和强碱性 (ph 10) 的条件下, 菌株生长状况差, 对硝酸盐基本没有多 少去除 研究表明 ph 对土壤中 Paracoccus denitrificans NOx 还 原酶基因的表达及反硝化作用模式有较大影响, 在 ph 6~75 的范围内, 次佳 ph 条件会抑制 N 2 O 的还原, 抑制发生在相关 蛋白的合成 / 装配而非转运过程 [48] 温度对菌株 Pseudomonas sp C3 的反硝化效率的影响并不显著, 在 25~35 的温度范围 内, 该菌株都具有很高的脱氮效率 [27] 对菌株 Pseudomonas chloritidismutan X31 的研究结果类似 [49] 相对较宽的 ph 和温 度范围有利于好氧反硝化菌在环境中的竞争与存活, 发挥其 反硝化能力 此外, 某些金属离子 ( 如二价铁离子 Fe 2+ ) 的加入可显著 提高菌体对 NH 4 + 和 NO 3 - 的利用效率 [20] Kim 等的研究也表明 Ca 2+ Fe 2+ 和 Mg 2+ 等金属离子子对 Bacillus sp 的生长和脱氮效 率有较大影响 [10] 6 好氧反硝化菌在环境生物修复中的应用 作为生物脱氮新技术之一的好氧反硝化, 其与传统的 细菌厌氧反硝化相比具有如下优势 : 好氧反硝化菌生长速 度快 产量高, 大多具有同步异养硝化性能, 可在同一个系 统内完成脱氮过程, 大大减少了碱度投加量及构筑物占地面 积, 具有较好的经济性 同时, 多数好氧反硝化菌适应性较 强, 对 DO 浓度要求较低, 反硝化速度快且彻底, 在环境生物 修复系统运行中更容易被调控 相比而言, 传统自养硝化细 菌生长率低, 普通反硝化菌对环境因素变化敏感, 维持足够 菌体数量较难 目前, 好氧反硝化菌主要应用于废水生物处 理 养殖水体净化等领域 61 废水生物处理 Pai 等将筛选到的好氧反硝化菌种与活性污泥混合后处 理污水, 取得了很好的强化效果 [11] Bouchez 等采用海藻酸包 埋技术成功将 Microvirgula aerodenitrificans 接种于连续流反 应器 (CSTR) 进行城镇污水处理, 菌体可在反应絮体中有效 持留 [50] Gupta 等采用 T pantotropha 强化的三阶旋转生物接触 器 (Rotating biological contactor,rbc) 处理受高硝氮受污染 地下水, 该系统无需单独碳氧化调控来强化硝化反硝化效 果, 反硝化过程的碱度补偿经济性大幅提升 [51] 马放等利用 好氧反硝化菌群强化生物陶粒反应器处理高浓度含硝氮废 水, 系统稳定运行后硝氮平均去除率可达 93% 以上,COD 的 平均去除率稳定在 98%, 变形梯度凝胶电泳 (DGGE) 分析发 现好氧反硝化菌在整个运行阶段稳定存在 [26, 52] Patureau 等将 Microvirgula aerodenitrificans 用于除磷系 统强化, 并对投加策略与菌体持留进行了研究, 结果表明初 始碳源的添加与菌体加入量的控制起了关键作用 [18] Barak 等 研究了有氧条件下 Pseudomonas denitrificans 细胞内聚磷酸盐 (Polyphosphate) 的生成情况, 发现其具有以氧气和硝酸盐 作为电子受体合成聚磷酸盐进行脱氮, 同时去除磷酸盐和硝 酸盐的能力 [53] 同时, 不少研究表明好氧反硝化菌具有难降解有机物 分解能力 Khardenavis 等从处理染料及氮杂环类污水的活性 污泥中分离得到多株具有同步硝化反硝化的 Diaphorobacter sp [33] Seung 等分离的好氧菌株 Alcaligenes P5 能以苯酚为有 机碳源进行反硝化脱氮, 完成苯酚和硝态氮的同步去除 [29] 62 养殖废水净化于爱茸等将好氧反硝化菌 Bacillus sp W2 用于水产养殖 废水处理, 发现 0067 hm 2 鱼塘投入 l kg 该菌液即可实现养殖 水体完全脱氮 [30] Joo 等将 Alcaligenes faecalis No 4 应用于含 高浓度有机物及氨氮的猪场废水的处理, 其氨氮去除率高达 30 mg L -1 h -1, 去除的氨氮中至少 65% 进行了反硝化, 而普通自 养细菌很难在此类废水处理中应用, 并且生长缓慢, 需要更 长的处理时间 [17] 7 存在问题及展望 众多研究表明, 好氧反硝化菌在环境生物脱氮方面具 有技术优势与应用潜力, 但现有研究与实际应用仍有较大差 距, 有关好氧反硝化反应机理 影响因素等仍待解析 为此, 建议在以下几方面进一步开展好氧反硝化研究 :1) 反硝化过 程中产生的温室气体 N 2 O 一直是水处理领域研究者关注的重 点, 目前多数好氧反硝化菌的反硝化终产物同样以 N 2 O 为主, 因此有必要筛选高效 耐高溶氧 反硝化产物以 N 2 为主的好 氧反硝化菌株, 以提升其应用的技术可行性 ;2) 研究表明好 氧反硝化菌在自然环境中广泛存在, 其耐氧适应性强 可利 用碳源范围广, 在自然水体生物修复方面极具应用潜力 ; 然 而, 目前有关好氧反硝化菌的研究主要集中于高浓度废水生 物处理系统, 有必要进一步开展好氧反硝化菌固定化 活性 持留以及受污染自然水体修复等研究 Reference 1 Ahn YH Sustainable nitrogen elimination biotechnologies: A review Process Biochem, 2006, 41 (8): 1709~1721 2 Meiberg JBM, Bruinenberg PM, Harder W Effect of dissolved-oxygen tension on the metabolism of methylated amines in Hyphomicrobium X in the absence and presence of nitrate-evidence for aerobic denitrification J Gen Microbiol, 1980, 120 (10): 453~463 3 Rober tson LA, Va n n iel EWJ, Tor remans R A M, Kuenen JG Simultaneous nitrification and denitrification in aerobic chemostat cultures of Thiosphaera pantotropha Appl Environ Microbiol, 1988, 54 (11): 2812~2818 4 Patureau D, Zumstein E, Delgenes JP, Moletta R Aerobic denitrifiers
