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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): 45 51 45 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 何 焱 1, 王继双 1, 张鹏 1, 张文静 1 1,, 黄启来 2*, 华子春 1, 2* (1. 澳门科技大学中医药学院 / 澳门药物与健康应用研究所 / 中药质量研究国家重点实验室, 澳门 999078; 2. 南京大学医药生物技术国家重点实验室, 江苏南京 210093) 摘要 : 利用中效原理评价薯蓣皂苷元与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 联合应用于非小细胞肺癌 A549 细胞的相互作用, 并探讨可能的作用机制 MTT 法观察两药对 A549 和人肾上皮 293T 细胞的增殖抑制作用 运用中效原理 (Chou-Talalay 合用指数法 ) 判定两药的相互作用 Hoechst 33342 荧光染色 流式细胞术检测两药联合对细胞凋亡的影响 Western blotting 检测凋亡相关蛋白表达的变化 薯蓣皂苷元和 TRAIL 均能剂量依赖性地抑制 A549 细胞增殖 运用中效原理计算合用指数, 当 f a = 0.1, CI > 1; 当 f a > 0.1, CI < 1 对于 A549 细胞, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用, IC 50 由 21.864 μmol L 1 降低到 14.810 μmol L 1 (P < 0.05); 而对于 293T 细胞, 合用前后 IC 50 分别为 27.129 和 27.184 μmol L 1 (P > 0.05) 荧光显微镜观察及流式细胞术检测结果表明, 两药合用使细胞凋亡比例增加 联合用药组中 Caspase-8 Caspase-9 Bid Caspase-3 激活和 PARP 切割明显增加 ; Bcl-2 表达减少, 而 Bax 表达增加 ; MAPK 途径中 p38 JNK 和 ERK 明显激活 结果显示, 薯蓣皂苷元和 TRAIL 具有协同诱导 A549 细胞凋亡的作用, 机制与线粒体途径 死亡受体途径和 MAPK 信号途径均相关 关键词 : 非小细胞肺癌 ; 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 ; 薯蓣皂苷元 ; 中效原理 ; 协同效应中图分类号 : R965 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2013) 01-0045-07 Synergistic apoptotic effect of the combination of diosgenin and TRAIL on non-small-cell lung cancer cell line A549 evaluated with the Chou-Talalay method HE Yan 1, WANG Ji-shuang 1, ZHANG Peng 1, ZHANG Wen-jing 1, HUANG Qi-lai 1, 2* 1, 2*, HUA Zi-chun (1. Faculty of Traditional Chinese Medicine and Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health, the State Key Laboratory for Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Macau 999078, China; 2. The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing 210093, China) Abstract: This study is to investigate the apoptotic induction effect of the combination of diosgenin and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on non-small-cell lung cancer cell line A549 by using the Chou- Talalay method, and observe the mechanism of the combination. The apoptotic effect of diosgenin or TRAIL alone and their combination on A549 and normal cell line 293T proliferation was measured by MTT assay. Chou-Talalay method was used to evaluate the combination effect. Apoptosis was examined by Hoechst 33342 staining and flow cytometry assay. Western blotting detects the expression of apoptosis-associated proteins. Diosgenin or TRAIL alone can inhibit proliferation of A549 in a concentration-dependent manner. According to the Chou-Talalay method, when f a = 0.1, CI > 1, when f a > 0.1, CI < 1. Combined with TRAIL, the IC 50 of 收稿日期 : 2012-07-17; 修回日期 : 2012-11-06. 