FIT)

768 Journal of Ningxia Medical University 第 39 卷 7 期 2017 年 7 月 文章编号 :1674-6309(2017)07-0768-05 论著 ENO1 在肝癌细胞株和肝细胞癌中的表达及与临床病理参数的关系 闫婷婷 1, 马丽娜 2, 唐媛媛 1, 雒夏 2, 丁向春 2 (1. 宁夏医科大学, 银川 750004; 2. 宁夏医科大学总医院感染性疾病科, 银川 750004) 摘要 : 目的探讨 α- 烯醇化酶 (ENO1) 在肝癌细胞株及肝细胞癌 (HCC) 组织中的表达, 分析其表达与临床病理参数之间的关系 方法分别采用 RT-PCR Western blot 检测 32 例肝细胞癌及其相应癌旁组织,L-O2 细胞 HepG2 细胞及 HepG2.215 细胞中 ENO1mRNA 及其蛋白的表达 ; 用组织芯片技术检测 80 例肝癌组织及对应癌旁组织中 ENO1 的表达, 并分析其与临床病理参数之间的关系 结果与癌旁肝组织相比, 肝细胞癌组织中 ENO1mRNA 和蛋白表达均增高 (P<0.05); 与正常肝细胞 L-O2 相比,HepG2 细胞和 HepG2.215 中 ENO1mRNA 和蛋白表达量均增高 (P<0.05),HepG2.215 细胞表达量高于 HepG2.0 细胞 (P<0.05); 组织芯片结果显示肝癌组织中 ENO1 蛋白表达高于癌旁组织 (P<0.05), 并且 ENO1 的表达水平与年龄 性别 甲胎蛋白 (AFP) 肿瘤转移及肿瘤复发无关(P>0.05), 与肿瘤大小 HBV 感染有关 (P<0.05) 结论 ENO1 在肝癌细胞系及肝细胞癌组织中均高表达, 并与肿瘤大小 HBV 感染有关 关键词 : 肝细胞癌 ;ENO1;RT-PCR;Western blot; 组织芯片中图分类号 :R735.7 文献标识码 :A DOI:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2017.07.008 原发性肝癌 (primary liver cancer,plc) 是最严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一, 其中肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,hcc) 是最常见的原 [1-2] 发性肝癌类型 目前肝细胞癌的发病机制尚不清楚, 手术治疗效果欠佳 α- 烯醇化酶 (α-enolase,eno1) 是糖酵解过程中的关键酶, 在细胞 [3] 能量代谢过程中起重要作用 它除参与机体能量代谢过程外, 还与细胞分裂 增殖 凋亡和细胞迁移 蛋白水解等生物学过程有关, 是一个多 [4] [5-6] 功能的蛋白 既往研究表明,ENO1 在多种肿瘤组织中呈过表达状态, 并在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用 然而其在肝癌细胞株及肝细胞癌组织中的表达情况及与临床病理参数之间的关系尚缺乏深入研究 本文旨在观察 ENO1mRNA 及其蛋白在肝癌细胞株及肝细胞癌中的表达情况, 初步探讨其与临床病理参数之间的关系 收稿日期 :2017-05-16 基金项目 : 国家自然科学基金 (81460301); 宁夏自然基金重点项目 (NZ15134) 作者简介 : 闫婷婷 (1988-), 女, 湖北人, 在读硕士研究生, 研究方向 : 传染病 E-mail:864277651@qq.com 通信作者 : 丁向春, 男, 主任医师 E-mail: 13619511768@163.com 1 材料与方法 1.1 标本 1.1.1 组织标本收集宁夏医科大学总医院病理科 2005 年 6 月 -2009 年 12 月手术切除的肝细胞癌组织及对应癌旁组织石蜡标本各 80 例, 均经病理组织学确诊, 男性 68 例, 女性 12 例 ; 年龄 (51.12±10.13) 岁 ; 肿瘤大小 (7.29±3.87)cm, 其中多发肿瘤的直径是多个肿瘤直径之和 ;HBV 感染相关肝细胞癌 59 例, 非 HBV 感染相关肝细胞癌 21 例 ; 甲胎蛋白 (AFP) 阳性者 51 例, 甲胎蛋白阴性者 29 例 ( 酶联免疫法 AFP 正常值 20μg L -1, 超过该值为阳性 ); 发生肝外转移者 5 例 ; 术后复发者 41 例 对所有患者通过电话进行随访, 随访时间截止到 2012 年 12 月 30 日, 在此期间患者每半年门诊复查 1 次 收集宁夏医科大学总医院肝胆外科 2012-2014 年手术切除新鲜 HCC 肿瘤组织及其癌旁组织 ( 距离瘤体 >3cm), 32 例新鲜肝癌及癌旁组织冻存于 -80 备用, 用于观察 ENO1mRNA 及其蛋白在肝细胞癌中的表达 ; 其中男 22 例, 女 10 例, 年龄 39~70 岁, 平均年龄 53.13 岁 入选标准 : 所有入选患者经病理诊断为肝细胞癌 ; 术前均未行放 化疗, 并无长期服用非甾体类消炎药物史 所有受试对象均签署知情同意书, 并经宁夏医科大学总医院伦理委员会

