[ 关键词 ] 印度人参 ; 免疫低下小鼠 ;DNA 含量 ;NO 含量 ; 磷酸酶活性 ; 免疫作用 [ 中图分类号 ]R285.5 [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] (2008) 印度人参 Withaniasomnifera 是茄科睡茄属植物, 用于印度

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不马
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1 印度人参根提取物对免疫低下小鼠免疫功能的影响周才琼, 张雨 ( 西南大学食品科学学院, 重庆 ) [ 摘要 ] 目的 : 印度人参根提取物 (IRRE) 对免疫低下小鼠的免疫调节作用方法 : 给免疫低下小鼠灌胃印度人参根提取物 5,2 5,0 85g kg -1 体重, 观察其对免疫低下小鼠免疫功能的影响结果 : 印度人参根提取物可减缓由环磷酰胺引起的生长缓慢和脏器指数下降, 对小鼠迟发型变态反应和抗体生成细胞有增强作用, 在刀豆球蛋白 A(ConA) 刺激的淋巴细胞转化实验中, 印度人参根提取物各剂量组显著高于环磷酰胺组 (P<0 05) 各剂量组骨髓 DNA 含量血清一氧化氮 (NO) 含量显著高于空白组和环磷酰胺组, 但磷酸酶活性变化不大结论 : 印度人参根提取物对由环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬功能下降和脾脏损伤有一定恢复能力, 能有效保护环磷酰胺所导致的骨髓抑制作用 [ 收稿日期 ] [ 基金项目 ] 重庆市教委基础研究项目 (050207) [ 通讯作者 ] 周才琼,E mail:zhoucaiqiong@swu edu cn 2014

2 [ 关键词 ] 印度人参 ; 免疫低下小鼠 ;DNA 含量 ;NO 含量 ; 磷酸酶活性 ; 免疫作用 [ 中图分类号 ]R285.5 [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] (2008) 印度人参 Withaniasomnifera 是茄科睡茄属植物, 用于印度草医学已有 3000 多年的历史, 在印度长期以来都作为堕胎药抗生素壮阳药收敛剂通便剂利尿剂止痛剂和滋补剂使用近年来, 常被用于治疗支气管炎哮喘溃疡失眠老年痴呆焦虑帕金森症等 [1] 有研究报道, 印度人参根提取物具有增强免疫功能的作用 [2 3], 能显著降低用环磷酰胺引起的 Swis 白化病小鼠白细胞减少症 [4] 本研究探讨了印度人参根提取物对免疫低下小鼠的免疫调节作用 1 材料 1.1 动物昆明种小鼠,18~22g, 普通级, 合格证号豚鼠, 体重 450~500g 购自第三军医大学实验动物中心, 合格证号饲养室温度 (20±2), 湿度 65% ~80% 1.2 药物采用引种至重庆北碚西南大学农业综合开发实验室实验基地栽培的印度人参 3 月份播种, 常规管理, 当年 10 月底到 11 月收获,50 下烘干取过 40 目筛印度人参根按 1 10 加入 60% 乙醇 50 回流提取 48h, 共 2 次, 合并 2 次提取液, 减压浓缩得醇提物, 于 4 冰箱保存备用 1.3 试剂 2,4 二硝基氟苯 (DNFB); 环磷酰胺 (CP); 左旋咪唑 (LMS); 巴比妥酸 ; 巴比妥钠 ; 伴刀豆球蛋白 A(ConA); 噻唑蓝 (MTT); 绵羊红细胞 (SRBC);RPIM 1640 干粉培养基 (GIBCO 公司 ); 酸性磷酸酶试剂盒 ; 碱性磷酸酶试剂盒 ; 一氧化氮 (NO) 试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所 ) 主要配制试剂 [5 7] :Hank's 液 ;PBS 缓冲液 ;MTT (5g L -1 ) 液 ;Giemsa 染液 ;SA 缓冲液 ; 无血清 RP MI1640 培养液 ;ConA 液 ; 酸性异丙醇 ;DNFB 溶液 ( 现用现配 ) 1.4 仪器 SW -CJ-F 无菌工作台 ( 苏州安乐空气技术有限公司 );SZ-93 自动双重纯水蒸馏器 ( 上海沪西分析仪器厂 );XDS-1B 倒置显微镜 ( 重庆光电仪器有限公司 );MB-Ⅳ 