世界血友病联盟 (WFH) 出版 世界血友病联盟, 2010 WFH 鼓励非营利性血友病的组织颁发用于教育的 WFH 的出版物 如需获得再版或翻译本出版物, 请通过下列地址与通讯部联系 可从世界血友病联盟的网站 下载本出版物 也可通过下列联系方式获得其他出版物 : World

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1 血友病和其它出血性疾病诊断 实验室手册第二版 Steve Kitchen Angus McCraw Marión Echenagucia

2 世界血友病联盟 (WFH) 出版 世界血友病联盟, 2010 WFH 鼓励非营利性血友病的组织颁发用于教育的 WFH 的出版物 如需获得再版或翻译本出版物, 请通过下列地址与通讯部联系 可从世界血友病联盟的网站 下载本出版物 也可通过下列联系方式获得其他出版物 : World Federation of Hemophilia 1425 René Lévesque Boulevard West, Suite 1010 Montréal, Québec H3G 1T7 CANADA Tel.: (514) Fax: (514) wfh@wfh.org Internet:

3 血友病和其它出血性疾病诊断实验室手册第二版 Steve Kitchen WFH Laboratory Training Specialist Sheffield Haemophilia and Thrombosis Centre Royal Hallamshire Hospital Sheffield, U.K. Angus McCraw WFH Laboratory Training Specialist Katharine Dormandy Haemophilia Centre and Thrombosis Unit The Royal Free Hospital London, U.K. Marión Echenagucia (co-author, Automation) Banco Municipal de Sangre del D.C. Universidad Central de Venezuela Caracas, Venezuela 责任 WFH 实验室科学委员会主席 (2010 年 ):Steve Kitchen, Sheffield, U.K. 副主席 :Sukesh Nair, Vellore, India 此版本经下列人员审核, 在编写本手册时他们为世界血友病联盟实验室科学委员会成员 : Mansoor Ahmed Clarence Lam Norma de Bosch Sukesh Nair Ampaiwan Chuansumrit Alison Street Marión Echenagucia Alok Srivastava Andreas Hillarp 其中部分章节又得到了世界血友病联盟血管性血友病和罕见出血性疾病委员会成员的审核 致谢 : 本文中介绍的几种方法以谢菲尔德血友病中心 Annette Bowyer 起草的实验室标准操作规程为基础 因此, 在此对其贡献表示感谢 本书作者及 WFH 衷心感谢王学锋教授, 丁秋兰和戴菁医生 ( 上海交通大学医学院附属瑞金医院 ) 对该书中文翻译版本的认真校准 警示事项 : 如果本手册涉及商业来源的数据, 编写时仅作为示例 并不代表世界血友病联盟 (WFH), 作者或 WFH 实验室科学委员会给予了认可 也决不表示其它来源不可靠或不合适 实验室测试中提供材料的制造商可能已改变材料的成分 因此, 在编写时涉及的商业来源在将来是否可靠并不清楚 作者联系信息 steve.kitchen@sth.nhs.uk amccraw@nhs.net

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5 目录 1. 实验室设备 移液枪和称重天平的校准 实验室安全 样本采集和分析前变量 室内质量控制和室间质量评估 手动倾斜试管技术 正常混合血浆 (PNP) 的制备和校准 建立正常参考范围 试剂 血小板计数 出血时间 凝血酶原时间 (PT) 活化部分凝血活酶时间 (APTT) 异常 PT 和 APTT 进一步研究的混合检测 凝血酶时间 鱼精蛋白硫酸中和凝血酶时间检测肝素 爬虫酶时间 纤维蛋白原 ( 改良的 CLAUSS 检测法 ) 血浆中肝素的去除 纤维蛋白原抗原检测 放射状免疫扩散法 (RID) 凝血因子 XIII 筛查 凝血因子 II, V, VII 或 X 活性检测 基于 PT 法... 56

6 2 3. FVIII:C, FIX, FXI 或 FXII 一步法检测 基于 APTT 冷沉淀中的凝血因子 VIII:C 检测 凝血因子 VIII:C 的两步法凝血检测 两步法因子 FVIII:C 检测所用的混合试剂的制备 发色底物法 FVIII:C 的检测 内源性凝血途径一步法检测激肽释放酶原 (PKK) 和高分子量激肽原 (HMWK) 基于 APTT 的凝血因子抑制物筛查 瑞斯托霉素辅因子活性 / 血管性血友病因子活性 (VWF:RCo 或 VWF:Act) 固定血小板制备 ELISA 法检测血管性血友病因子抗原 (vwf:ag) 血管性血友病因子胶原结合试验 (VWF:CB) 凝血因子 VIII 结合试验诊断 NORMANDY 型血管性假血友病 VWF 多聚体分析 FVIII 抑制物的定量检测 因子 IX 抑制物检测 凝血因子 XIII 活性检测 狼疮抗凝物与抗磷脂抗体 稀释蝰蛇毒素时间 (DRVVT) DRVVT 所用洗涤血小板的制备 血小板功能测试 血块收缩 血小板聚集试验 冻干血浆 血凝仪的评估和使用 分子遗传分析

7 实验室设备 1 使用本手册中所述部分或所有技术来诊治出血性疾病的实验室均需要具有基本的设 备 注 : 半自动和全自动血凝仪参照第 41 节所述进行评价和使用 基本设备 : y 储存试剂的 4 C 冰箱 1 台 除非制造商另有说明, 试剂通常保持在 2 C 8 C 冰箱需符合国家级质量标准 y 至少 -35 C 低温冰箱 1 台 对于更长时间的储存, 更低的温度是有益的, 例如 :-70 C 凝血因子在此温度下 可至少稳定六个月 (Woodhams 等. 2001) 对于止血检测所用的血浆和试剂,-20 C 的冷冻柜一般尚不能达到储存要求 具有周期性自动除霜功能的冷冻柜不符合要求 y 调解后温度维持在 37 C ± 0.5 C 的水浴箱 1 台或多台 干热仪可能适合, 也可能不适合, 这取决于仪器情况 通常, 水浴器可较好保持 温度 ph 值测量仪 1 个 光源灯 1 个 ( 例如,Anglepoise 灯 ) 秒表 1 只或多只 y 校准过的能精准地转移 0 µl 200 µl 和 1000 µl 之内样品和试剂的自动移液器数个, 请务必检查移液器的精确度 ( 参见第 2 节 ) 校准过的用于转移少于 5 ml 液体的移液器 1 个 y 可产生至少 1700 g 力的离心机 1 台 对于大多数凝血分析, 在室温下 (20 C 25 C) 离心是可以接受的 ( 在有些方法 中, 建议使用 2500 g,4 C 条件下离心 ) y 能准确测量到克小数点后三位的校准后分析称 / 天平 1 台 参见第 2 节的准确性检查程序 有些检测需要的其它设备, 包括 : 酶联免疫吸附技术 (ELISA) 检测所需微孔板阅读器 1 台 实验室设备 1