7 期闫婷婷, 等. ENO1 在肝癌细胞株和肝细胞癌中的表达及与临床病理参数的关系 769 同意后执行 1.1.2 细胞株人正常肝细胞 L-O2 细胞系, 肝癌细胞系 HepG2 及 HepG2.215 均购自美国 ATCC 公司 1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养 L-O2 细胞采用含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养液,HepG2 及 HepG2.215 细胞采用含 10% FBS 的 DMEM 培养液 (FBS 购自澳洲 gibco 公司, RPMI-1640 及 DMEM 均购自 hyclone 公司 ), 在 37 5% CO 2 及饱和湿度条件下培养, 细胞为贴壁生长, 每 2~3d 用胰蛋白酶消化传代, 取对数生长期细胞进行实验 1.2.2 荧光定量 PCR 检测肝癌组织及肝癌细胞中 ENO1mRNA 的表达对 80 例肝细胞癌组织及其癌旁组织石蜡标本采用荧光定量 PCR 检测, 组织及细胞总 RNA 的提取采用 Trizol 法 ( 美国 Invitrogen 公司生产 ), 提取步骤按照说明书进行 检测总 RNA 的浓度以及纯度, 总 RNA 纯度 A260 /A280 在 1.8~2.0 之间为合格 cdna 的合成 : 取 1μg RNA 按照反转录试剂盒 ( 全式金 ) 说明书的反应体系及反应条件进行 实时荧光定量 PCR: 取 1μL 的 cdna 模板, 反应体系及反应条件严格按照荧光定量试剂盒 ( 全式金 ) 说明书进行 ENO1 上游引物 :5 -CGCAAAGCAAAT- CAAATAG-3 ;ENO1 下游引物 :5 -AAAGCATC- CACAAGGACAGA-3 (122 bp) β-actin 上游引物为 :5 -AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3,β - actin 下游引物 : 5 --3 (258bp) 每个样本重复 3 孔, 进行 3 次独立重复实验 取其循环阈值 (CT) 均值, 以 β-actin 作为内部参照,ΔΔCT= 实验组 (CTENO1-CTβ-actin) - 对照组 (CTENO1- CTβ-actin),2 -ΔΔCT 为两组 ENO1mRNA 含量的相对比值 1.2.3 Western blot 检测肝癌组织及肝癌细胞中 ENO1 蛋白的表达组织及细胞全蛋白提取, 所有步骤按照说明书 ( 南京凯基全蛋白提取试剂盒 ) 进行, BCA 法测定蛋白浓度 按每孔 30μg 蛋白上样,10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 湿转法转膜,5% 脱脂奶粉室温封闭 1h, 兔抗人 ENO1 单克隆抗体 (1 1000 稀释, 购自美国 Proteintech 公司 ), 兔抗人 β-actin 单克隆抗体 (1 5000 稀释, 购自美国 Proteintech 公司 )4 过夜,TBST 洗膜 10min 3 次, 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔 IgG 室温孵育 1h(1 5000 稀释, 购自美国 Proteintech 公司 ),TBST 洗膜 10 min 3 次, 加入 ECL 化学发光底物 ( 美国 Thermo 公司 ) 成像 用 ImageJ 软件测目的蛋白和内参条带的灰度值, 以目的蛋白与内参 β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达水平 1.2.4 组织芯片技术检测 HCC 组织的 ENO1 表达由上海芯超公司完成 根据染色阳性细胞的比例及染色强度进行 ENO1 表达的半定量分析 阳性细胞比例得分计算 :<25% 为 1 分,25%~50% 为 2 分,50%~75% 为 3 分,>75% 为 4 分 染色强度评分标准 : 0 分 ( 阴性 ),1 分 ( 淡黄色 ),2 分 ( 黄色或深黄 ) 和 3 分 ( 褐色或深褐色 ) 二者分值相乘得出综合评分 1.3 统计学方法使用 SPSS 17.0 统计软件对结果进行分析, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 组间比较采用 t 检验 ; 多组样本均数间比较采用单因素方差分析, 进一步两两比较采用 SNK 法 双侧检验,P 