基金项目 : 澳门科技发展基金资助项目 (071/2009/A3, 091/2009/A). * 通讯作者 Tel / Fax: 86-25-83324605, E-mail: zchua@nju.edu.cn

46 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): 45 51 diosgenin decreases from 21.864 to 14.810 μmol L 1 (P < 0.05) on A549 cells. But for 293T cells, IC 50 of diosgenin does not change significantly. As with Hoechst 33342 staining and flow cytometry assay, the apoptosis ratios also increased in the combination group. At protein expression level, combination-treated group displays increased Caspase-8, Caspase-9, Bid, Caspase-3 activation and PARP cleavage, significantly decreased Bcl-2 and increased Bax expression, and MAPK pathways were activated. The combination of diosgenin and TRAIL has synergistic effect on A549 cells. Key words: non-small-cell lung cancer; TNF-related apoptosis-inducing ligand; diosgenin; Chou-Talalay method; synergistic effect 肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一, 其中 80% 以上是非小细胞肺癌 (NSCLC) [1] 化学疗法作为其主要治疗手段, 在治疗过程中发挥着重要的作用 虽然目前化疗药物为数不少, 但大多有效率低 临床使用的化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌效果, 但同时其非选择性杀伤正常细胞也给患者带来了诸多毒副作用, 严重影响了化疗的耐受性和依从性 因此临床上迫切需要高效 低毒的非小细胞肺癌治疗方法 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 即凋亡素 2 配体 (apoptosis-2 ligand, Apo-2L) 是肿瘤坏死因子 TNF 超家族成员之一, 通过与死亡受体结合而启动凋亡信号, 后期也有线粒体通路的参与, 最终诱导细胞凋亡 [2] TRAIL 对肿瘤细胞呈高选择性的杀伤效应, 可快速诱导肿瘤细胞凋亡, 而对正常组织并不敏感 并且在中国的 III 期临床试验已于近期完成, 在临床的广泛应用展现出诱人的前景, 但目前在治疗过程中遇到的抵抗问题又限制了其进一步的广泛应用 因此, 筛选和发现对 TRAIL 诱导的细胞凋亡具有协同作用的药物将对 TRAIL 未来的临床应用具有重要意义 薯蓣皂苷元 (diosgenin) 是一种来源广泛的甾体皂苷元 ( 图 1), 在穿龙薯蓣 葫芦巴 闭鞘姜等植物中含量较高 研究发现, 薯蓣皂苷元具有抗癌 抗炎 抗菌 降血脂 抗血小板聚集等多种药理学作用 [3] 目前尚无文献报道薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用在 A549 细胞中的效应 因此, 本研究考察薯蓣皂苷元与 TRAIL 联合应用于 A549 细胞, 探索作用效果及 Figure 1 Chemical structure of diosgenin (Dio, M W 414.63) 相关机制, 为非小细胞肺癌的治疗提供新策略 材料与方法细胞株及试剂人非小细胞肺癌 A549 细胞株和人肾上皮 293T 细胞株 (ATCC 公司, 美国 ) F-12K 培养基, 高糖 DMEM 培养基, 胎牛血清 FBS, 100 青霉素 / 链霉素混合液及 0.05% EDTA- 胰酶 (Invitrogen, 美国 ); 四甲基偶氮唑盐 [3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT, Ameresco, 