8 血小板聚集仪 1 台 特定方法表上指定的设备 在温度较高国家, 每个房间配备空调系统是一个非常有利的条件 消耗品供给应充足 应避免重复使用洗涤后的实验检测试管和移液器吸嘴, 因为残 留物质可对结果有不利影响, 从而造成试剂和时间的浪费 参考文献 Woodhams B, Girardot O, Blanco MJ, Colesse G, and Gourmelin Y. Stability of coagulation proteins in frozen plasma. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: 血友病和其它出血性疾病诊断

9 移液枪和称重天平的校准 2 为了帮助质量管理, 应每隔 3 至 6 个月校准一次天平和移液枪容量 如果仪器校准 失败, 应立即停止使用, 直到重新校准好后再使用 所有移液枪都应有唯一的标识 检查移液枪标度的方法 1 移液枪可能为一种 两种或三种容量, 也可有连续的容量范围 有一个或两个固定设定值的移液器, 则对每个设定值进行校准 有三个固定设定值的移液枪, 则对最小和最大设定值进行校准 对于有连续范围容量设定值的移液枪, 校准最大设定值以及最大设定值的 25% 的容量 即 : 10 ml 移液枪 10 ml 和 2.5 ml 5 ml 移液枪 5 ml 和 1.25 ml 1 ml 移液枪 1 ml (1000 µl) 和 0.25 ml (250 µl) 0.2 ml 移液枪 0.2 ml (200 µl) 和 0.05 ml (50 µl) 0.1 ml 移液枪 0.1 ml (100 µl) 和 ml (25 µl) 50 µl 移液枪 50 µl 和 15 µl 2 通过在天平上对五次重复相同容量的蒸馏水 ( 室温 ) 称重来检查校准 每次重量 都以克记录 ( 精确到小数点后三位 ) ml 重量为 g 结果 结果和所采取的任何行动均应予以记录 当所吸平均容量与实际容量误差超过 10% 表明移液枪不准确, 必须立即停止使用, 直至按照制造商的说明重新校准后方可再使用 移液器最好精确到误差小于 10% 注 : 如果移液枪误差超过以下限值 ( 平均重量 ), 则必须立即停止使用 移液枪和称重天平的校准 3

10 y 10 ml 移液枪 10 ml: g g 2.5 ml: g g y 5 ml 移液枪 5 ml: g g 1.25 ml: g g y 1 ml 移液枪 1 ml: g g 0.25 ml: g g y 0.2 ml 移液枪 0.2 ml: g g 0.05 ml: g g y 0.1 ml 移液枪 0.1 ml: g g 025 ml: g g y 50 µl 移液枪 50 µl: g g 15 µl: g g 检查天平的方法 为了确保其精确性, 已校准后的重物每隔 6 个月称重一次, 并记录重量值 1 将天平归零 2 称重三个校准后的重量, 每次一个 记录重量, 精确到小数点后三位 ( 例 如 :1.003 g) 3 如果任何重量超出规定限值 (> 2%), 在问题得到纠正之前不可使用 4 血友病和其它出血性疾病诊断

11 实验室安全 3 处理化学品和生物样本的实验室是存在潜在危险的地方 出于健康和环境原因, 近年来, 业界越来越认识到安全操作规范的重要性 这种意识使安全文件记录 员工培训和风险评估等问题备受重视 单位责任人有责任提供必要的防护服装和设备, 并需提供关于安全操作规范的培训 如果安全操作规范到位, 对自己 同事和民众导致严重伤害的概率将大大降低 安全专员 每个部门必须要任命一名或多名安全专员 这些专员负责介绍和维护安全规程 然 而, 保证安全是实验室全体工作人员的责任 安全手册 应该要有一个全面的安全手册, 涵盖整个部门安全操作规范的方方面面 全体工作人员必须阅读该手册并签署一份声明, 表明他们已经理解手册内容 副本应由安全专员保管, 还应该放置副本于所有工作人员容易拿到的地方 安全措施 : 全面防护措施 全面防护措施系统要求, 应通过良好操作规范来避免或最大程度地降低任何来源的感染危险 所有血液样本 血液制品 ( 包括血浆试剂和试剂盒 ) 以及其他人体标本应视为潜在感染危险 处理任何材料时, 都要采用最充分的防护措施 不要进行其它风险分类 血液之外的所有体液和材料, 无论是为了测试而采集或放入设备, 还是为了任何其它目的, 均应如处理血液时一样小心 实验室实验室应始终保持清洁整齐 文字工作区应与实验室测试区分开 尽量不要在实验 室存储大件物品 尽量确保人人都参与维护实验室整洁 实验室安全 5

