第 卷第 期 年 月 杭州师范大学学报 自然科学版!"# "$%% &'" # & #! 表达载体构建及其表达对 ' 细胞增殖的影响 虞 游 张艳欧 赵文铖 白 坚 陈建明 杭州师范大学生命与环境科学学院 浙江杭州 # 摘 要 "* (" 扩增的 %!% 基因连接到 +8% * 载体并测序鉴定 经测序正确的 %!% 基因再连接到 +$.( 载体构建 +$.( 1.1# 重组质粒 重组质粒 +$.( 1.1# 转染 / + 细胞后用荧光显微镜及半定量 "* (" 分析其表达情况 并用流式细胞仪测定细胞生长曲线分析其表达对 / + 细胞增殖的影响 结果显示 +$.( 1.1# 重组质粒构建正确 转染 / + 细胞后荧光显微镜下观察到绿色荧光信号 半定量 "* (" 结果显示转染后 / + 细胞 %!% 基因条带亮度明显升高 细胞生长曲线测定结果显示转染后 / + 细胞从第二天起其增殖速度变慢 至第三天时其增殖速度明显慢于对照细胞的增殖速度 说明成功构建了能在 / + 细胞中表达 $.( 1.1# 融合蛋白的 +$.( 1.1# 重组质粒 +$.( 1.1# 重组质粒体表达能抑制 / + 细胞的增殖 关键词 %!% 基因 $.( 1.1# 融合蛋白 / + 细胞 增殖中图分类号 "# 文献标志码 文章编号 #! 喉癌是头颈部常见恶性肿瘤 约占全身恶性肿瘤的?#? 近年来发病率有逐渐上升趋势 但其发病机制还不清楚 已有资料表明喉癌发生除了与 () 等肿瘤抑制基因有关外 高风险人乳头瘤病毒感染也能诱导喉癌发生 目前喉癌治疗手段主要为手术 放疗与化疗 种方法 但预后往往不理想并且有很大毒副作用 因此 寻找喉癌发病相关基因 对于揭示喉癌发病分子机理以及喉癌早期诊断与预防都有 重要作用 最近 我们用干扰素 1. 处理培养的人喉癌细胞系 / + 细胞 发现干扰素 能抑制 / + 细胞的增殖并诱导干扰素可调控表达的 %!% 基因表达 但不影响与 %!% 基因同源的 *+ 基因表达! 我们推测干扰素 抑制 / + 细胞增殖可能是通过诱导 %!% 基因表达而介导 ;;&% 6& 等也报道 %!% 基因表达高低与喉癌的增殖性及其预后好坏相关 增殖性低预后好的喉癌标本中 %!% 基因表达 高 而增殖性高预后差的喉癌标本中 %!% 基因表达则低下 由此推测 %!% 基因在喉癌细胞增殖中起抑制作用 本文以喉癌细胞系 / + 细胞作为研究材料 通过构建 %!% 基因的增强绿色荧光蛋白融合表达载体 利用基因外来过表达探讨 %!% 基因在喉癌细胞增殖中的作用 收稿日期 基金项目 浙江省钱江人才计划项目 "# 通信作者 陈建明 #! 男 副教授 博士 主要从事医学细胞分子生物学研究 $ % & &%& ; 5
# 杭州师范大学学报 自然科学版 年 材料和方法 主要仪器, (" 仪 杭州朗基公司 *&6 % 凝胶成像系统 上海天能科技 16 7 型 A 培养箱 9&72! 倒置相差显微镜 A %+9 荧光显微镜 A% &(7 " 数码照相系统 +6&)6 /* 流式细胞仪,&&+7 主要试剂 *7&; 试剂 9&9& 9"* - 第一链合成试剂盒 " / 4 碧云天 * >- 聚合酶 上海鼎国 - 片段纯化 回收试剂盒 碧云天 - 分子量标准 $ /11 及 *!- 连接酶 碧云天 牛小肠碱性磷酸酶 * ) 7 及 1(* 碧云天 (%&5,& 2&6 1$ 0&+ 6 7 转染试剂 碧云天 重组人干扰素 ( +7* "(,1 #! 培养基 北京赛默飞世尔 新生小牛血清 杭州四季青 胰蛋白酶及双抗 碧云天 ( 质粒 菌种和细胞系 大肠杆菌 -/ 为本室保存 质粒 +8% * 购自碧云天公司 +$.( 载体由浙江大学医学院提供 人喉癌细胞系 / + 细胞购自中科院上海细胞库 贴壁培养于含? 新生小牛血清及? 青 链霉素的 "(,1 #! 培养基中 于 <? A 及饱和湿度的细胞培养箱中进行培养 每隔 5 换一次液 ; 基因 # / 合成 培养的人喉癌细胞系 / + 细胞用 %0 干扰素 处理! 