美国 ]; 二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO, Ameresco, 美国 ) 薯蓣皂苷元标准品 ( 广东省药物研究所 ); 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL, 南京大学医药生物技术国家重点实验室 ) [4] ; Hoechst 33342 荧光染料 ( 碧云天生物技术研究所, 南京 ) p-p38 MAP kinase p38 JNK PARP Bcl-2 Bax 及 Caspase-3 兔多克隆抗体 (Cell Signaling Technology, 美国 ) ; p-erk p-jnk ERK Caspase-8 Caspase-9 Bid 及 α-tublin 鼠单克隆抗体 (Santa Cruz, 美国 ); donkey-anti-rabbit IRDye800CW, goat-anti-mouse IRDye800CW 远红外二抗 (Licor Biosciences, 美国 ) 十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 丙烯酰胺 (acrylamide) 甲叉双丙烯酰胺 (N, N-methyhene bisarylamide) 过硫酸铵 (ammonium persulfate, AP) 甘氨酸 (glycine, Gly) 三羟基甲基氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)metyl aminomethane, Tris] 及 N, N, N ', N '- 四甲基乙二胺 (N, N, N ', N '- tetramethylethylenediamine, TEMED) 均购于 Ameresco 公司 ( 美国 ); 考马斯亮蓝 (Coomassie brilliant blue G-250) 和溴酚蓝 (bromophenol blue) 为国药集团化学试剂有限公司 ( 中国 ) 产品 细胞培养取人非小细胞肺癌 A549 细胞, 于 37 5% CO 2 饱和湿度温箱中培养, 用含 10% FBS 青霉素 (100 u ml 1 ) 和链霉素 (100 mg ml 1 ) 的 F-12K 培养基 取人肾上皮 293T 细胞, 于 37 5% CO 2 饱和湿度温箱中培养, 用含 10% FBS 青霉素

何焱等 : 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 47 (100 u ml 1 ) 和链霉素 (100 mg ml 1 ) 的高糖 DMEM 培养基 MTT 法测定药物对细胞增殖作用的影响取对数生长期的 A549 细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 调整细胞数为 2 10 4 /ml (293T 细胞的细胞数为 4 10 4 /ml), 按照 100 μl/ 孔接种于 96 孔板 实验分为空白组 对照组及梯度浓度的给药组 ( 薯蓣皂苷元组 TRAIL 组及薯蓣皂苷元联合 TRAIL 组 ), 每组设 4 个复孔 药物与细胞孵育 24 h 后, 加入 MTT 溶液 (5 mg ml 1 ) 10 μl, 继续孵育 4 h, 孵育结束弃去培养基 每孔加入 DMSO 100 μl, 振荡器振荡 10 min 溶解甲结晶, 微孔板分光光度计设置检测波长 570 nm 和参比波长 650 nm, 读取不同处理组的吸光度值 (A) 按公式计算细胞的抑制率, 抑制率 (%) = 1 ( 处理组平均吸光度值 空白组平均吸光度值 ) / ( 对照组平均吸光度值 空白组平均吸光度值 ) 100% 药物联合应用评价采用中效原理 (Chou- Talalay 合用指数法 ) 对所得数据进行分析 [5] 药物作用效应即肿瘤抑制率 (f a ) 与之前提到的抑制率的计算方法一致 合用指数法的中效方程式为 : f a /f u = (D/Dm) m, 两边取对数 : lg (f a /f u ) = mlgd mlgdm, 设 Y = lg (f a /f u ), X = lgd, b = m, a = mlgdm, 得线性方程式 : Y = a + bx ( 其中 f u = 1 f a, D 为药物浓度, m 为中效曲线斜率, Dm 为中效浓度 ) 两药合用在不同效应的合用指数 (CI) 的计算公式为 : CI = (D 1 /D X1 ) + (D 2 /D X2 ) + α (D 1 D 2 /D X1 D X2 ), 其中 D X1 D X2 为两药单用产生 X 效应时各自所需浓度, D X (1, 2) 为两药合用产生 X 效应时所需浓度, 均可由中效方程式求得 ; D 1 D 2 为两药合用产生 X 效应时各自所需浓度, 可由公式 D 1 + D 2 = D X (1, 2) 求出 两种作用机制不同的药物合用时 α = 0, 作用机制相同的药物合用时 α = 1 薯蓣皂苷元和 [2, TRAIL 作用机制不同 3], 故 α = 0 若 CI < 1, 认为两药有协同作用, CI = 1 为相加作用, CI > 1 为拮抗作用 [5] 荧光显微镜观察细胞凋亡取对数生长期的 A549 