12 防护服每个人 ( 包括访客 ) 在进入实验室时, 均应穿上实验室工作服 如果工作服受到污 染, 应立即更换 一次性手套很多人不喜欢使用手套, 但实验室处理的样本均有潜在危险 在处理有毒材料时应 始终戴手套 手套和工作服显然不能防止针扎意外, 但可防止 HIV 阳性血清或毒素与您皮肤上的 任何伤口或创口接触 如果手套破裂或被刺破, 务必立即更换 眼部清洗许多种感染很容易通过眼睛粘膜接触而感染 如果可能感染您眼睛的材料进入眼内, 请立即用大量冷流水冲洗 利器利器 ( 如 : 针头和碎玻璃 ) 有很大的危险, 请使用可容纳利器而不被刺破的容器盛放 曾有工作人员因针扎受伤而感染的案例 气溶胶避免在可能发生微滴或尘埃在空气中飞溅或溢泄的开放型实验室进行任何操作 产生气溶胶的操作必须在通风橱中进行, 并佩戴安全眼镜 全部溢出物应立即用漂白剂清理, 必要时使用中和剂 有毒和易燃物质有毒或易燃物质必须放在通风橱或适当的安全箱中 电子设备对于接触液体的电子设备, 如电泳槽和水浴器, 应特别小心 务必请合格人员对设备进行安装 维护和修理 个人物品和实验室行为切勿将个人物品 ( 如 : 钢笔 包和梳子 ) 带入实验室 在实验室时, 避免双手与脸部或黏膜 ( 眼睛 鼻子和嘴 ) 接触, 如果必须要这样做, 请一定要事先洗手 6 血友病和其它出血性疾病诊断

13 禁止将食品 香烟和化妆品带入实验室 禁止用嘴吸移液器 在离开实验室之前要彻底洗净双手 意外事件所有意外事件应立即报告, 并在安全部门保存的意外事故登记本中记录 尤其是针刺伤一定要记录 在这些情况下, 请遵照当地医院体系进行记录和报告, 并且遵从当地医院的建议和要求 危害健康物质控制法 (COSHH) 英国实验室使用的这项法律是确定风险和危害性方面的有用指南 危害和风险物质带来的危害是指其潜在的伤害 该物质的风险是指其可能伤害在现行条件下使用该物质的人员 危害识别危害识别是风险评估的必要先决条件 不同的物质, 认识其危害性所需时间不同 风险评估请考虑下列实际情况 : 危害性 使用条件 使用量 可能的接触途径或部位 ( 吸入 食入 皮肤或眼睛 ) 风险评估的结果由下列因素确定 : 贮存条件 处理程序 丢弃程序 监测和卫生监督要求 应急程序 风险评估必须每年审核, 并在必要时更新 实验室安全 7

14 参见下图 3.1 和 3.2, 如何使用 COSHH 程序记录风险评估信息的实例 此表描述的是确定特定程序中使用设备相关的危害及控制措施 只有能胜任的人才能 执行相关程序, 并且只有在阅读了相关的健康和安全文件后才可执行该程序 图 3.1. PT 和 APTT 为基础的凝血因子检测 COSHH COSHH 参考号检测 1 实验室参考一步法 II, V, VII, VIII, IX, X, XI 和 XII 检测 程序 / 实验名称 : 物质大致量确定危害 咪唑缓冲液, 包括 ( 参见 ** ) <5 ml 如果食入, 则有害 ** 咪唑 3.4 g/l 具有腐蚀性 : 引起烧伤 如果吸入 食入 或经皮肤吸收, 则有害 对眼睛有刺激 ** 氯化钠 5.85 g/l 刺激眼睛和双肺 避免皮肤接触 乏因子血浆 1 ml 感染风险 凝血活酶 2 ml 风险低 APTT 试剂 2 ml 风险低 0.025M 氯化钙 5 ml 风险低 Owren 缓冲液 <500 ml 含有巴比妥 : 吞食有害 皮肤接触或吸入 可致敏 凝血分析仪清洗液 1 <50 ml 引起烧伤 : 对眼睛 皮肤等有害 请勿与其它消毒剂混合 具有腐蚀性 与可燃物接触可引起火灾 与酸接触可释放有毒气体 与铵盐有剧烈反应 有机溶剂 : 有爆炸风险 凝血分析仪清洗液 2 <50 ml 含 0.16% 盐酸和洗涤剂 具有刺激性 : 可 伤害眼睛和皮肤 标准 / 对照 / 患者的血浆 <1000 µl 有感染风险 8 血友病和其它出血性疾病诊断

15 图 3.2. 因子 XIII 检测 COSHH 程序 / 实验名称 : 物质大致数量确定危害 催化剂试剂 : 牛凝血酶 ; 凝血抑制剂 (0.01 g 甘氨酸 - 亲 - 精氨酸 - 丙氨酸酰胺 ); 氯化钙 ; 海美溴铵 (40 mg); 牛白蛋白 ; N- 二甘氨酸缓冲液 (100M m/l); 和 2.5 mg 叠氮钠 NADH 试剂 :2 mg NADH; 牛血清白蛋白和 2.5 mg 叠氮钠 检测试剂 : 合成肽 ; 甘氨酸乙酯 (7 mg);α 酮戊二酸 (13.5 mg); 牛血清白蛋白 ;HEPES 缓冲液和 5 mg 叠氮钠 5 ml 的小瓶含有叠氮钠 : 如果经皮肤吸收或食入, 则有剧毒 可导致可遗传的基因损伤 与某些金属发生爆炸性反应 5 ml 的小瓶含有叠氮钠 : 如果经皮肤吸收或食入, 则有剧毒 可引起遗传性基因损害 与某些金属发生爆炸性反应 5 ml 的小瓶含有叠氮钠 : 经皮肤吸收或食入, 则有剧毒 可导致可遗传的基因损伤 与某些金属发生爆炸性反应 标准 / 对照 / 患者的血浆 <1000 µl 有感染风险 实验室安全 9