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 肝癌组织中 ENO1mRNA 及其蛋白的表达实时荧光定量 PCR 分析 32 例肝癌组织及对应的癌旁组织中 ENO1mRNA 的表达水平, 结果显示, 肝癌组织中 ENO1 mrna 表达水平 (2.81± 1.57) 高于癌旁组织 (1.00±0.00)(P<0.05) Western blot 检测结果显示肝癌组织中 ENO1 蛋白表达水平 (0.94± 0.06) 高于癌旁组织 (0.60±0.09) (P<0.05)( 图 1) 2.2 肝癌细胞系中 ENO1mRNA 及其蛋白的表达实时荧光定量 PCR 分析 L -O2 HepG2 HepG2.215 三个细胞系中 ENO1mRNA 表达差异有统计学意义 (P<0.05);ENO1 mrna 在 HepG2.215 细胞的表达量 (3.21± 0.12) 高于 HepG2 细胞 (1.76±0.05) 和 L-O2 细胞 (0.53±0.04),HepG2 细胞高于 L-O2 细胞 (P 均 <0.05);Western blot 分析显示,ENO1 蛋白在三个细胞系中表达差异有统计学意义 (P<0.05);HepG2.215 细胞的 ENO1 蛋白表达量 (1.42±0.04) 高于 HepG2 细胞 (1.06±0.05) 和 L-O2 细胞 (0.53±0.03),HepG2 细胞高于 L-O2 细胞 (P 均 <0.05), 见图 2 2.3 组织芯片技术检测肝癌组织及癌旁组织中 ENO1 的表达 ENO1 主要定位于细胞质中, 少量表达在细胞核及细胞膜, 呈棕黄色颗粒分布 ( 图 3, 见封 2) 免疫组化评分结果表明,ENO1 在肝癌组织中的表达高于癌旁组织 (P<0.01), 见表 1

770 39 卷 与癌旁组织比较 * P<0.05(n=32) 图 1 肝癌及癌旁组织中 ENO1mRNA 和蛋白的表达 图 2 与 L-O2 细胞比较 * P<0.05; 与 HepG2.0 细胞比较 P<0.05 L-O2 HepG2.0 HepG2.215 细胞中 ENO1mRNA 和蛋白的表达 表 1 组织芯片检测 ENO1 在肝癌组织及 癌旁组织中的表达 (x±s, 分 ) 检测组织 n 免疫组化评分 t 值 P 值 肝癌组织 80 5.65±2.68 13.90 0.00 癌旁组织 80 1.34±0.71 2.4 ENO1 的表达水平与临床病理参数之间的 关系 80 例肝癌组织中 ENO1 的表达水平与年龄 性别 AFP 肿瘤转移 肿瘤复发无关(P<0.05), 肿 瘤 5cm 有 HBV 感染者 ENO1 表达水平高于肿 瘤 <5cm 无 HBV 感染者 (P<0.05), 见表 2 3 讨论 肿瘤的形成和发展除有癌基因激活 抑癌基 因失活, 还有非癌基因致癌因素的参与, 肿瘤代 [7-8] 谢途径的改变就是非致癌基因致癌因素之一 正常细胞是通过线粒体氧化磷酸化提供 ATP, 从而为细胞的正常生理活动提供能量 然而肿瘤细胞由于生长过快经常处于相对缺氧的状态, 糖酵 [9] 解代谢途径是缺氧时的能量代谢代偿过程 ENO1 作为糖酵解过程中的关键酶能激活糖酵解途径, 改善缺氧细胞能量失衡 本研究我们收集了 32 例 HCC 患者的肝癌组织及对应的癌旁组织, 并利用正常肝细胞 L-O2 肝癌细胞 HepG2 及 HBV 感染肝癌细胞模型 Hep G2.215 (HepG2.215 细胞是在 HepG2 细胞基础上整合了 HBV 全基因组 ), 采用 RT-PCR 和 Western blot 技

7 期闫婷婷, 等. ENO1 在肝癌细胞株和肝细胞癌中的表达及与临床病理参数的关系 771 表 2 80 例 HCC 患者肝癌组织 ENO1 表达与临床病理参数之间的关系 (x±s, 分 ) 临床病理特征 n ENO1 免疫组化评分 t 值 P 值 年龄 / 岁 <50 34 6.11±3.14 1.35 0.18 50 46 5.30±2.26 性别 男性 68 5.59±2.74 0.49 0.63 女性 12 6.00±2.41 肿瘤大小 / cm <5 46 5.15±2.51 2.34 0.02 5 34 6.53±2.72 肿瘤转移 否 75 5.83±2.71 1.16 0.25 是 5 4.40±1.67 肿瘤复发 否 39 5.52±2.34 0.28 0.79 是 41 4.86±1.64 AFP 阴性 29 5.83±2.75 0.23 0.82 阳性 51 5.69±2.66 HBV 感染 否 21 4.33±2.15 2.83 0.01 是 59 6.00±2.74 术从 RNA 和蛋白水平检测 ENO1 的表达情况 结果显示, 在肝癌组织中 ENO1 表达高于癌旁组织, 在 Hep G2.215 细胞中 ENO1 的表达量最高, Hep G2 细胞次之,L-O2 