细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 调整细胞数为 1 10 5 /ml, 以 500 μl/ 孔接种于 24 孔板 细胞贴壁后给予药物处理 阴性对照组加入完全培养基 ; 薯蓣皂苷元组的给药浓度为 10 和 20 μmol L 1 ; TRAIL 组为 0.003 μmol L 1 ; 联合给药组为 10 及 20 μmol L 1 薯蓣皂苷元分别与 0.003 μmol L 1 TRAIL 合用 药物孵育 24 h 后, 弃去上清液, 用 PBS 洗涤 2 次 按照 1 200 比例稀释 Hoechst 33342 荧光染料, 与细胞孵 育 4 避光 30 min, 荧光显微镜 (Olympus IX-71, 40) 下观察细胞核形态改变 流式细胞仪测定细胞凋亡 取对数生长期的 A549 细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 调整细胞 数为 3 10 5 /ml, 以 500 μl/ 孔接种于 24 孔板 细胞 贴壁后给予药物处理 阴性对照组加入完全培养基 ; 薯蓣皂苷元组的给药浓度为 10 μmol L 1 ; TRAIL 组为 0.003 μmol L 1 ; 联合给药组为 10 μmol L 1 薯 蓣皂苷元与 0.003 μmol L 1 TRAIL 合用 药物孵育 24 h 后, 收集细胞, 预冷 PBS 洗 2 次 1 000 r min 1 4 离心 5 min, 弃上清液, 细胞重悬于 binding buffer 400 μl 加入 AnnexinV-FITC 1 μl, 4 避光反应 20 min 后加入 PI 1 μl, 轻轻混匀后即进行流式细胞 仪 (BD FACSAria Ⅲ Flow Cytometer, 美国 ) 测定 Western blotting 蛋白印迹法 取对数生长期 A549 细胞, 胰酶消化后调整细胞数为 5 10 5 /ml, 以 1 ml/ 孔接种于 6 孔板 待细胞贴壁后, 给予 10 μmol L 1 薯蓣皂苷元或 ( 和 ) 0.003 μmol L 1 TRAIL 药物作用 24 h 后, 收集细胞, 用预冷的 PBS 洗涤, 蛋白裂解液 (100 mmol L 1 NaCl, 10 mmol L 1 Tris-HCl ph 7.6, 1 mmol L 1 EDTA ph 8.0, 100 mg L 1 PMSF, 1 mg L 1 抑肽酶 ) 4 裂解细胞 30 min, 12 000 r min 1 4 离 心 30 min, 收集上清液, 即为细胞总蛋白 用 Bradford 法进行蛋白含量测定 蛋白变性后, 以 60 μg 进行 SDS-PAGE 电泳 (12% 或 10% 分离胶, 5% 堆积胶 ) 电 泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜, 5% PBST 牛血清 白蛋白 (BSA) 封闭, 随后进行相关抗体孵育, 采用 近红外双色激光成像系统 Odyssey (Licor Biosciences, 美国 ) 检测蛋白含量 统计学分析 采用 SPSS17.0 统计学软件进行处 理, 实验均独立重复 3 次 中效原理计算使用 Excel 软件 IC 50 计算使用 SPSS 软件作 Probit 分析 运用 Microcal Origin 8.5 软件作图 流式细胞仪测定结果 图运用 Flowjo 软件制作 利用各个蛋白密度与对照 蛋白 α-tublin 密度比对后再归一化所得结果为各蛋白 的相对密度 结果 1 薯蓣皂苷元和 TRAIL 单用及合用对 A549 细胞增 殖的抑制作用 MTT 法检测薯蓣皂苷元 (2.5 5 10 20 40 及 80 μmol L 1 ) 与 TRAIL (0.003 0.006 0.012 0.024 0.048 及 0.096 μmol L 1 ) 单用或合用对 A549 细胞增 殖的影响 ( 表 1), 两种药物均表现出良好的剂量依赖

48 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): 45 51 Table 1 Inhibition effects of diosgenin and TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) on A549 cells. n = 3. ** P < 0.01 vs diosgenin group; P < 0.05, P < 0.001 vs TRAIL group * P < 0.05, Diosgenin TRAIL Diosgenin + TRAIL C/μmol L 1 f a C/μmol L 1 f a C/μmol L 1 f a 2.5 0.012 6 0.003 0.073 0 2.5 + 0.003 0.115 1 * 5 0.046 3 0.006 0.129 6 5 + 0.006 0.222 3 ** 10 0.123 4 0.012 0.195 7 10 + 0.012 0.396 8 ** 20 0.709 9 0.024 0.262 5 20 + 0.024 0.873 1 40 0.973 4 0.048 0.331 3 40 + 0.048 0.980 8 80 0.989 3 0.096 0.397 