16 4 样本采集和分析前变量 样本采集 一些指南 (CLSI 2007, 2008a, 2008b) 对止血检测的血样采集和处理过程均有详细描述 尽可能从肘弯静脉采集静脉血并用止血带协助采血 在采血开始前扎上止血带 成人血样采集使用的针头不应大于 21 号, 应使用注射器和 / 或可快速采集血样的真空采集系统采集血样 将血液轻轻抽入注射器 婴幼儿血样采集需使用 22 或 23 号针头 静脉穿刺一次成功, 但没有快速和顺利抽得的血样一律丢弃, 因为这样的血液可能已被激活 血样采集入注射器后, 不能经针头回流 应先取下针头, 再把血液从注射器转移到抗凝容器中 血样采集后不要耽搁, 应立即与抗凝剂混合 血液和抗凝剂混合后, 应密封容器并轻轻上下颠倒五次混匀 避免剧烈震动 有些作者建议最初采集的 5 ml 血液不应该用于止血检测 如果使用真空采集系统, 应注意在血液抽至抗凝剂管后, 仍然需要轻轻上下颠倒五次混匀 血液与浓度为 0.109M(3.2% 枸橼酸三钠二水 ) 枸橼酸钠抗凝剂或类似抗凝剂 ( 例如有些真空系统成功使用了 0.105M 枸橼酸抗凝剂 ) 按 9: 1 比例混匀 抗凝溶液在 4 C 下最多保存 3 个月, 但在使用前应进行检查, 如果有颗粒物质则应丢弃 例如污染发生时 样本容器不应引发接触激活 ( 使用塑料或硅化玻璃容器 ) 如果患者的红细胞压积低于正常, 尤其是红细胞压积高于正常, 会影响检测结果 抗凝剂容积应根据血浆容积的减少进行调整 下面图 4.1 给出了一个红细胞压积异常的 5 ml 血样所需抗凝剂容积的指南 另外,0.5 毫升抗凝剂可保持不变, 加入的血液量根据红细胞压积有所不同 血液加入量 ( 加入至 0.5 毫升 0.109M 柠檬酸 ) 根据以下公式计算 : 红细胞压积 血友病和其它出血性疾病诊断

17 图 4.1. 红细胞压积异常的样本所需的血液和抗凝剂量 红细胞压积 抗凝剂量 血液量 25% 55% 0.5 ml 4.5 ml 20% 0.7 ml 4.3 ml 60% 0.4 ml 4.6 ml 70% 0.25 ml 4.75 ml 80% 0.2 ml 4.8 ml 离心 血小板功能试验使用的富血小板血浆 (PRP) 由抗凝血在室温下以 150 g 200 g 离心 10 分钟制备 取上清液, 用加塞小瓶在室温下保存, 使用期限不得超过两小时 大多数凝血试验使用乏血小板血浆 (PPP) 血液样本应 1700 g 的速度离心至少 10 分钟 如果室温不超过 25 C 可在室温下离心, 超过 25 C 时, 应使用低温 (4 C) 离心机 有些检测要求离心血浆两次 要做到这一点, 将第一次离心获得的乏血小板血浆转移至加塞塑料管进行第二次离心 注意不要使用第二次离心后底部血浆, 因为其中可能包含第一次离心后残留的血小板 即刻测试的样本 样本应尽可能在采集后四小时内进行测试 虽然研究表明, 室温下保存的全血样本在进行凝血酶原时间测量时具有稳定性 (Baglin 和 Luddington, 1997), 但是在进行筛查试验和凝血因子测定时应避免长时间储存 筛查试验和测定凝血因子 VII 的样本应在室温下保存, 以避免可能发生的冷激活作用 高风险样本 由于存在传染肝炎 HIV 和其它病毒的风险, 因此, 处理所有血浆样本时应谨慎 参见第 3 节 实验室安全 样本采集和分析前变量 11

18 超低温冷冻血浆 样本可超低温冷冻保存供以后测试之用 储存温度最好为 -70 C 或更低 凝血因子在此温度下可保持稳定至少六个月 (Woodhams, 等. 2001) 对于大多数测试, 可在 -35 C 下短期保存 -20 C 温度通常不可用于储存样本 如果样本在狼疮抗凝分析之前进行了超低温冷冻, 则应进行两次离心 ( 参阅以上 离心 一节 ) 在检测 APTT 之前尽量避免冰冻和解冻, 因为结果可能受到影响 分析前, 任何冰冻血浆必须立即转移至 37 C 水浴, 浸泡四至五分钟, 并轻轻翻转混匀 应避免在较低温度下缓慢解冻, 否则形成的冷沉淀会降低上清液中的 FVIII:C, VWF, 以及血浆纤维蛋白原的含量 参考文献 Baglin T, Luddington R. Reliability of delayed INR determination: implications for decentralised anticoagulant care with off-site blood sampling. Br J Haem 1997; 96: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipunture: Approved standard, 6th ed. 2007; Clinical and Laboratory Standards Institute Document H3-A6: 27(26). Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens: Approved standard, 6th ed (a); Clinical and Laboratory Standards Institute Document H4-A6: 28(25). Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Collection, transport, and processing of blood specimens for testing plasma-based coagulation assays and molecular hemostasis assays: Approved guideline, 5th ed (b); Clinical and Laboratory Standards Institute Document H21-A5: 28(5). Woodhams B, Girardot O, Blanco MJ, Colesse G, Gourmelin Y. Stability of coagulation proteins in frozen plasma. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: 血友病和其它出血性疾病诊断

19 室内质量控制和室间质量评估 5 质量保证 (QA) 是一个整体术语, 用来描述确保实验室检测和报告可靠性所采取的一 切措施 包括 : 测试的选择 患者有效样本的采集 标本分析和结果及时准确的记录 适当情况下对结果的解读以及将这些结果转达给会诊临床医生 室内质量控制 (IQC) 和室间质量评估 (EQA)( 有时称为熟练度验证 ) 两者不同但互 为补充, 均为实验室质量保证方案的组成部分 IQC 用来确定一段时间内一系列技 术和程序是否始终如一地执行, 以确保实验室日常活动的一致性 EQA 用来确定某 个实验室的结果与其它中心获得的结果之间的一致性 在大型 EQA 计划中, 对参与实验室获得的结果进行回顾性分析不仅可识别单个实验 室的问题, 同时也能发现产生不可靠或误导性结果的试剂和方法 EQA 去的主要功能是对单个实验室检测进行熟练度测试 世界血友病联盟的 EQA 项目包括对出血性疾病诊断和管理相关的分析 ( 详细信息请联系 WFH) 本项目中 的数据已经在以下参考文献中发表 : Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Development of a World Federation of Hemophilia External Quality Assessment Scheme: results of a pilot study. Haemophilia 1996; 2: 4-46 Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Laboratory performance of haemophilia centres in developing countries: 3 years experience of the World Federation of Hemophilia External Quality Assessment Scheme. Haemophilia 1998; 4: Jennings I, Kitchen DP, Woods TA, Kitchen S, Walker ID, Preston FE. Laboratory performance in the WFH EQA programme Haemophilia. 2009; 15: WFH EQA 项目联系信息 (2010) 总监 :F. Eric Preston 教授 科学总监 :Steve Kitchen 博士 Rutledge Mews 3 Southbourne Road Sheffield S10 2QN United Kingdom 电话 : 传真 : 网址 : 室内质量控制和室间质量评估 13