酶标仪 ( 上海麦莎生物科技有限公司 );HH CP-TW 二氧化碳培养箱 ( 上海贺德实验设备有限公司 ) 2 方法 2.1 实验用血及制备鸡红细胞悬液制备 : 取鸡血置有玻璃珠的锥形瓶中, 一个方向充分摇动以脱纤维用生理盐水洗涤 2~3 次,2000r min -1 离心 10min, 去上清, 用生理盐水配成 20% 的鸡红细胞悬液,4 保存绵羊血 : 第三军医大学实验动物中心所喂养绵羊静脉取血, 将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中, 朝一个方向摇动以脱纤维, 置 4 冰箱保存备用, 可保存 2 周豚鼠血制备补体 : 豚鼠心脏采血, 及时分离血清, 使用前将 1mL 压积 SRBC 加入到 5mL 豚鼠血清中, 放 4 冰箱 30min, 经常振荡, 离心取上清, 分装小瓶,-70 保存用时以 (SA) 液按 1 10 稀释 [5 7] 2.2 免疫低下小鼠造模及给药小鼠 60 只, 雌雄各半, 称重编号, 采用随机数字法分成 6 组, 设正常组,CP 组,LMS 组和印度人参根提取物 (IRRE) 高中低剂量组 [8] 正常组每日生理盐水灌胃, 连续 15d;CP 组从第 1 天开始, 每天 1 次腹腔注射 CP(20 mg kg -1 ), 共注射 5 次 ;LMS 组除隔天 1 次腹腔注射 CP( 剂量同 CP 组, 共 5 次 ) 外, 每日用 LMS(20 mg kg -1 ) 灌胃给药, 连续 15d; 印度人参根提取物剂量组前 5d 每天注射 CP, 按照给药剂量 (5,2 5, 0 85g kg -1 ) 分别灌胃给药, 连续 15d [9] 2.3 脏器指数观察给小鼠称重并记录, 按剂量灌胃, 最后 1d 断头处死小鼠, 解剖取出肝脏胸腺脾脏和肾脏, 分别用生理盐水漂洗后滤纸吸干, 称重并计算脏器指数肝脏指数 (%)= 肝脏质量 (g)/ 体重 (g) 100% 脏器指数 = 脏器质量 (mg)/ 体重 (g) 2.4 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验 (MTT 法 ) 脾细胞悬液制备 : 无菌取脾, 研磨, 过 200 目筛网,PBS 液冲洗, 收集分离的脾细胞悬液,1500r min -1 离心 5~10min, 弃上清 ; 加红细胞裂解液 10mL, 混匀脾细胞, 静置 4~5min, 待红细胞完全破碎,1500r min -1 离心 10min, 弃上清去除红细胞, PBS 液洗 2~3 遍后将细胞悬浮于 1mL 完全培养液中, 台盼蓝染色计数活细胞数在 95% 以上, 调整细胞密度个 /ml 淋巴细胞增殖反应 : 将细胞悬液加入 96 孔细胞培养板, 每孔 100μL 每个实验组设 6 个复孔, 同时设对照孔 6 个, 分别加 ConA 液 50μL( 相当于

3 μg ml -1 ) 或 RPMI1640 培养液至终体积 200μL 置 5%CO 2,37 培养箱中培养 72h 培养结束前 4 h, 每孔加入 20μLMTT, 继续培养 4h 培养结束后,1000r min -1 离心 5min, 弃上清, 每孔加 100 μl 酸性异丙醇, 吹打均匀, 使紫色结晶完全溶解, 酶标仪 570nm 处测吸光度 (A) 淋巴细胞增殖活力用加 ConA 孔的 A 减去不加 ConA 孔的 A 表示 2.5 DNFB 诱导小鼠迟发型变态反应 (DTH) 灌胃至第 14 天时, 每鼠腹部用硫化钡脱毛约 3cm 2, 用 50μLDNFB 溶液均匀涂抹于右耳两面进行攻击, 攻击后 24h, 颈椎脱臼处死小鼠, 剪下左右耳片, 用打孔器取下 8mm 耳片称重用左右耳质量差表示 DTH 的程度 2.6 抗体生成细胞检测 (Jerne 改良玻片法 ) 取脱纤维绵羊血, 生理盐水洗涤 3 次, 每次离心 (2000r min -1 )10min, 计数细胞, 在第 10 天时每只鼠经腹腔注射用生理盐水配成 2% 的细胞悬液 0 2mL 将 SRBC 免疫 5d 后的小鼠颈椎脱臼处死, 取出脾脏, 放入盛有 Hanks 液的小平皿内, 轻轻撕碎脾脏, 制成细胞悬液, 经 200 目筛网过滤,1000r min -1 离心 10min, 用 Hanks 液洗 2 遍, 最后将细胞悬浮在 5mLRPMI1640 