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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 131 135 131 研究简报 黄癸素诱导三阴性乳腺癌 MDA-MB-231 细胞凋亡的研究 唐建武, 林 * 菁 ( 福建医科大学药学院, 福建福州 350108) 关键词 : 黄癸素 ; MDA-MB-231 细胞 ; 增殖抑制 ; 细胞凋亡 ; PARP; caspase 中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2014) 01-0131-05 Apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by berberine α-hydroxy β-decanoylethyl sulfonate TANG Jian-wu, LIN Jing * (School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China ) Abstract: To investigate the cell proliferation inhibition and apoptosis induced by berberine α-hydroxy β-decanoylethyl sulfonate (HB) on MDA-MB-231 cells in vitro, and the inhibitory effect of HB on the expression of poly adenosine diphosphate RNA polymerase (PARP), MTT assay was used to detect the viability of MDA- MB-231 cells and cell cycle was examined by flow cytometry. The results showed that HB could significantly inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells, and mildly arrested cell cycle progression at S phase. The IC 50 s for 24, 48 and 72 h treatment were 4.65, 1.46 and 0.75 mg L 1 (7.55, 2.37 and 1.22 μmol L 1 ), respectively. Annexin V-FITC/PI double staining assay showed that HB increased apoptotic ratio of MDA-MB-231 cells. Western blotting analysis showed the expressions of procaspase-3, procaspase-9 and PARP were decreased after HB treatment, while their fragment increased. The results suggest that HB can inhibit the growth and induce apoptosis of MDA-MB-231 cells, which may be associated with inhibition of the expression of procaspase-3, procaspase-9 and PARP. Key words: berberine α-hydroxy β-decanoylethyl sulfonate; MDA-MB-231 cell; proliferation inhibition; apoptosis; PARP; caspase 三阴性乳腺癌 (triple negative breast cancer, TNBC) 指雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 孕激 素受体 (progesterone receptor, PR) 和人类表皮生长因 子受体 -2 (human epidermal growth factor receptor-2, Her-2) 均为阴性表达的乳腺癌, 多发生于绝经前的 年轻女性 由于此类型乳腺癌缺乏有效的内分泌治疗 和抗 Her-2/neu 靶向治疗手段, 临床上大多采用常规 治疗, 其具有局部复发 远处转移快和死亡率高等特 点 TNBC 是乳腺癌中较为特殊的一种亚型, 这也决 收稿日期 : 2013-05-10; 修回日期 : 2013-07-09. * 通讯作者 Tel: 86-591-22860695, Fax: 86-591-22862587, E-mail: yq509@163.com 定了 TNBC 治疗的复杂性, 需要进一步对其特征进行研究以寻找更为有效的治疗方法 [1] 近年来, 中草药与多靶点药物研究成为抗肿瘤药研究的新方向, 也为抗肿瘤药物提供了一种新思路 黄癸素 (berberine α-hydroxy β-decanoylethyl sulfonate, HB) 是由盐酸小檗碱和新鱼腥草素钠通过离子配对形成的新化合物, 脂溶性高于盐酸小檗碱 [2] 前期研究发现, HB 对小鼠移植性肿瘤 人癌细胞裸鼠移植瘤具有抑制作用, 对多种肿瘤细胞的体外抑制作用与盐酸小檗碱相似, [3, 可诱导肿瘤细胞凋亡 抑制肿瘤转移 4] 对三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的初步实验显示, HB 对其具有明显的抑制作用 本研究通过体外实验, 考察