后 消化收集细胞 用 *7&; 试剂提取细胞总 " 取 总 " 用 9"* - 第一链合成试剂盒将其逆转录合成 - 取 0 - 作为模版用 (" 技术扩增 %!% 基因编码区 - (" 扩增引物序列为 上游引物 * * 下游引物 * **** (" 扩增条件为! < 预变性 %& 后! < 变性! < 退火 < 延伸 %& 个循环后 < 延伸 %& (" 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后 割胶纯化回收目的基因片段 将回收的目的基因连接到 +8% * 载体并进行测序 经测序正确后进行下一步实验 真核表达载体的构建 经测序正确的目的基因片段用 $ /1 酶从 +8% * 载体上切出 凝胶电泳纯化回收目的 %!% 基因片段 同时 用 $ /1 酶切增强绿色荧光蛋白 $.( 表达载体 +$.( 纯化回收后再用碱性磷酸酶 1 ( 处理 $ /1 酶切的 +$.( 载体 随后 将纯化回收的 +$.( 载体与纯化回收的 %!% 基因片段进行连接 连接产物转化感受态菌 -/ 后涂板培养过夜 第二天挑取若干白色菌落分别培养! 后制备质粒 - 最后 用 1 酶切筛选 %!% 基因正向插入的 +$.( 1.1# 融合蛋白表达载体 载体转染 ' 细胞 将指数生长的 / + 细胞接种于! 孔细胞培养板 每孔接种! 细胞于 %0"(,1 #! 培养基中 培养! 后 用 0&+ 6 7 试剂将 (%&5,&2&6 制备的 +$.( 1.1# 载体 - 或 +$.( 空载体 - 各 分别转染导入 / + 细胞 每次实验时每种载体 - 分别转染 个复孔的细胞 载体在 ' 细胞中表达检测 +$.( 1.1# 载体或 +$.( 空载体转染 / + 细胞! 后 分别消化收集细胞 然后分别用荧光显微镜及半定量 "* (" 技术分析 +$.( 1.1# 载体在 / + 细胞中的表达情况 荧光显微镜分析时 细胞先用 (9 漂洗 次 然后用! % 激发波长在荧光显微镜下观察细胞发出的绿色荧光信号 并用 (7 " 数码系统拍摄照片 半定量 "* (" 分析时 先用 *7&; 试剂分别提取细胞总 " 各取 总 " 用 - 合成试剂盒逆转录合成 - 再各取 0 - 作为模板用 (" 分析 %!% 基
第 期 虞 游 等 +$.( 1.1# 表达载体构建及其表达对 / + 细胞增殖的影响 因及内对照,$- 基因表达情况 (" 扩增 %!% 基因时 引物序列为上游引物 * * 下游引物 * ****** * ** 扩增条件为!< 预变性!%& 后!< 变性 < 退火! < 延伸! 个循环后 < 延伸 %& (" 扩增,$- 基因时 引物序列为上游引物 * ** ** 下游引物 *** **** * 扩增条件为!< 预变性!%& 后!< 变性 < 退火 < 延伸 个循环后 < 延伸 %& 7 载体表达对 ' 细胞增殖影响分析 / + 细胞按上述方法接种于! 孔培养板后 分别用 +$.( 1.1# 载体或 +$.( 空载体进行转染或不进行转染 从第二天开始 每种转染每天收集 个复孔细胞 用流式细胞仪计数每孔细胞的细胞数值 然后分别求出每种转染每天 个复孔细胞计数值的平均值及标准差 "E 最后以天数为横坐标 转染后!! 及 分别命名为 55 及 5 以天数对应的平均值为纵坐标 绘出每种转染细胞的生长曲线 实验独立重复 次 以分析 +$.( 1.1# 载体表达对 / + 细胞增殖的影响 结 果 真核表达载体的构建 "* (" 扩增得到一条符合预期大小 '+ 的 - 条带 图 将其纯化回收后克隆到 +8% * 载体上 经测序证实该 - 条带正是我们所需的 %!% 基因 随后 用 $ /1 酶将 %!% 基因从 +8% * 载体上切出 纯化回收后 将其克隆到 +$.( 载体多克隆位点的 $ /1 切点上 用 1 酶切筛选 %!% 基因的正反向插入 正向插入时 1 酶切得到 #!'+ 和! '+ 两条带 而反向插入时 1 酶切则得到 '+ 和 #'+ 两条带 最后筛选得到 %!% 基因正向插入的 +$.