8 80 + 0.096 0.991 1 性地抑制 A549 细胞增殖的效应 ; 合用时抑制效应明显增强 2 中效原理的药物联合应用评价对结果 1 进行回归分析, 得出各实验组的线性方程式 (Y = a + bx) 和相关系数 (R), 计算两药单用及合用时的中效浓度 Dm ( 表 2) 结果表明, 薯蓣皂苷元的中效浓度为 15.25 μmol L 1, TRAIL 的中效浓度为 0.154 2 μmol L 1, 两药合用时的中效浓度为 8.273 3 μmol L 1 根据计算公式得出两药合用指数 CI 当 f a 为 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 及 0.95 时, CI 分别为 1.27 0.78 0.66 0.62 0.61 0.61 0.63 0.66 0.73 及 0.81 当 f a = 0.1, CI > 1, 即抑制率为 10% 时, 两药合用效应拮抗 ; 当 f a > 0.1, CI < 1, 即抑制率为大于 10% 时, 两药合用产生协同效应 未增强薯蓣皂苷元对 293T 的细胞毒性, 合用前后薯 蓣皂苷元的 IC 50 分别为 27.129 和 27.184 μmol L 1, 差 异无统计学意义 ( 图 3) Figure 2 Inhibition effects of diosgenin (Dio) and TRAIL on A549 cells determined by MTT assay. n = 3, x ± s. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs Dio group Table 2 The linear equation and median effect concentration of diosgenin and TRAIL Group Linear equation R Dm/μmol L 1 Diosgenin Y = 2.981 3 X 3.528 1 0.985 2 15.25 TRAIL Y = 0.602 7 X + 0.489 3 0.988 6 0.154 2 Diosgenin + Y = 2.130 7 X 1.955 3 0.983 1 8.273 3 (8.263 5 TRAIL + 0.009 8) 3 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 抑制 A549 细胞的增殖选取梯度浓度薯蓣皂苷元 (2.5 5 10 20 40 及 80 μmol L 1 ) 与 TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 联合使用 MTT 结果显示 : TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 对 A549 细胞的增殖抑制率的均值为 7.3% 薯蓣皂苷元对 A549 细胞的 IC 50 为 21.864 μmol L 1 薯蓣皂苷元与 TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 合用后对 A549 细胞的抑制作用明显增强 ( 图 2), IC 50 降为 14.810 μmol L 1, 差异具有统计学意义 (P < 0.05) 该结果与中效原理判断一致, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用可增强对 A549 细胞的增殖抑制作用 同时, 选取人肾上皮 293T 细胞, TRAIL 对人正常细胞不敏感, 与薯蓣皂苷元合用并 Figure 3 Inhibition effects of diosgenin (Dio) and TRAIL on 293T cells. n = 3, x ± s 4 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用促进细胞凋亡形态学变化 Hoechst 33342 荧光染色显示, 对照组的 A549 细胞核形态完整 0.003 μmol L 1 TRAIL 分别与薯蓣皂苷元 (10 及 20 μmol L 1 ) 合用后, 出现部分染色质浓缩 细胞核固缩或崩解 凋亡小体出现等典型的细胞

何 焱等: 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 49 凋亡特征, 随着药物浓度增加, 凋亡现象更为显著 (图 4) 5 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用促进细胞凋亡比率增加 经过 AnnexinV-FITC/PI 染色后, 利用流式细胞 仪检测可得到早期凋亡 中晚期凋亡 坏死和活细 胞比率 左下象限代表活细胞, 右下象限代表早期凋 亡细胞, 右上象限代表中晚期凋亡细胞, 左上象限代 表坏死细胞 (图 5) 薯蓣皂苷元 (10 μmol L 1) 作用 于 A549 细胞的凋亡诱导率为 (7.33 ± 0.33) %, TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 的凋亡诱导率为 (19.58 ± 1.57) %, 联合用药组的凋亡诱导率则为 (24.15 ± 1.41) %, 与 