培养液中, 计数细胞, 调整细胞密度个 /ml 将表层培养基 (1g 琼脂加双蒸水至 100mL) 加热溶解后,45 水浴保温, 与等量 ph7 2~7 4,2 倍浓度的 Hanks 液混合, 分装小试管, 每管 0 5mL, 再向管内加 50μL10% SRBC(SA 液配制 ),20μL 脾细胞悬液 ( 个 /ml), 迅速混匀, 倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上, 待琼脂凝固后, 将玻片水平扣放在片架上, 放入 CO 2 培养箱中温育 1~1 5h, 然后用 SA 缓冲液稀释的补体按体积 (1 10) 加入到凹槽内, 继续温育 1~1 5h, 计数溶血空斑数 2.7 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验小鼠腹腔注射 20% 鸡红细胞悬液 1mL 间隔 30min, 颈椎脱臼处死动物, 仰位固定于鼠板, 正中剪开腹壁皮肤, 经腹腔注入生理盐水 2mL, 转动鼠板 1min 然后吸出腹腔洗液 1mL, 平均分滴于 2 片载玻片上, 放入垫有湿纱布的搪瓷盒内, 移入 37 孵箱温育 30min 孵毕, 生理盐水漂洗除去未贴片细胞晾干, 以丙酮甲醇 (1 1) 固定,4%Giemsa 磷酸缓冲液染色 3 min, 再用蒸馏水漂洗晾干, 上镜观察计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数 2016 吞噬率 (%)= 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 / 计数的巨噬细胞数 100% 吞噬指数 = 被吞噬的鸡红细胞总数 / 计数的巨噬细胞 2.8 血清酸碱性磷酸酶活性及 NO 含量测定摘除眼球取血, 室温下静置 10min 使血液凝固, 置 4 冰箱冷藏过夜, 使血清析出, 按试剂盒提供测定方法, 分别测定血清中酸碱性磷酸酶活性和 NO 含量 2.9 骨髓 DNA 含量测定取小鼠右侧股骨, 除净软组织, 用 0 005mol L -1 CaCl 2 10mL 将全部骨髓冲入离心管, 置 4 冰箱 30min,2500r min -1 离心 15min, 弃上清, 将沉淀物加入 0 2mol L -1 HClO 4 5mL,90 加热 15min, 冷却过滤, 滤液在 260nm 处测 A(1A 代表 50μm ml -1 双链 DNA) 2.10 数据处理实验结果采用软件包 SPSS12 0 进行统计处理同组样本前后比较采用配对 t 检验试验数据均以 x±s 珋表示 3 结果 3.1 根部乙醇提取物净重及得率准确称取 10 00g 实验材料, 按 1 2 实验方法所提取的乙醇提取物净重 2 38g, 得率为 23 8% 在印率人参根活性成分定性研究中, 显示根中含有机酸酚类水解鞣质及黄酮类, 内酯, 甾体及其苷类, 还有生物碱, 这几类成分的检查均为正反应 [10] 根的乙醇提取液可能含极性较高的苷元苷类, 生物碱盐类, 亲水性生物碱, 有机酸盐类及鞣质等成分 [11] 3.2 IRRE 对免疫抑制小鼠体重及脏器指数的影响小鼠注射 CP 后, 胸腺脾脏和肝脏指数均有不同程度下降, 表明 CP 可使小鼠上述器官萎缩 LMS 组脏器指数均高于空白组, 但无显著性差异印度人参根提取物各剂量组脏器指数均高于 CP 组, 其中高剂量组脾脏指数和胸腺指数显著高于空白组 (P<0 05), 说明 IRRE 对由 CP 引起的免疫器官及主要脏器的变化有一定保护作用见表 IRRE 对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响 IRRE 对 DNFB 诱导的小鼠迟发性变态反应结果, 高剂量组比 CP 组 LMS 组和空白组分别高 55 7%, 4 6%,9 1%, 表明 IRRE 对由 CP 造成的免疫低下模型的迟发型变态反应有增强作用见表 2 在 ConA 诱导淋巴细胞转化实验中,IRRE 各剂量组显著高于 CP 组 (P<0 05), 高剂量组显著高于空白组 (P<0 05) 提示 IRRE 对由 CP 造成的脾脏功能下降有一定恢复能力