细胞的表达量最低 组织芯片结果也显示,80 例肝癌组织中 ENO1 蛋白表达高于癌旁组织 本研究结果与 Takashima 的 [10] 研究结果一致, 进一步证实 ENO1 在肝细胞癌中高表达 ENO1 在 HepG2.215 细胞中的表达高于 HepG2 细胞, 提示 ENO1 与 HBV 感染相关, 可能参与 HBV 在肝细胞的复制 这一结果在组织 [11] 芯片中也得到证实 有研究表明,ENO1 与细胞骨架成分 ( 如 F- 肌动蛋白及微管蛋白 ) 的功能有关, 而细胞骨架蛋白在单纯疱疹病毒 (herpes simplex virus,hsv) 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,hiv) 丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus,hcv) 等多种病毒感染性疾病中已被证实与病毒在细胞内的转运过程 病毒转运定位到亚细胞及复制状态维持有关 由此我们推测 ENO1 可能通过细胞骨架蛋白促进肝细胞中 HBV 的复制, 但确切机制有待进一步验证 除此之外, 组织芯片结果显示 ENO1 表达水平与患者年龄 性别 AFP 肿瘤转移 肿瘤复发无关 当肿瘤 5cm 时,ENO1 表达水平增高, 这可能是由于 ENO1 作为糖酵解的关键酶激活糖酵解途径, 发挥改善缺氧细胞能量失衡作用所致 肿瘤越大, 其缺氧程度越明显,ENO1 通过无氧糖酵解途径为肿瘤细胞提供能量, 促进了肝细胞肝癌的生长 综上, 在肝细胞癌组织及细胞水平上 ENO1mR- NA 及其蛋白均高表达, 并且与肿瘤大小 HBV 感染有关, 为研究 HBV 在肝癌中的复制机制提供 了线索 参考文献 : [1] El -Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma[j]. Gastroenterology,2012, 142(6):1264-1273. [2] Luk JM,Liu AM. Proteomics of hepatocellular carci - noma in Chinese patients[j]. OMICS,2011,15(5): 261-266. [3] Vermeulen N,Arijs I,Joossens S,et al. Anti -alpha - enolase antibodies in patients with inflammatory Bowel disease[j]. Clin Chem,2008,54(3):534-541. [4] 魥 ngels DíazRamos, Roigborrellas A, Garcíamelero A,et al. α -Enolase, a multifunctional protein: Its role on pathophysiological situations[j]. Journal of Biomedicine & Biotechnology,2012,2012(7):156795. [5] Perconti G,Ferro A,Amato F,et al. The kelch protein NS1-BP interacts with alpha -enolase/mbp -1 and is involved in c -Myc gene transcriptional control[j]. Biochim Biophys Acta,2007,1773(12):1774-1785. [6] Terrier B,Degand N,Guilpain P,et al. Alpha -enolase: a target of antibodies in infectious and autoimmune diseases[j]. Autoimmun Rev,2007,6(3):176-182. [7] Mazurek S, Shoshan M. Tumor cell metabolism, pathways,regulation and biology[j]. Anticancer Research,2015,12(11):934-948. [8] Vander Heiden MG,Cantley LC,Thompson CB. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation[j]. Science,2009,324(5930): 1029-1033. [9] Jin S,DiPaola RS,Mathew R,et al. Metabolic catastrophe as a means to cancer cell death[j]. J Cell Sci,2007,120(Pt 3):379-383.