( 1.1# 融合蛋白表达载体 图 泳道 - 分子标记 泳道 "* (" 扩增产物 图 扩增 基因 ''),%$#)*- 泳道 - 分子标记 泳道 +$.( 1.1# 重组质粒用 1 酶切后产生 #!'+ 和! '+ 两条带 图 酶切筛选 重组质粒 #!' $!'#,*) %),*-' 载体在 ' 细胞中的表达 +$.( 1.1# 载体转染导入 / + 细胞! 后 在荧光显微镜下观察到 / + 发出清晰的绿色荧光信号 图 同时 空载体 +$.( 转染的 / + 细胞也观察到了清晰的绿色荧光信号 图 9 并且 空载体转染细胞的荧光信号比 +$.( 1.1# 载体转染细胞的荧光信号要多得多 符合我们的预期 这是由于空载体比 +$.( 1.1# 载体小因而其转染效率高之故 荧光显微镜分析结果说明 +$.( 1.1# 载体在 / + 细胞中表达了 $.( 1.1# 融合蛋白 +$.( 1.1# 载体转染导入 / + 细胞! 后 半定量 "* (" 分析发现 / + 细胞 %!% 基因 %" 水平要明显高于空载体转染细胞及不转染细胞中 %!% 基因的 %" 水平 图! 半定量 "* (" 分析结果进一步说明 +$.( 1.1# 载体在 / +
杭州师范大学学报 自然科学版 年 细胞中表达了 $.( 1.1# 融合蛋白 泳道 / + 细胞不转染 泳道 / + 细胞用 +$.( 空载体转染! 泳道 / + 细胞用 +$.( 1.1# 重组质粒转染!,$- 作为内对照 图 ; 半定量 分析 重组质粒转染后 ' 细胞 基因,/ 水平 ;,/%'&'%$''))%-:'*- / + 细胞用 +$.( 空载体转染 9/ + 细胞用 +$.( 1.1# 重组质粒转染 图 ( 重组质粒在 ' 细胞中表达 融合蛋白 (!'#,*) %),'!'' $"!' ' #'% ( 载体表达抑制 ' 细胞的增殖流式细胞仪计数测定细胞生长曲线显示 +$.( 1.1# 载体转染后第一天时 / + 细胞其增殖速度与空载体 +$.( 转染细胞及不转染细胞的增殖速度没有差异 但从第二天起 +$.( 1.1# 载体转染的 / + 细胞其增殖速度要慢于空载体转染 ',"))&' ' #'%!)$'#' 1+!'#,*) %), 细胞及不转染细胞的增殖速度 至第三天时 +$.( 1.1# 载体转染的 / + 细胞其增殖速度明显慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度 见图 统计分析差异有显著性 由此说明 +$.( 1.1# 载体表达能抑制 / + 细胞的增殖 流式细胞仪计数测定细胞生长曲线结果说明 %!% 基因对 / + 细胞增殖起抑制作用 讨 论 符号 表示 +$.( 1.1# 转染的 / + 细胞数目与 +$.( 转染的或不转染的 / + 细胞数目相比统计分析有显著差异性 "E 图 重组质粒表达抑制 ' 细胞的增殖!'$!'#,*) %),+*' +'!%$'!)$ ' #'% 喉癌发病率近年来有逐渐上升趋势 由于传统喉癌治疗手段预后不理想且有很大毒副作用 因此 揭示喉癌发病的分子机制 为临床开展早期喉癌分子诊断及基因干预与预防提供理论基础显得尤为重要 近年来有报道发现喉癌的增殖性及预后好坏与 %!% 基因表达高低有关 我们的初步研究结果也! 发现 %!% 基因可能介导干扰素 对喉癌细胞增殖的抑制作用 %!% 基因是人体内的干扰素 可诱导表达基因 它属于干扰素可诱导的 1.1 又称 /1 蛋白家族成员 除 %!% 基因外 人体内还有其它 个成员 分别为 *+ %&5 75&76& 6& 6& 基因 %*. ' 6& % % 基因和 %!%/1.1 & 5&' +76 & 基因 %!% 基因位于人一号染色体 > 区域 研究发现人一号染色体 > 区域的遗传改变与某些肿瘤及自身免疫疾病有关 目前已知 %!% 基因是系统性红斑狼疮的易感基因 此外 近年来越来越多的研究报道 %!% 基因在肿瘤中也起作用 # 本研究通过构建 %!% 基因的荧光蛋白融合表达载体 在喉癌细胞系 / + 细胞中表达 %!% 基因的融合蛋白 研究 %!% 基因在喉癌细胞增殖中的作用 首先 利用 "* (" 及基因克隆等技术 成功将