4 表 1 印度人参根提取物对免疫抑制小鼠体重及脏器指数的影响 ( 珋 x±s) 剂量 /g kg -1 n 增重 /g 胸腺指数脾脏指数肝脏指数 /g g -1 肾脏指数空白 ± ± ± ± ±0 25 LMS ± ± ± ± ±0 04 CP ± ± ± ± ±0 05 IRRE ± ±0 03 1) 5 86±0 06 1,2) 6 24± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0 07 注 : 与空白组比 1) P<0 05; 与 CP 组比 2) P<0 05 表 2 IRRE 对免疫抑制小鼠 ConA 诱导淋巴细胞和迟发型变态反应耳肿胀度的影响 ( x±s) 珋剂量肿胀度 n A /g kg -1 /mg 空白 ± ±0 21 LMS ± ,4) 1 84±0 18 CP ± ±0 27 IRRE ± ,4) 2 74± ± ) 1 58± ± ) 1 29±0 30 注 : 与空白组比 1) P<0 05, 2) P<0 01; 与 CP 组比 3) P<0 05, 4) P<0 01( 表 3~5 同 ) 3.3 IRRE 对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响 CP 组溶血空斑数最低,LMS 组最高 ;IRRE 高中剂量组显著高于 CP 组 (P<0 05), 也高于空白组, 表明 IRRE 可对抗 CP 所致抗体生成细胞减少, 对由 CP 造成的脾脏损伤有一定恢复能力见表 3 表 3 印度人参根提取物对免疫抑制小鼠抗体生成细胞的影响 ( x±s) 珋剂量 /g kg -1 n 溶血空斑 /10-6 脾细胞空白 ±11 32 LMS ± ) CP ±15 31 IRRE ± ) ± ) ± ) 3.4 IRRE 对巨噬细胞吞噬功能的影响 CP 组巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数最低,LMS 组最高,IRRE 各剂量组较空白组均有一定提高, 高中剂量组显著高于 CP 组 (P<0 01), 提示 IRRE 对由 CP 造成的巨噬细胞吞噬功能下降有恢复作用见表 IRRE 对小鼠血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响 CP 组酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性最高, 分别高于空白组 98 4% 和 28 7% IRRE 各剂量组和 LMS 组的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性与空白组相比, 差异均无显著性意义 3.6 IRRE 对小鼠血清 NO 和骨髓 DNA 含量的影响 CP 组骨髓 DNA 含量最低, 提示 CP 呈明显的骨表 4 印度人参根提取物对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 ( x±s) 珋剂量吞噬率 n /g kg -1 /% 吞噬指数空白 ± ±0 013 LMS ±2 15 4) 0 39± ,4) CP ± ±0 014 IRRE ±1 57 1,4) 0 35± ,4) ±2 01 4) 0 33± ) ±1 53 3) 0 31±0 021 髓抑制作用 ;IRRE 各剂量组 DNA 含量均显著高于空白组和 CP 组 (P<0 01), 高剂量组高于 MLS 组, 表明 IRRE 对 CP 所致骨髓损伤具有一定的保护作用而 IRRE 各剂量组血清 NO 含量显著高于空白组和 CP 组 (P<0 01), 也高于 MLS 组见表 5 表 5 印度人参根乙醇提取物对免疫抑制小鼠骨髓 DNA 含量 (A) 及血清中 NO 含量的影响 ( 珋 x±s) 剂量 /g kg 1 n DNA NO /μmol L -1 空白 ± ±1 33 LMS ± ,4) 14 44±0 45 2,3) CP ± ±1 33 IRRE ± ,4,5) 20 28±1 11 2,4,6) ± ,4) 16 38±2 56 2,4) ± ,4) 15 27±1 67 2,3) 注 : 与 LMS 组比较 5) P<0 05, 6) P< 讨论印度人参含睡茄内酯生物碱睡茄醇有机酸及丰富的铁等, 根部生物碱主要是睡茄碱 (witha nine), 