928 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 17 卷 isolated from diverse natural and managed ecosystems Microb Ecol, 2000, 39 (2): 145~152 5 Takaya N, Catalan-Sakairi MAB, Sakaguchi Y, Kato I, Zhou ZM, Shoun H Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide Appl Environ Microbiol, 2003, 69 (6): 3152~3157 6 Kong QX, Wang XW, Jin M, Shen ZQ, Li JW Development and application of a novel and effective screening method for aerobic denitrifying bacteria FEMS Microbiol Lett, 2006, 260 (2): 150~155 7 Su JJ, Liu BY, Chang YC Identifying an interfering factor on chemical oxygen demand (COD) determination in piggery wastewater and eliminating the factor by an indigenous Pseudomonas stutzeri strain Lett Appl Microbiol, 2001, 33 (6): 440~444 8 Wang P, Li XT, Xiang MF, Zhai Q Characterization of efficient aerobic denitrifiers isolated from two different sequencing batch reactors by 16S-rRNA analysis J Biosci Bioeng, 2007, 103 (6): 563~567 9 Carter JP, Hsiao YS, Spiro S, Richardson DJ Soil and sediment bacteria capable of aerobic nitrate respiration Appl Environ Microbiol, 1995, 61 (8): 2852~2858 10 Kim JK, Park KJ, Cho KS, Nam SW, Park TJ, Bajpai R Aerobic nitrification-denitrification by heterotrophic Bacillus strains Bioresour Technol, 2005, 96 (17): 1897~1906 11 Pai SL, Chong NM, Chen CH Potential applications of aerobic denitrifying bacteria as bioagents in wastewater treatment Bioresour Technol, 1999, 68 (2): 179~185 12 Robertson LA, Kuenen JG Thiosphaera pantotropha gen nov sp nov, a facultatively anaerobic, facultatively autotrophic sulfur bacterium J Gen Microbiol, 1983, 129: 2847~2855 13 Su JJ, Liu BY, Lin J, Yang CP Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain NS-2 from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in Taiwan possessing denitrification under 92% oxygen atmosphere J Appl Microbiol, 2001, 91 (5): 853~860 14 Su JJ, Liu BY, Liu CY Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere by Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newly isolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatment system J Appl Microbiol, 2001, 90 (3): 457~462 15 Joo HS, Hirai M, Shoda M Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis no 4 J Biosci Bioeng, 2005, 100 (2): 184~191 16 Joo HS, Hirai M, Shoda M Improvement in ammonium removal efficiency in wastewater treatment by mixed culture of Alcaligenes faecalis no 4 and L1 J Biosci Bioeng, 2007, 103 (1): 66~73 17 Joo HS, Hirai M, Shoda M Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis strain No 4 with heterotrophic nitrification and aerobic denitrification Water Res, 2006, 40 (16): 3029~3036 18 Patureau D, Helloin E, Rustrian E, Bouchez T, Delgenes JP, Moletta R Combined phosphate and nitrogen removal in a sequencing batch reactor using the aerobic denitrifier, Microvirgula aerodenitrificans Water Res, 2001, 35 (1): 189~197 19 Patureau D, Godon JJ, Dabert P, Bouchez T, Bernet N, Delgenes JP, Moletta R Microvirgula aerodenitrificans gen nov, sp nov, a new Gram-negative bacterium exhibiting co-respiration of oxygen and nitrogen oxides up to oxygen-saturated conditions Int J Syst Bacteriol, 1998, 48: 775~782 20 Zhou Q, Takenaka S, Murakami S, Seesuriyachan P, Kuntiya A, Aoki K Screening and characterization of bacteria that can utilize ammonium and nitrate ions simultaneously under controlled cultural conditions J Biosci Bioeng, 2007, 103 (2): 185~191 21 Kim M, Jeong SY, Yoon SJ, Cho SJ, Kim YH, Kim MJ, Ryu EY, Lee SJ Aerobic Denitrification of