第 期 虞 游 等 +$.( 1.1# 表达载体构建及其表达对 / + 细胞增殖的影响 %!% 基因编码区 - 克隆到增强绿色荧光蛋白表达载体 +$.( 中 并利用荧光显微镜及半定量 "* (" 技术分析构建载体在 / + 细胞中的表达情况 最后成功构建了能在 / + 细胞中表达 %!% 基因的荧光融合蛋白的 +$.( 1.1# 载体 随后 将 +$.( 1.1# 载体转染导入 / + 细胞 用流式细胞仪计数测定细胞生长曲线 结果发现 +$.( 1.1# 载体转染的 / + 细胞 从第二天起其增殖速度慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度 至第三天时 +$.( 1.1# 载体转染 / + 细胞其增殖速度明显慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度 由此说明 +$.( 1.1# 载体表达能抑制 / + 细胞的增殖 本研究结果证明 %!% 基因对 / + 细胞增殖有抑制作用 本研究也为我们的后续研究打下了一定的研究基础 参考文献 &:.&-, 6 %+7 7 % %655 ) 7 1 7, 5# @* '7&;& *& 5 % 2$ >%7 & %& &575 5 6 7 7 7 6 %7 ( 5& 677! 5 75,7'&7>%7 & % &7 7!!! 陈建明 赵菁 葛莉伟 干扰素 对喉癌 / + 细胞增殖和凋亡的影响 中国细胞生物学学报 # ;;&% 6&9(,, 5& &,$ 6 7 5+ 6 7 6& 6 77& 5&' 1.1#+7 & &55 ) > %7 & % &%% & 6 %& 6 5 & 5& 776&&6 7 6& '6% +76 & %+ +&%&7&6& 5 +7&7 6& & 5/& 6+ 6!! # # # 赵菁 陈建明 邱明 等 干扰素诱导的 1.1 蛋白家族研究进展 杭州师范大学学报 自然科学版 '-- ) "/ 1 6 77& 5&' 1.1#+76 & & % 7 56&%% 5&.7 6& 7 & 9&& # 0 5 0$6" @ 7)*/1 %& %7 6 & 6 77& 5&'$ + 7&%6"7, ;&'7 5-57,"&6,$1&7 6 &&'&6& 55 ) >%7 & % ' 61 6 77& 5 &' 1.1#70 6! &%&7.,-&. $1.1#& %+7 6 67,7"!"#$!' '#!) +' $%"'#' $!' ''%!%$'!) D8 D :/ D :/ A @ 9 1 &/$ &%& 0&5$&7 %6 & / ;7% 8 &7 &6 / ;# & /*!)#%!%%+& & 5' "* (" &6 5& 66+8% * 675 &7% 5' >&56 &6 5& 66+$.(676 6766+$.( 1.1#7%'& 6+%&5*7%'& 6+%&5+$.( 1.1#676 5& 6 / +5&6 +7 & ; 5 &6 7 6%& 7+ 5%& > 6&6 6&"* ("56& &6 +7 &/ + +7&7 6&767; 56 7& 7 6 7 &6% 67 *7 6 5666+$.( 1.1#7%'& 6+%&5 776&676 55 6 7676& / +6 7 7 6 & '75 &6 7 6 %& 7+ 56%& > 6&6 6&"* ("7 65666'5'7&6 %!% ' & &756 7676& & / +% & &65 7% 7 6 7 666 7676& / + +7&7 6& 5 5 7%655 5666 &7556+7&7 6& 7 6' &76 66 667 7 6 &67 6 5666+$.( 1.1#7%'& 6+%&5+7 &$.( 1.1# & +76 & & / + 676 55&6 +7 & 5&&'&6/ + +7&7 6& 0'-1!%!% $.( 1.1# & +76 & / + +7&7 6&