20 大型 EQA 项目可提供关于分析程序 ( 包括方法原理 试剂和仪器 ) 的相对绩效 持续参加 EQA 项目与实验室绩效改进相关 这已不仅体现整体绩效上 ( 由各实验室结果之间可变性减小而得到证实 ), 还体现于单个实验室的绩效 评估各个实验室的绩效是 EQA 项目的重要组成部分 WFH EQA 项目将参与者的结果与参加英国国家室间质量评估项目 ( 英国 NEQAS) 的相同样本在全球 700 个中心分析所得的凝血检测结果进行了比较 一个实验室得出不理想结果的可能原因有很多 虽然这个原因可能很快显现出来, 但是找出潜在问题并不简单 较大的 EQA 项目能够识别涉及试剂差异或方法学差异的特定绩效问题 完全保密是所有 EQA 项目的重要特征 在上面提到的国际 EQA 中, 关于单个实验室绩效的信息不得泄露给除获得书面授权的指定部门负责人之外的任何人 室内质量控制 室内质量控制用来确定一段时间内一系列技术和程序是否始终如一地执行 质量控 制一词通常用来描述一系列程序, 这些程序用于核查实验室研究结果是否足够可靠 以进行公布从而帮助临床决定 治疗监测和止血异常诊断 质量控制程序的运用应 可确保对结果的产生进行直接和持续的控制 在一个实验室环境中, 所获质控结果受诸多因素影响, 包括 : 样本采集和处理的正确性 合适技术的选择和标准化操作程序的更新 可靠试剂和相关材料的使用 合适的自动化设备的选择和维护 适当记录 结果的报告体系 此外, 在常规实践中所获质量效果依赖于对称职员工的选择 培训和激励 室内质量控制非常有利于确定某一特定技术的精确度 - 精确度是指某个样本反复测量 后结果的一致性程度 需知道, 某项精确技术并不一定准确, 准确度是指评估值与 真值之间的近似度 质量控制材料 为了评估某个特定方法的精确度, 需要对同一标本反复取样测试分析 同时包括正 常值和异常值的质量控制 (QC) 样本, 以确保该方法对不同水平值都在质控范围内, 14 血友病和其它出血性疾病诊断

21 因为在检测异常对照样本时, 即使分析过程较小的变化也可能导致结果的较大差异 对照材料应与测试样本的特性类似, 并且同时进行分析 人源质量控制物更有可能接近于人体试验样本 所有瓶与瓶之间或分装的质控物间应一致, 以确保测定结果间的差异不是由于质控物的瓶间差异造成的 QC 物在预期使用期间应该稳定 关于止血测试和检测, 血浆样本必须深度冷冻 ( 最好为 -35 C 或更低 ), 或者冻干, 以确保其作为 QC 物使用时足够稳定 对于冻干样本复溶, 需使用 ph 的蒸馏水, 并至少复溶五分钟 如果使用商用 QC 物, 则应该根据制造商的说明用准确的移液器进行复溶 如果使用超低温冰冻的 QC 物, 则应该在 37 C 下迅速解冻 5 分钟 在选择 QC 物时, 应考虑血源性病毒传播的风险 不应使用高风险 QC 物 在每组筛查测试或检测中应包括至少一种 QC 物 对于筛查测试, 最适合的做法可能是在这种方法中加入一种正常的 QC, 并每天 / 每个班次 / 怀疑怀疑方法是否在质控中时测试一次异常的 QC 物 关于分析两种水平 PT/APTT IQC 问题的解决指南, 请参见下图 5.1 图 5.1. IQC 问题解决 PT 水平 1 IQC PT 水平 2 IQC APTT 水平 1 IQC APTT 水平 2 IQC 结论 / 检查 失控控制控制控制 PT 水平 1 IQC 物 失控失控控制控制 PT 试剂 控制控制失控控制 APTT 水平 1 IQC 材料 控制控制失控失控 APTT 物 失控失控失控失控仪器 低值 QC 物应进行测试, 用于诊断和监测与出血相关的先天性缺陷症 在所有情况下, 对照物均应与测试样本尽可能完全同样地进行操作 由于有些变化必然会发生, 导致生物 技术和分析变化 因此, 应该记录每次 QC 的结果并评估其范围是否可接受, 见如下所述 可接受的变化范围 对于商品化 IQC, 样本的厂商通常提供可接受值的靶范围 在筛查测试和随机检测 室内质量控制和室间质量评估 15

22 时, 获得的结果将取决于执行测试所使用的试剂和终点检测系统 靶范围必须考虑到这些影响 如果某个特定的技术没有靶范围, 可建立当地的靶范围 当测试方法已知得到控制 ( 例如, 可选 QC 物显示出靶范围内的结果 ) 时, 在不同的时间内可反复 ( 最少 10 次 ) 测试 IQC 物 然后, 将计算这些结果的均值和标准差 (SD) SD 是 d 2 之和除以 n-1 的平方根, 其中 d 表示各个结果与平均值的差值,n 为测定次数 SD 是对结果分布的评估手段 :SD 越大, 表示结果分布范围越大 另一个重要参数是变异系数 (CV), 表示平均值百分比的 SD(CV=SD 除以平均值乘以 100%) 不同日期 QC 样本凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间的结果的 CV 应始终小于 8%, 最好更低 至于 FVIII:C 和 FIX:C 的检测, 对于若干天内执行的测试应实现 CV 小于 10% 在大多数情况下, 所获 IQC 样本的结果将显示为正态 ( 高斯 ) 分布 常见的做法是将 IQC 结果的靶范围设为平均值 ± 2 SD, 因为这应包括 95% 的检测值 单个结果应记入识别靶范围的图表 示例如下图 5.2 所示 在限定值内的任何所测值视为可接受值 此范围之外的结果表明,QC 物变质或者处理不当, 亦或该方法没有在质控内 因而, 对未来 QC 物的重复测试可区分这两种可能性, 进一步处于限值范围之外的结果可证实测试系统失控 根据累积记录图表的观察结果,QC 测试结果的中期或长期漂移 ( 因诸如仪器或试剂变质或变化所致 ) 将变得明显 16 血友病和其它出血性疾病诊断