Pseudomonas putida AD-21 at different C/N Ratios J Biosci Bioeng, 2008, 106 (5): 498~502 22 Zhao B, He YL, Hughes J, Zhang XF Heterotrophic nitrogen removal by a newly isolated Acinetobacter calcoaceticus HNR Bioresour Technol, 2010, 101 (14): 5194~5200 23 Su JJ, Yeh KS, Tseng PW A strain of Pseudomonas sp isolated from piggery wastewater treatment systems with heterotrophic nitrification capability in Taiwan Curr Microbiol, 2006, 53 (1): 77~81 24 Yang JX ( 杨基先 ), Gao SS ( 高珊珊 ), Ma F ( 马放 ), Su JF ( 苏俊峰 ), Wang Q ( 王强 ) Identification and phylogenetic analysis of an isolated aerobic denitrifier Acta Sci Circumst ( 环境科学学报 ), 2008, 28 (7): 1302~1307 25 Ahmad NUD, Xu HY, Chen LP, Liu ZP, Liu SJ Enhanced biological nutrient removal by the alliance of a heterotrophic nitrifying strain with a nitrogen removing ecosystem J Environ Sci, 2008, 20 (2): 216~223 26 Wang HY ( 王弘宇 ), Ma F ( 马放 ), Su JF ( 苏俊峰 ), Zuo W ( 左薇 ), Zhang J ( 张佳 ), Zhang XX ( 张献旭 ) Aerobic denitrification of nitrate wastewater and changes of microbial community structure in a bioceramic reactor Environ Sci ( 环境科学 ), 2007, 28 (12): 2856~2860 27 Wang HY ( 王弘宇 ), Ma F ( 马放 ), Su JF ( 苏俊峰 ), Zuo W ( 左薇 ), Zhang XX ( 张献旭 ), Zhang J ( 张佳 ) Identification and characterizafion of a bacterial strain C3 capable of aerobic denitrification Environ Sci ( 环境科学 ), 2007, 28 (7): 1548~1552 28 Wang HY ( 王弘宇 ), Ma F ( 马放 ), Yang K ( 杨开 ), Wei L ( 魏利 ), Su JF ( 苏俊峰 ), Zhang XX ( 张献旭 ) Ammonia removal by two strains of heterotrophic nitrifying bacteria China Environ Sci ( 中国环境科学 ), 2009, 29 (1): 47~52 29 Baek SH, Yin CR, Lee ST Aerobic nitrate respiration by a newly isolated phenol-degrading bacterium, Alcaligenes strain P5 Biotechnol Lett, 2001, 23 (8): 627~630 30 Yu AR ( 于爱茸 ), Li Y ( 李尤 ), Yu JA ( 俞吉安 ) Denitrification of a newly isolated Bacillus strain W2 and its application in aquaculture J Microbiol ( 微生物学杂志 ), 2005, 25 (3): 77~81 31 Scholten E, Lukow T, Auling G, Kroppenstedt RM, Rainey FA, Diekmann H Thauera mechernichensis sp nov, an aerobic denitrifier from a leachate treatment plant Int J Syst Bacteriol, 1999, 49: 1045~1051 32 Huang HK, Tseng SK Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment Appl Microbiol & Biotechnol, 2001, 55 (1): 90~94 33 Khardenavis AA, Kapley A, Purohit HJ Simultaneous nitrification and denitrification by diverse Diaphorobacter sp Appl Microbiol
6 期丁炜等 : 好氧反硝化菌及其在生物处理与修复中的应用研究进展 929 Biotechnol, 2007, 77 (2): 403~409 34 Taylor SM, He YL, Zhao B, Huang J Heterotrophic ammonium removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium, Providencia rettgeri YL J Environ Sci, 2009, 21 (10): 1336~1341 35 Chen F, Xia Q, Ju LK Competition between oxygen and nitrate respirations in continuous culture of Pseudomonas aeruginosa performing aerobic denitrification Biotechnol Bioeng, 2006, 93 (6): 1069~1078 36 Zheng P ( 郑平 ), Xu XY ( 徐向阳 ), Hu BL ( 胡宝兰 ) New Theory and Technology for N Removal in Sewage Beijing, China: Science Press ( 北京 : 科学出版社 ), 2004 37 Kong QX ( 孔庆鑫 ), Li JW ( 李君文 ), Wang XW ( 王新为 ), Jin M ( 金敏 ), Gu CQ ( 古长庆 ) A new screening method for aerobic denitrification bacterial and isolation of a novel strain Chin J Appl Environ Biol ( 应用与环境生物学报 ), 2005, 