132 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 131 135 HB 对 MDA-MB-231 细胞增殖 凋亡的影响, 并对其 作用机制进行初步探讨 材料与方法 实验药物黄癸素 (HB) 为黄色粉末, 纯度 98%, 批号 Z09, 由湖南省中医药研究院贾本真教授提供 用 2% 丙二醇配成 10 mg ml 1 的母液, 过滤除菌, 4 保 存, 用前以细胞培养液稀释 主要试剂 L-15 培养基 胰蛋白酶 ( 美国 Gibco 公司 ); 四甲基偶氮唑盐 (MTT, 美国 Amresco 公司 ); 胎牛血清 ( 美国 Thermo 公司 ); Annexin V-FITC/PI 双 染试剂盒 ( 美国 Roche 公司 ); PARP 及 Cleaved PARP 抗体 ( 美国 Cell Signaling 公司 ); β-actin 抗体 ( 美国 Santa Cruz 公司 ); 二甲基亚砜 (DMSO, 广东省汕头 西陇化工股份有限公司 ) 主要仪器 Multiskan FC 型酶标仪 ( 美国 Thermo 公司 ); Image station 4000mm PRO 图像工作 站 ( 美国 Kodak 公司 ); Cytomics TM FC 500 型流式细 胞仪 ( 美国 Beckman Coulter 公司 ); DYY-11B 型三恒 电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ) 细胞培养取 MDA-MB-231 细胞 ( 购于上海中国 科学院细胞库 ), 采用 L-15 培养基, 含 10% 胎牛血清 100 u ml 1 青霉素和 100 mg L 1 链霉素, 置 37 5% CO 2 饱和湿度的培养箱常规培养, 以 0.25% 胰酶消化 传代 实验采用传代后 3 天处于指数增殖期的细胞 MTT 法检测肿瘤细胞增殖 收集对数生长期的 细胞, 用完全培养液制备成单细胞悬液, 接种于 96 孔板 ( 细胞数 1.2 10 4 / 孔 ), 置 CO 2 培养箱过夜 设置 阴性对照组和不同浓度 HB 处理组 ( 以最高浓度 25 mg L 1 倍比稀释 7 个浓度 ), 每组设 4~5 个复孔, 培 养 48 h 按常规加 MTT (5 g L 1 ) 20 μl 溶液处理, 作 用 4 h 后除去上清液并添加 DMSO 100 μl 溶解反应 产物, 使用酶标仪于 570 nm 波长处测定吸光度 (A) 值 计算细胞抑制率, 抑制率 = (1 药物组 A 570 / 对照 组 A 570 ) 100%, 实验重复多次, 按中效法原理计算 IC 50 值 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的细 胞, 胰酶消化 重悬为单细胞悬液, 接种于 6 孔板 ( 细胞数 5 10 5 / 孔 ), 不同浓度 HB (0 2.4 1.2 及 0.6 mg L 1 ) 作用 24 h 后收集细胞, PBS 洗 2 次, 4 预冷 的 75% 乙醇固定过夜 每个样品加入 PI ( 终质量浓度 为 10 mg L 1 ) 10 μl, RNase A ( 终质量浓度为 50 mg L 1 ) 50 μl 及 PBS 340 μl, 混匀, 37 避光孵育 30 min 后 用流式细胞仪测定荧光强度 Annexin V-FITC/PI 双染色法检测细胞凋亡率取对数生长期的细胞, 胰酶消化 重悬为单细胞悬液, 接种于 6 孔板 ( 细胞数 5 10 5 / 孔 ), 不同浓度 HB (0 2.4 1.2 及 0.6 mg L 1 ) 作用 24 h 后收集细胞, PBS 洗 2 次, 按照试剂盒说明书方法将细胞重悬于 100 μl 的含 AnnexinV-FITC 和 PI 的缓冲液中, 室温避光孵育 15 min 用流式细胞仪检测细胞凋亡率 Western blotting 检测凋亡相关蛋白表达量收集经不同浓度 HB (0 2.4 1.2 及 0.6 mg L 1 ) 处理 24 h 后的细胞, PBS 洗 2 次, 置于冰上, 加入预冷的 RIPA 裂解液, 混匀, 冰上孵育 30 min, 10 000 g 离心 10 min, 取上清液 取蛋白 50 μg, 以 8%~12% 的 SDS- PAGE 电泳, 常规转膜, 室温 5% 脱脂奶粉封闭 2 h, PBS 洗 3 次, 加入 1 1 000 稀释的一抗 (procaspase-3 procaspase-9 cleaved caspase-3 cleaved caspase-9 兔抗人 PARP 或 cleaved PARP 抗体 ) 室温孵育 2 h, 经 PBS 充分洗涤后, 再与 1 2 000 稀释的相应二抗室温反应 1 h, 充分洗涤后, 经化学发光试剂盒检测 [5] 用 KODAK Image Station 4000MM pro 对胶片进行扫描, 并用其配套的 Molecular Imaging 软件进行灰度分析 统计学分析数据资料以 x ± s 表示 用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理, Excel 软件进行作图 两组间均数比较采用 t 检验, 相关性计算采用线性回归分析 结果 1 黄癸素对 MDA-MB-231 细胞增殖的影响 HB 分别作用 24 48 72 h 后, 对细胞的 IC 50 分别为 4.65 1.46 和 0.75 mg L 1 ( 相当于 7.55 2.37 和 1.22 μmol L 1, 图 1), 药物浓度与细胞抑制率相关系数分别为 0.784 0.898 和 0.971, 表现为明显的浓度依赖性和时间依赖性抑制作用 Figure 1 Effect of HB on the inhibitory ratio of MDA-MB-231 cells detected by MTT assay