23 图 5.2. 于不同日期检测的内部质量控制样本的 FVIII:C 检测结果 因子 VIII:C 活性 (iu/dl) Factor VIII:C activity (iu/dl) Date 测试日期 of test 每个点代表同一材料的不同检测 实线表示针对本材料的 20 次检测的平均值和两个标准差, 上下两条实线被视为可接受结果的限值 室内质量控制和室间质量评估 17

24 6 手动倾斜试管技术 虽然凝血试验有各种不同仪器可供选择 ( 见第 41 节自动化内容 ) 并在世界各地使用, 但是, 手动倾斜试管技术仍然被许多中心成功使用 即使使用自动化仪器, 有些测试 也可能需要手工进行, 因为特殊样本与使用中的仪器偶尔会出现不兼容 在以下情况 下发生 : 分析黄疸样本时血脂浓度大大升高 测试样本中血块形成模式明显不同于正 常样本 ( 尤其是纤维蛋白原浓度明显降低时 ) 手动凝血测试最好在玻璃管中执行 试管大小为 75mm 10mm 不同类型的玻璃管均 可使用, 但可能会影响获得的凝血时间, 特别是在筛查测试中, 可影响活化部分凝血 活酶时间 (APTT) 等 如果试管的来源 ( 制造商或合成物 ) 有变化, 应考虑影响到结 果的可能性 可通过使用两种类型试管比较某些测试 ( 如 APTT) 的结果而获知该可 能性 如果出现了系统性差异, 则应确定新的正常值范围 应尽量避免使用清洗试管 由于手工技术存在诸多变异并可能的污染来源, 因此, 应进行重复试验 在任何情 况下, 如果重复试验的凝血时间的差异超过 10%, 则应重新测试 使用手动倾斜试管技术时, 以下特点很重要 : 在用于凝血测试之前, 试剂必须预热至 37 C, 时间至少五分钟 测试血浆和试剂的混合物在加入混合物的最后成分后应立即快速摇晃试管一至 两秒进行混合, 同时启动秒表 然后, 应在观察下倾斜混合物至 90, 每五秒钟进行三次, 同时记录凝血时间 该程序如下图 6.1 所示 在倾斜操作之间应将试管浸入 37 C (±0.5 C) 的水中, 使试管底部进入水面约 3~4 厘米, 使混合物的温度尽量保持接近 37 C 应在 Anglepoise 灯或类似光源下检查凝血混合物, 记录凝血时间 18 血友病和其它出血性疾病诊断

25 图 6.1. 凝血试验使用的手动倾斜试管技术 秒 每 5 秒钟倾斜 3 次 手动倾斜试管技术 19

26 7 正常混合血浆 (PNP) 的制备和校准 图 7.1. 正常混合血浆的采集 献血者 抗凝剂 采集 未服用干扰凝血因子和凝血反应药物的最少 20 名正常健康人 口服避孕药的女性可纳入 男性和女性人数大致相等 年龄应为 20 至 50 岁 用 N-2- 羟乙基哌嗪缓冲的 0.109M (3.2%) 柠檬酸三钠 ( 二个水分子 ) 每 100 ml 柠檬酸三钠 5 g N-2- 乙磺酸 (HEPES) 使用一次性 60 ml 塑料注射器和 21 g 的蝶形针在上午 9 点至 11 点取献血者的血样 PNP 制备方法 1 于含 6 ml 抗凝剂的塑料容器内采集 54 ml 血液, 混匀 2 样本混合过程中应放在冰上 3 在 4 C 下 2500 g 离心 15 分钟 4 混合血浆贮存在非接触激活的塑料容器内 5 每 1.5 ml 的塑料管中分装成 0.5 ml 6 在干冰 / 固体 CO 2 ( 如果有 ) 上快速冷冻 或者直接放到 -70 C 的开放式架子上 7 请在四小时内完成以上程序 8 在 -70 C 下稳定 6 个月以上 虽然不同正常混合血浆中 FVIII 和血管性血友病因子 (VWF) 有很大差异, 但是用这种方法制备的正常混合血浆 (PNP) 的因子 II, V, VII, IX, X, XI, XII, HMWK, 前激肽释放酶原的水平均约为 1 U/ ml, 即 100 U/dl 这种本地 PNP 应以国际单位 (IU) 校准品进行校准, 因为上述所有凝血因子中, 除 FXII 外, 均有国际标准校准品 假定 FXII 的效力为 100 U/dl 或 1 U/ml,PNP 可在未校准的情况下使用 为了以 IU 20 血友病和其它出血性疾病诊断

27 校准, 有必要获取经校准的 WHO 参考制剂 ( 英国国家生物标准与控制研究所提供, 地址 :South Mimms, Potters Bar, Herts, U.K.) 或购买制造商以 IU 校准的合适的商用参考血浆 每 12 至 18 个月应考虑更换正常混合血浆, 除非室内质量控制结果证明其一直保持稳定 本地 PNP 的校准方法 1 获取校准标准品, 如 WHO 国际标准品 (IS)( 至少 2 瓶 ) 2 在两个不同的日期, 使用一瓶国际标准品和四份本地 PNP 3 第一天, 使用每份新鲜稀释的血浆检测国际标准品 本地血浆 本地血浆 本地血浆 本地血浆 国际标准品, 并重复 4 第二天, 使用每份新鲜稀释的血浆检测本地血浆 本地血浆 国际标准品 国际标准品 本地血浆 本地血浆, 并重复 5 计算每份本地混合血浆相对于两个国际标准品结果的平均值的效力 4 份 2 倍稀释 2 天 (n = 16) 的平均结果作为本地标准血浆的效力 正常混合血浆 (PNP) 的制备和校准 21