772 39 卷 [10] Takashima M,Kuramitsu Y,Yokoyama Y,et al. Overexpression of alpha enolase in hepatitis C virusrelated hepatocellular carcinoma: association with tumor progression as determined by proteomic analysis[j]. Proteomics,2005,5(6):1686-1692. [11] Keller A,Peltzer J,Carpentier G,et al. Interactions of enolase isoforms with tubulin and microtubules during myogenesis[j]. Biochim Biophys Acta,2007, 1770(6):919-926. ( 责任编辑 : 路锦绣 ) Expression of ENO1 in Hepatocellular Carcinoma and Its Relationship with Cinicopathological Parameters YAN Tingting 1, MA Lina 2, TANG Yuanyuan 1, LUO Xia 2, DING Xiangchun 2 (1. Ningxia Medical University, Yinchuan 750004; 2. Department of Infectious Disease, the General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004) Abstract: Objective To investigate the expression of ENO1 in hepatocellular carcinoma cells and hepatocellular carcinoma and its relationship with clinicopathological parameters. Methods RT-PCR,Western Blot was used to detect the expression of ENO1mRNA and protein in 32 cases hepatocellular carcinoma and its adjacent tissues,l-o2,hepg2 and HepG2.215 cells respectively. Tissue microarray was used to detect the expression of ENO1 in 80 cases hepatocellular carcinoma tissues and its adjacent tissues, analyzed its relationship with clinicopathological parameters. Results Compared with the adjacent liver tissue, ENO1 mrna and protein were highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues (P<0.05). Compared with L-O2 cell line, ENO1 mrna and protein were highly expressed in HepG2.215 cells and HepG2.0 cells and the expression of ENO1 in HepG2.215 cells was higher than that of HepG2.0 cells(p<0.05). And the expression level of ENO1 was not related to age,sex,afp, tumor metastasis and tumor recurrence, but related to tumor size and HBV infection in Liver cancer tissue microarray. Conclusion ENO1 is overexpressed in hepatocellular carcinoma, associated with tumor size and HBV infection, but not related to age,sex,afp, tumor metastasis and tumor recurrence. Key words: hepatocellular carcinoma; ENO1;RT-PCR;Western blot; tissue microarray ( 上接第 763 页 ) determine the independent predictors of coronary atherosclerosis. Pearson and Spearman correlation analysis were conducted to determine the relationship between NGAL and coronary lesion morphology. Results For chronic kidney diseases patients, NGAL level was significantly increased in the CAD group than that in the non-cad group(p=0.001). sst-2 levels were correlated positively with high-sensitivity C-reactive protein, the number of plaques and the calcified plaque type(p<0.05). NGAL were a significant independent predictor of coronary atherosclerosis in chronic kidney diseases patients(p=0.024;odds ratio=1.003; 95% confidence interval: 1.001-1.004). Conclusion NGAL is a promising inflammation biomarker that may help identify coronary atherosclerosis in patients in patients with chronic kidney diseases. Key words: coronary atherosclerosis; diabetes mellitus; soluble ST2;coronary CT angiography