生物碱含量在 0 13% ~0 31% [12], 睡茄内酯含量在 0 019% ~0 484% [13] 有报道睡茄内酯类化合物具有免疫增强作用 [2,4] 磷酸酶是生物体内重要的解毒酶系, 并在生物体的骨化及在磷化物和其他一些营养物质的消化吸收和转运中起重要作用 [14] 其中, 酸性磷酸酶是巨噬细胞标志酶, 其活性的高低可反映巨噬细胞被激活的程度 [15] 本实验中 CP 组酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均高于其他各组, 可能是 CP 选择性杀灭 T 细胞, 而钙调神经磷酸酶对 T 细胞的活化具有 2017

5 调控作用, 当 T 细胞水平降低时, 机体会提高钙调神经磷酸酶的表达, 以增强 T 细胞的活化 [16 17] 活化的巨噬细胞可分泌多种生物活性物质, 如 NO,IL 1,TNF α 及活性氧等,NO 是巨噬细胞发挥细胞毒作用免疫调节作用及细胞内杀菌作用等方面的重要介质和始动因子, 参与一系列免疫调节作用 [15], 是机体抗感染防御体系中的一个重要因子, 而 NO 的增加可能是印度人参对免疫刺激的原因之一骨髓属一级免疫器官, 机体内所有血细胞 ( 包括巨噬细胞淋巴细胞肥大细胞等 ) 都能在骨髓中产生, 因此骨髓 DNA 含量的恢复能在某种程度上反映免疫功能的强弱 [18] 本研究发现 IRRE 可显著提高免疫低下小鼠骨髓 DNA 含量, 提示印度人参根提取物能有效保护生物体免疫体系, 明显提高小鼠的非特异性免疫功能 [ 参考文献 ] [1] DeviPU.Withaniasomniferadunal(ashwagandha):potential plantsourceofapromisingdrugforcancerchemotherapyandra dio sensitization[j].indianjexpbiol,1996,34:927. [2] DavisL,KutanG.ImmunomodulatoryactivityofWithaniasom nifera[j].jethnopharmacol,2000,71:193. [3] DavisL,KutanG.EfectofWithaniasomniferaonCTLactivity [J].JExpClinCancerRes,2002,21:115. [4] DavisL,KutanG.Suppresiveefectofcyclophosphamide in ducedtoxicitybywithaniasomniferaextractinmice[j].jeth nopharmacol,1998,62:209. [5] 薛彬. 免疫毒理学实验技术 [M]. 北京 : 北京医科大学. 中国协和医科大学联合出版社,1995. [6] 黄雨三. 保健食品检验与评价技术规范实施守则 [M]. 北京 : 清华同方电子出版社,2003. [7] MosmannT.Rapidcolorimetricasayforcelulargrowthandsur vival:applicationtoproliferationandcytotoxicityasays[j].j ImmunolMethods,1983,65:55. [8] 张宝勇. 引种新资源印度人参抗氧化作用研究 [D] 重庆 : 西南大学,2007:34. [9] 高凡, 钱嘉林, 刘长喜, 等. 环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立 [J]. 环境与职业医学,2004,21(4):314. [10] 周才琼, 周张章引种新资源印度人参的功能成分定性及睡茄内酯的分离鉴定 [J] 食品科学,2007,28(11):411 [11] 王宪楷天然药物化学 [M] 北京 : 人民卫生出版社,1988 [12] RastogiRP,MehrotraBN.Compendium ofindianmedicinal plants[j].centraldrugresearchinstitutenewdelhi,1998, 45. [13] RekhaSDhar,VijeshwarVerma,KrishanASuri,etal Phyto chemicalandgeneticanalysisinslectedchemotypesofwithania somnifera[j].phytochemistry,2006,67:2269 [14] HeHai qi,sunfeng.studyonthecharacteristicsofacidandal kalinephosphatasesinchineseshrimp,penaeuschinensis[j]. OceanologiaEtLimnologiaSinica,1992,23(5):555. [15] 定天明, 陈坚, 张正行. 