对照组凋亡诱导率 (7.79 ± 0.38) % 比较, 薯蓣皂苷元 Figure 6 The apoptosis ratio of A549 cell induced by diosgenin (10 μmol L 1) and TRAIL (0.003 μmol L 1). n = 3, x ± s. **P < 0.01, *** P < 0.001 vs control group; P < 0.05 vs TRAIL group 组没有显著差异, TRAIL 组 (P < 0.01) 和联合给药组 (P < 0.001) 有显著差异 同时, TRAIL 组与联合给药 Caspase-9 Bid Caspase-3 PARP Bcl-2 Bax 等凋 组比较有显著差异 (P < 0.05), 见图 6 亡相关蛋白的表达 薯蓣皂苷元单用组对蛋白表达没 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用对凋亡相关蛋白表达 有明显的影响; 但合用组与 TRAIL 单用组相比, PARP 的影响 为了进一步确定联合用药对于 A549 细胞凋亡 切割体明显增加, Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 的协同作用并探讨可能的机制 选取薯蓣皂苷元 (10 表达减少, 而 Bax 表达增加 (图 7) 同时, 与凋亡密 6 1 1 蛋白激活, 前体减少而切割体增加, Bid 和 Bcl-2 蛋白 μmol L ) 和 TRAIL (0.003 μmol L ) 单用及合用处 切相关的 MAPK 信号途径中 p38 JNK 和 ERK 在 理 A549 细胞 24 h 后, Western blotting 检测 Caspase-8 TRAIL 单用和与薯蓣皂苷元合用后明显激活 (图 8) Figure 4 Combination of diosgenin and TRAIL induces A549 cell morphology change (Hoechst 33342, 40). A: Control; B: Diosgenin (10 μmol L 1); C: Diosgenin (20 μmol L 1); D: TRAIL (0.003 μmol L 1); E: Diosgenin (10 μmol L 1) + TRAIL (0.003 μmol L 1); F: Diosgenin (20 μmol L 1) + TRAIL (0.003 μmol L 1) Figure 5 Combination of diosgenin and TRAIL induces A549 cell apoptosis. (0.003 μmol L 1); D: Diosgenin (10 μmol L 1) + TRAIL (0.003 μmol L 1) A: Control; B: Diosgenin (10 μmol L 1); C: TRAIL

50 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): 45 51 Figure 7 Effect of combination of diosgenin (10 μmol L 1 ) and TRAIL (0.003 μmol L 1 ) on expression of apoptosis-associated proteins Figure 8 proteins Effect of combination of diosgenin (10 μmol L 1 ) and TRAIL (0.003 μmol L 1 ) on expression of MAPK signaling pathway 讨论 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL 是一种 能够诱导多种肿瘤细胞凋亡的细胞因子, 属肿瘤坏 死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 超家族成员, 具 有 Ⅱ 型跨膜蛋白的结构特点 [2] TRAIL 通过与多种膜 蛋白受体结合而发挥抗癌作用 现有实验研究表明,

何焱等 : 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 51 TRAIL 可诱导多种肿瘤细胞包括肠癌 乳腺癌 黑色素瘤 肺癌 肾癌 白血病和皮肤癌等发生凋亡, 但是对于正常组织并不敏感 由于 TRAIL 对不同肿瘤细胞的敏感性不同, 再加上 TRAIL 在使用中容易产生耐药性, 因而增强 TRAIL 诱导不同肿瘤细胞凋亡的敏感性, 使这一安全的特异性抗肿瘤药物更好地应用于临床治疗尤为重要 薯蓣皂苷元具有良好抗癌活性, 可通过干扰细胞膜装配 抑制炎症反应 诱导细胞凋亡 阻断细胞周期等多种途径发挥抗肿瘤效果 [3] 对于死亡率在世界范围内居恶性肿瘤之首的肺癌, 进行薯蓣皂苷元 与 TRAIL 的联合应用以更好地发挥两者的抗癌效果, 为肺癌提供新的临床治疗策略 本研究首先采用中效原理评价薯蓣皂苷元与 TRAIL 的联合应用效应 实验结果显示, 薯蓣皂苷元 与 TRAIL 合用抑制 A549 细胞增殖属于协同作用 同时 MTT 实验结果也进一步表明, TRAIL 能够显著 降低薯蓣皂苷元对 A549 