唐建武等 : 黄癸素诱导三阴性乳腺癌 MDA-MB-231 细胞凋亡的研究 133 2 黄癸素对 MDA-MB-231 细胞周期的影响用流式细胞仪检测各实验组的细胞周期, 其结果如图 2 所示 细胞经 HB 作用 24 h 后, 大部分细胞被阻滞在 S 期, 与此同时 G 2 期细胞减少甚至消失, 0.6 1.2 及 2.4 mg L 1 浓度处理组 S 期细胞由对照组的 19.97% 分别提高至 20.22% 25.40% 和 39.17%, 而 G 2 期细胞则由对照组的 10.41% 分别下降至 1.91% 1.08% 和 0 3 黄癸素对 MDA-MB-231 细胞凋亡率的影响结果如图 3 所示, 细胞经 HB 作用 24 h 后, 凋亡率明显提高, 0.6 1.2 和 2.4 mg L 1 浓度处理组的细胞凋亡率由对照组的 2.6% 分别提高至 9.1% 31.5% 和 63.2%, 而正常细胞所占的比率由对照组的 83.0% 分 别降低到 76.5% 32.4% 和 10.3%, 浓度与凋亡率的相关系数为 0.988, 表现为明显的浓度依赖性诱导细胞凋亡作用 4 黄癸素对 MDA-MB-231 细胞内 PARP 活性的影响由图 4 可见, 随着 HB 浓度的增加, 细胞内 PARP 的表达量逐渐减少, 而其裂解片段 cleaved PARP 的表达量逐渐增加 ( 药物浓度与灰度值的相关系数分别为 0.962 和 0.906), 表现为明显的浓度依赖性抑制作用 图 5 显示, 随着 HB 浓度的增加, 细胞内 procaspase-3 和 procaspase-9 的表达量逐渐减少 ( 相关系数分别为 0.919 和 0.888); 而它们的裂解片段 cleaved caspase-3 cleaved caspase-9 的表达量逐渐增 Figure 2 Effect of HB on the cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells after 24 h treatment. 1: Control; 2: HB 0.6 mg L 1 ; 3: HB 1.2 mg L 1 ; 4: HB 2.4 mg L 1 Figure 3 Effect of HB on late apoptosis of MDA-MB-231 cells measured by flow cytometry. 1: Control; 2: HB 0.6 mg L 1 ; 3: HB 1.2 mg L 1 ; 4: HB 2.4 mg L 1

134 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 131 135 Figure 4 Effect of HB on expression of PARP detected by Western blotting Figure 5 Effect of HB on expression of caspase detected by Western blotting 加 ( 相关系数分别为 0.987 和 0.997); 结果表明, 活化 caspase 对 PARP 的剪切灭活导致其活性显著降低 讨论通过 MTT 检测发现, HB 对三阴性乳腺癌 MDA- MB-231 细胞增殖具有显著的抑制作用, 并可使细胞周期阻滞于 S 期 细胞凋亡相关实验表明, HB 可能通过激活 MDA-MB-231 细胞凋亡的内源性途径促进该细胞发生凋亡 细胞凋亡是一种主动过程, 它涉及一系列基因的激活 表达以及调控等作用 特异性诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤研究的靶点之一, 其途径分为外源性途径和内源性途径两种 内源性途径包括线 粒体释放凋亡酶激活因子, 活化 caspase-9 而后激活 caspase-3 启动细胞凋亡 [6] Caspase 与真核细胞凋亡密切相关, 并参与细胞的生长 分化与凋亡调节 当细胞凋亡启动时, 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (poly adenosine diphosphate RNA polymerase, PARP) 被 caspase-3 剪切成两个片段, 使其无法修复 DNA 损伤, 引起细胞凋亡 而 PARP 的作用是通过催化二磷酸腺苷核糖聚合物从异柠檬酸脱氢酶向靶蛋白的转移, 从而激活和召集重要的切除修复通路的因子, 达到 [7, 调节 DNA 修复的目的 8] PARP 抑制剂已经成为靶向治疗 TNBC 的一种重要选择 [9] 作者前期研究发现, HB 可诱导 B16 细胞凋亡, 出现染色质固缩 DNA ladder 罗丹明 123 染色荧光降

唐建武等 : 黄癸素诱导三阴性乳腺癌 MDA-MB-231 细胞凋亡的研究 135 低和 caspase-3 caspase-8 活性增强等相关表现 [3] 本研究首先对与细胞凋亡内源性途径密切相关的 PARP 进行考察, 结果显示 HB 对 PARP 有明显的抑制作用, 说明其可能诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡 进一步对 caspase 蛋白酶家族成员 caspase-9 和 caspase-3 的活化情况的研究结果显示, 随 HB 作用浓度升高, caspase-3 caspase-9 的活性裂解片段逐渐增多, 表明 HB 可能通过激活 caspase-9 和 caspase-3, 促进 PARP 的裂解失活, 抑制了 PARP 对 DNA 修复的作用, 从而诱导 MDA- MB-231 细胞产生凋亡 Annexin V-FITC/PI 双染色法检测显示, MDA-MB-231 细胞凋亡率明显升高 全世界每年约有 17 万的 TNBC 新增病例 [10] TNBC 由于具有侵袭性强 复发早 进展快 生存时间短等特点, 引起越来越多的重视 