11 (2): 222~225 38 Patureau D, Bernet N, Delgenes JP, Moletta R Effect of dissolved oxygen and carbon-nitrogen loads on denitrification by an aerobic consortium Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 54 (4): 535~542 39 Chen F, Xia Q, Ju LK Aerobic denitrification of Pseudomonas aeruginosa monitored by online NAD(P)H fluorescence Appl Environ Microbiol, 2003, 69 (11): 6715~6722 40 Otte S, Schalk J, Kuenen JG, Jetten MSM Hydroxylamine oxidation and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic ammonia oxidizer Alcaligenes faecalis Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 51 (2): 255~261 41 Jin M ( 金敏 ), Wang JF ( 王景峰 ), Kong QX ( 孔庆鑫 ), Zhao ZG ( 赵祖国 ), Wang XW ( 王新为 ), Shen ZQ ( 谌志强 ), Chen ZL ( 陈照立 ), Qiu ZG ( 邱志刚 ), Li JW ( 李君文 ) Isolation and denitrification mechanism of an aerobic heterotrophic bacterium Acinetobacter sp YY-5 Chin J Appl Environ Biol ( 应用与环境生物学报 ), 2009, 15 (5): 692~697 42 Richardson DJ, Wehrfritz JM, Keech A, Crossman LC, Roldan MD, Sears HJ, Butler CS, Reilly A, Moir JWB, Berks BC, Ferguson SJ, Thomson AJ, Spiro S The diversity of redox proteins involved in bacterial heterotrophic nitrification and aerobic denitrification Biochem Soc Trans, 1998, 26 (3): 401~408 43 Bernat K, Wojnowska-Baryla I Carbon source in aerobic denitrification Biochem Eng J, 2007, 36 (2): 116~122 44 Chiu YC, Lee LL, Chang CN, Chao AC Control of carbon and ammonium ratio for simultaneous nitrification and denitrification in a sequencing batch bioreactor Int Biodeter Biodegr, 2007, 59 (1): 1~7 45 Kumar M, Lin JG Co-existence of anammox and denitrification for simultaneous nitrogen and carbon removal-strategies and issues J Hazard Mat, 2010, 178 (1~3): 1~9 46 Schmidt I, Sliekers O, Schmid M, Bock E, Fuerst J, Kuenen JG, Jetten MSM, Strous M New concepts of microbial treatment processes for the nitrogen removal in wastewater FEMS Microbiol Rev, 2003, 27 (4): 481~492 47 Robertson LA, Kuenen JG Combined heterotrophic nitrification and aerobic denitrification in Thiosphaera-pantoteopha and other bacteria Anton Leeuw Int J G, 1990, 57 (3): 139~152 48 Bergaust L, Mao Y, Bakken LR, Frostegard A Expression of NOx reductase genes and denitrification response patterns in Paracoccus denitrificans: Effects of suboptimal ph Appl Environ Microbiol, DOI: 101128/AEM00608-10 49 Ma F ( 马放 ), Zhou DD ( 周丹丹 ), Wang HY ( 王宏宇 ), Dong SS ( 董双石 ) Characteristics of psammophytes of an aerobic denitrifies J Harbin Inst Technol ( 哈尔滨工业大学学报 ), 2006, 38 (4): 575~577 50 Bouchez T, Patureau D, Delgen JP, Moletta R Successful bacterial incorporation into activated sludge flocs using alginate Bioresour Technol, 2009, 100 (2): 1031~1032 51 Gupta AB, Gupta SK Simultaneous carbon and nitrogen removal from high strength domestic wastewater in an aerobic RBC biofilm Water Res, 2001, 35 (7): 1714~1722 52 Ma F ( 马放 ), Zhang J ( 张佳 ), Zhang XX ( 张献旭 ), Wei L ( 魏利 ), Yang JX ( 杨基先 ) Nitrogen removal by aerobic denitrifies in bio-ceramic reactor China Environ Sci ( 中国环境科学 ), 2007, 27 (4): 529~533 53 Barak Y, van Rijn J A typical polyphosphate accumulation by the denitrifying bacterium Paracoccus denitrificans Appl Environ Microbiol, 2000, 66 (3): 1209~1212