28 8 建立正常参考范围 为了正确解读化验结果, 需有健康正常人检测结果的数据 健康并没有明确的条件, 通常是一个相对的概念 在某些情况下, 理想组别在年龄 性别方面以及 FVIII/VWF, ABO 血型等情况可能与检测人群非常相符 但是, 如此谨慎的选择对于很多凝血检测没有必要 在实践中, 为了建立正常值范 围而选择健康正常受试者要根据实际需要 未服用任何药物的健康医务人员以及健 康献血者或患者的健康配偶均可纳入 有一些与正常参考值范围相关的重要因素需 考虑, 说明如下 采集血液时, 正常受试者的状态可影响结果 最近 ISTH 指南中审查了一些与女性健康 问题相关的这些分析前变量 (Blomback, 等. 2007) 其中审查了身体紧张 ( 例如,10 小时内 FVIII/VWF 持续增加 2.5 倍 ) 精神紧张 ( 急性精神紧张后 FVIII 和 VWF 增 加 ) 激素作用 昼夜变化 采血姿势和饮食的影响 给出了一般性建议, 而并不限 于对女性患者的调查 这些建议如下 : 静脉穿刺前 24 小时禁止进行任何剧烈的体育锻炼 选择可减轻身体和精神紧张的环境 在静脉采血当天早上, 禁止摄入脂类食物和抽烟 在早上 ( 上午 7 时至 9 时 ) 献血者以放松的姿势静坐 20 至 30 分钟后抽取样本 应确定本地的正常参考值范围 文献与供应商的信息应作为参考 正常样本采集 处理和分析使用的技术应尽量与患者样本相同 尤其对于筛查试验 (PT, APTT), 应考虑同一制造商的不同批号试剂的正常参考值 范围不同的可能性 对与任何变化重叠的内部 QC 数据应予以认真审查 任何变化 均表示需要不同的正常参考值范围 对于检测, 文献与制造商的信息仅供参考 最合适的检测技术所得的本地正常参考 值范围应与文献中的大致相同 新生儿 ( 早产儿或足月儿 ) 和儿童的有些凝血试验的正常范围不同于成人 (Andrew, 等. 1987, 1990, 1992) 正常参考值范围, 特别是筛查试验的正常参考值范围应仅作为临床信息的协助工具 对于具有个人和家庭史的一些患者在筛查测试结果正常的情况下也需要进一步研究 22 血友病和其它出血性疾病诊断

29 对于筛查试验异常的其他患者, 如果导致异常的原因显而易见, 则需要接受进一步的研究 因此, 正常参考值范围可能不等于决定范围和干预范围 统计学要求 : 建立完全有效的正常参考范围需要至少 120 名正常受试者, 但出于实践目的, 可通过检测较少人数获得近似值, 有些本领域专家认为出于临床目的这样做是可接受的 (CLSI 2008) 在研究出血性疾病相关的止血检测中, 选定进行分析的正常受试者数量应不少于 30 例 在建立正常参考值范围时, 正常受试者的样本在当地采集 处理和分析使用的技术应与分析患者样本所用的技术相同 如果患者样本为了批量分析而需冷冻储存, 则正常样本也应冷冻处理 如果患者样本在运输到实验室期间延迟几个小时后才进行处理, 则用于计算参考区间的正常受试者样本的采集和测试之间也应有这样类似的延迟 文献和试剂制造商的信息仅供参考 对于每一次检测, 从健康 正常受试者样本中获得的结果均用于建立正常参考值范围 大多数与研究出血性疾病相关的检测结果均呈正态 ( 高斯 ) 分布 通过目视检查图表中的数据而对此进行确认是有益的 数据如图 8.1 所示 与大多数其它参考值相差甚远的明显离群值很有可能是异常结果 将这些值排除后, 进一步的计算是可以接受的 图 8.1. 健康正常受试者 APTT 结果的分布 Number of results 受测正常受试者结果数量 amongst normal subjects tested 平均 Mean APTT 30 sec 秒标准差 standard 2.9 deviation 秒 2.9 sec 正常参考值 Normal range 秒 sec APTT( (sec) 秒 ) 40 注 : 数据呈正态分布, 即均匀地分布于平均值的两边 建立正常参考范围 23

30 通常, 参考值或正常参考值包括 95% 的区间值 如果分布与图 8.1 所示明显不同 ( 例如, 向一个方向倾斜 ), 则可能需要更多的正常样本 简便的方法是去除左右两边 2.5% 区间的值, 保留中间 95% 区间值 如果呈正态分布, 则适于计算正常值的平均值和标准差 ( 如第 5 节所述 ), 并以平均值 +2SD 和平均值 2SD 分别作为上限值和下限值 在任何情况下, 正常参考值仅作为一个指南, 用于解释结果的临床意义 关于建立参考范围的更全面讨论, 请参阅 CLSI (2000) 参考文献 Andrew M, Paes B, Johnston M. Development of the hemostatic system in the neonate and young infant. Am J Pediatr Hematol Oncol 1990; 12: Andrew M, Paes B, Milner R, et al. Development of the human coagulation system in the full-term infant. Blood 1987; 70: Andrew M, Vegh P, Johnston, Bowker J, Ofosu F, Mitchell L. Maturation of the hemostastic system during childhood. Blood 1992; 80: Blomback M, Konkle BA, Manco-Johnson MJ, Bremme K, Hellgren M, Kaaja R on behalf of the ISTH SSC on Women s Health Issues. Preanalytical conditions that affect coagulation testing, including hormonal status and therapy. Thromb Haemost 2007; 5: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: Approved guideline, 2nd ed. 2000; Clinical and Laboratory Standards Institute Document C28-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). One-stage prothrombin time (PT) test and activate partial thromboplastin time (APTT) test: Approved guideline, 2nd ed. 2008; Clinical and Laboratory Standards Institute Document H47-A2. 24 血友病和其它出血性疾病诊断