生物体内一氧化氮的检测方法及其应用 [J]. 药学进展,2005,29(5):221. [16] 胡清龙. 低剂量环磷酰胺对抑制性 T 细胞的选择性作用 [J]. 国外医学肿瘤学分册,1985,(6):346. [17] 陈燕. 钙调神经细胞磷酸酶和 NFAT 在 T 细胞活化中的作用 [J]. 国外医学免疫学分册,1999,22(4):225. [18] 嵇扬, 王亚南. 桔梗水提取液对小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮的影响 [J]. 中医药研究,2000,16(5):43. ImmunomodulatoryefectofIndianginsengrootextractonimmunodeficiencymice ZHOUCai qiong,zhangyu (FoodScienceColege,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China) [Abstract] Objctive:ToinvestigatetheimmunoregulationactionofIndianginsengrootextract(IRRE)inimmunodeficiency mice.method:immunodeficiencymicewerefedirrewithdosesof5,2.5,0.85g kg -1 for15daysbeforetheirimmunefunction wereobserved.result:irrecouldrelieveretardedgrowthandvisceraindexdropofmiceinducedbycp,couldheightentheresponse ofdelayedhypersensitivityandtheamountofantibodyinserum.theproliferationofcona inducedmitogenicresponseforspleenlym phocytewerealsoincreased,comparedwiththecpgroup(p<0.05).irrecouldenhancethecontentofmarowdnaandnoofse rumwithnochangeofacidphosphataseandalkalinityphosphatase.conclusion:irrecouldenhancethephagocytosisofceliacmac rophage,protectthespleenfromdamageandimprovemarowinhibitioninimmunodeficiencymice. [Keywords] Indianginseng;immunodeficiencymice;DNAcontent;NOcontent;activityofphosphatase;immunomodulatory efect [ 责任编辑古云侠 ] 2018

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Microsoft Word - 26李成-161 安徽农业大学学报, 2018, 45(1): 161-165 Journal of Anhui Agricultural University [DOI] 10.13610/j.cnki.1672-352x.20180302.007 网络出版时间 :2018/3/2 9:34:23 [URL] http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20180302.0934.014.html