目前, 寻找新的 TNBC 治疗靶点成为国际上乳腺癌研究的一个新热点 同时, 多靶点治疗已经成为一种非常重要并且有效的抗肿瘤策略, 已有许多研究证明多靶点治疗对 TNBC 有更为明显的疗效 [11] 目前的靶向研究中, 抗血管生成与表皮生长因子受体 (epithelial growth factor receptor, EGFR) 被认为是重要靶点 [12] 作者对小檗碱另一衍生物 B-119 的研究发现, 其抑制血管内皮细胞的增殖 迁移和小管形成 [13], HB 也有类似作用且可抑制 Lewis 肺癌新生血管形成 减少 VEGF 和 MMP-9 因子表达, 提示 HB 可能对 TNBC 也有这方面作用, 即表现为多靶点作用 有关 HB 抑制 MDA-MB-231 细胞的分子机制还有待进一步研究 References [1] Ma Y, Lü XF, Zhang J. Progress in clinical features and treatment of triple negative breast cancer [J]. J Chin Oncol ( 肿瘤学杂志 ), 2011, 17: 331 334. [2] Jia BZ. The ion pair compound of berberine, it s preparation method and drugs with the compound inside: CN, 200510136655 [P]. 2007-07-04. [3] Lin J, Peng HY. Apoptosis of B16 melanoma cells induced by berberine α-hydroxy-β-decanoylethyl sulfonate [J]. Chin Pharmacol Bull ( 中国药理学通报 ), 2010, 26: 1630 1634. [4] Lin J, Wang X. The synergistic antitumor effects of berberine α-hydroxy-β-decanoylethyl sulfonate with hydroxycamptothecine and its effect on topoisomerase [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学 报 ), 2011, 46: 390 394. [5] Park JH, Kwak JH, Khoo JH, et al. Cytotoxic effects of triterpenoid saponins from Androsace umbellata against multidrug resistance (MDR) and non-mdr cells [J]. Arch Pharm Res, 2010, 33: 1175 1180. [6] Twomey C, McCarthy JV. Pathways of apoptosis and importance in development [J]. J Cell Mol Med, 2005, 9: 345 359. [7] Rouleau M, Patel A, Hendzel MJ, et al. PARP inhibition: PARP1 and beyond [J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10: 293 301. [8] Ferraris DV. Evolution of poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitors. From concept to clinic [J]. J Med Chem, 2010, 53: 4561 4584. [9] Finn RS, Lau A, Kalous O, et al. Preclinical activity of the PARP inhibitor AZD2281 in human breast cancer cell lines and in combination with DNA damaging agents [J]. Cancer Res, 2009, 69: 117S. [10] Anders CK, Carey LA. Biology, metastatic patterns, and treatment of patients with triple-negative breast cancer [J]. Clin Breast Cancer, 2009, 9 (Suppl 2): S73 S81. [11] Liu XE, Sun XD, Wang XJ. The anti-proliferative effect of nimotuzumab combined with cisplatin on triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 and its mechanism [J]. J Chin Oncol ( 肿瘤学杂志 ), 2011, 17: 678 681. [12] Li RH, Du CW, Zhang GJ. Targeted therapy for triplenegative breast cancer [J]. J Int Oncol, 2012, 39: 519 522. [13] Lin J, Qi H, Zhuang QK, et al. Effect of berberine derivate B-119 on inhibition of tumor and vascular endothelial cell proliferation [J]. J Fujian Med Univ ( 福建医科大学学报 ), 2012, 46: 95 99.