细胞的 IC 50 但对于正常细 胞没有出现相似的协同抑制效应, 表明 TRAIL 和薯 蓣皂苷元合用对癌细胞的选择性较好 Hoechst 33342 染色及流式细胞术检测证实, 两药合用可协同诱导 细胞凋亡 为了进一步探讨薯蓣皂苷元与 TRAIL 在 A549 细胞上的合用效应及其可能的协同机制, 检测了凋 亡相关蛋白的表达 外源性死亡受体途径和内源性线 粒体途径相关的蛋白 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 前体减少, 切割体增加, 合用后效果更为明显, PARP 切割增加, Bid 表达量减少 肺癌细胞中高表达的凋 亡相关蛋白 Bcl-2, 合用之后表达量减少, 而 Bax 表 达增加 结果说明, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 协同的增 殖抑制机制与协同诱导细胞凋亡相关, 并且很可能 与内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径都有关 另外, 还对与凋亡密切相关的 MAPK 信号途径也进 行了研究, TRAIL 单用或两药合用均导致 MAPK 信 号途径中的 p38 JNK ERK 明显激活 在本研究中, 蛋白表达水平上由于薯蓣皂苷元用药浓度较低, 因 此未在结果中发现薯蓣皂苷元对蛋白表达的影响 已 知薯蓣皂苷元可以增加 p38 的激活, 但对 ERK 和 JNK 的激活没有影响 [6] 这提示薯蓣皂苷元与 TRAIL [6, 7] 合用还与激活 MAPK 信号途径有关 综合文献和 实验结果, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用协同诱导肿瘤 细胞凋亡的机制可能与内源性线粒体途径 外源性死 亡受体途径以及 MAPK 信号途径均有关 ( 图 9) 本研究表明, 在体外实验中, 对于非小细胞肺癌 Figure 9 Proposed mechanism of combination of diosgenin and TRAIL A549 细胞, 薯蓣皂苷元与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL 能够协同抑制细胞增殖, 诱导细胞凋亡, 协同机制与线粒体途径和死亡受体途径以及 MAPK 信号途径有关 但对于正常细胞没有出现相似的协同抑制效应, 提示薯蓣皂苷元与 TRAIL 联合使用可能是治疗非小细胞肺癌的新策略 对于动物实验以及临床试验有待于进一步的研究 References [1] Yang J, Chen SZ. Synergistic effect and its possible mechanisms of lidamycin in combination with TRAIL in NSCLC [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2010, 45: 1247 1253. [2] Chen SZ. Progress on targeting TRAIL s receptor as antitumor strategy [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2009, 44: 1336 1342. [3] Raju J, Mehta R. Cancer chemopreventive and therapeutic effects of diosgenin, a food saponin [J]. Nutr Cancer, 2009, 61: 27 35. [4] Cao L, Du P, Jiang SH, et al. Enhancement of the antitumor properties of TRAIL by its targeted delivery to the tumor neovasculature [J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7: 851 861. [5] Chou TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method [J]. Cancer Res, 2010, 70: 440 446. [6] Lepage C, Léger DY, Bertrand J, et al. Diosgenin induces death receptor-5 through activation of p38 pathway and promotes TRAIL-induced apoptosis in colon cancer cells [J]. Cancer Lett, 2011, 301: 193 202. [7] Szliszka E, Czuba ZP, Bronikowska J, et al. Ethanolic extract of propolis augments TRAIL-induced apoptotic death in prostate cancer cells [J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2011, 2011: 535172.