31 试剂 9 氯化钙 例如,BDH 化学物 摩尔溶液 25mM CaCL 2 溶液 :25 ml 1M CaCl 2 装入容量瓶, 加蒸馏水稀释至 1 升 Owren 巴比妥缓冲液, ph g 二乙基巴比妥酸钠 ( 巴比妥钠 ) g 氯化钠 1 放入容量瓶, 溶于约 780 ml 蒸馏水中 2 加入 215 ml 0.1M 盐酸 3 用蒸馏水将容量调整至 1 升 4 检测 ph 值, 如果必要, 调整至 ph 7.35 Owren 缓冲盐水 200 ml Owren 巴比妥缓冲液 800 ml 生理盐水 (0.9 g% 氯化钠 ) 咪唑缓冲液 2.72 g 咪唑 4.68 g 氯化钠 1 将上述试剂放入容量瓶, 溶于约 650 ml 蒸馏水中 2 加入 ml 0.1M HCl, 将 ph 值调整至 用蒸馏水将容量调整至 1 升 试剂 25

32 筛查试验试剂 出血性疾病诊断的筛选检测, 选择和应用合适的筛选试剂, 特别是凝血酶原时间 (PT) 和活化部分凝血活酶时间 (APTT) 检测试剂是非常重要的 许多不同的试剂遍及世界 各地 有充分的选择时, 应考虑灵敏度的不同 在用 PT 和 APTT 进行出血性疾病筛 查时, 可考虑以下与某个特定试剂性能可能相关的信息来源 : EQA 项目 ( 如国际 EQA) 相关试剂可比较的数据 ( 参见第 5 节 ) 发表的数据 有已知缺陷的患者血浆的检测 供应商的数据表 本地生产的 PT 和 APTT 试剂在价格上可能具有吸引力, 但可能会导致标准化的困 难, 因此最好避免使用 还应指出的是, 有些供应商提供不同的试剂 此外, 同名试剂的成分会随时间改变 这意味着, 无法对使用某种特定来源试剂给予建议 26 血友病和其它出血性疾病诊断

33 血小板计数 10 原理 将血液用一种可溶解红细胞的稀释剂混合 滴入血细胞计数器内, 显微镜下计数血 小板, 如果有的话, 最好使用相差显微镜 材料 / 设备 平底薄计数室 ( 带有 Neubauer 尺的相差血细胞计数器 ) 带有长工作距离相聚光镜的相差显微镜 ( 如果有的话 ); 否则使用普通光学显微镜 20 μl 移液管 2 ml 刻度移液管 mm 试管 机械式混合器 试剂 稀释液 :1% 草酸铵水溶液 存放于冰箱中, 每次使用前过滤 标本 如果针刺手指取血, 则必须清洁并且让血自然流出 擦去第一滴血 如果静脉采血, 则必须采集至带有不小于 21 号短针头的干燥塑料 ( 或硅化玻璃 ) 注射器中 在血液被注入装有 EDTA 的容器之前, 必须取下针头 血液和抗凝剂必须轻轻混匀, 避免起泡, 混合时不得有任何延误 方法 1 将 0.38 ml 的稀释液移至试管内 2 用移液管吸取 20 μl 抗凝血, 并将吸头外面擦干净 血小板计数 27

34 3 将抗凝血注入稀释液中, 清洗吸头数次后将液体完全排出 手工或最好通过机械 混合器混合至少 10 分钟 4 按如下所述填充血细胞计数器 5 用皮氏培养皿盖住计数室 10 至 20 分钟, 使血小板沉降 在培养皿中放入一片湿棉或滤纸, 以防止蒸发 6 使用显微镜计算 1 mm 大正方形 (= 0.1 μl) 内的血小板 计算尽可能多个正方形, 计数至少 100 个血小板 血小板呈圆形或椭圆形, 其内部颗粒结构和紫色光泽可用于与碎片区别 背景中可看到被草酸铵裂解的红细胞影 如果没有相差显微镜, 可使用普通光学显微镜, 但前提是聚光镜不要过分聚光, 获得低强度的光线 7 根据以下公式计算每升血液的血小板数量 血细胞计数器 构建带有 Neubauer 或改进 Neubauer 尺度的血细胞计数器的计数室, 使玻璃盖底面和计数室表面的距离为 0.1 mm 计数室的表面含有两个带有尺寸的特别刻度区域, 如图 10.1 所示 中央的 1 mm 2 有的两条或三条边界线 在中央区域, 改进 Neubauer 有 25 个正方形,Neubauer 尺度有 25 个正方形 每个正方形的面积为 0.04 mm 2 ( mm) 这些正方形又分成更小的正方形, 每个为 mm 2 ( mm) 刻度区域的外象限各为 1 mm 2, 并分成 16 个正方形 计算 计算公式 : 计数 ( 细胞 /l) = N D/A 其中,N = 计算得出的细胞总数 D = 稀释度 A = 计数的总面积 ( 单位为 mm 2 ) 10 = 计数室面积 (mm 2 ) 和深度 (0.1 mm) 乘积所计算的体积 (μl) 的系数 10 6 = 数量 /μl 到数量 /L 的换算系数 细胞计数的误差来源 如果使用毛细血管血液, 则必须采集自动流出的血滴 如果使用抗凝血, 血液采集到试管后至少颠倒混匀 20 次, 充分混匀后再吸取血样 由于摇晃可产生泡沫而致使不能准确移液, 因此, 请勿摇晃试管 将充分混匀的试管倾斜至 45 角或略大角度, 之后按照毛细血管血同样处理程序将血液吸出 28 血友病和其它出血性疾病诊断

35 图 血球计的计数室 (a) Neubauer 和 (b) 改进型 Neubauer (a) 1 mm 3 mm (b) 1 mm 1 mm 3 mm 血小板计数 29

36 采集血样的移液器必须清洁干燥 必须快速吸入移液器, 之后必须使用与移液管配套吸头吸取血液, 直至充装至所需的刻度线 如果略超刻度线, 则可按压移液管吸头将多余的血液排到滤纸或软纸上 如果超过刻度线较多, 则必须使用新的移液管 吸入移液管的血中不得含有气泡 在移液管中的血液注入稀释液中之前, 必须将移液管外面的血液擦拭干净 ( 注意不要从吸头处回抽血液 ) 在移液管内的血液注入稀释剂中后, 必须用稀释液反复冲洗移液管几次, 以确保所有的血液均排入稀释液中 含有稀释血液的试管必须用手 ( 最好用机械式摇动器 ) 轻轻摇晃至少两分钟 摇动试管后, 立即用巴斯德移液器或毛细管充装计数室 计数室用毛细管填充, 并且调节移液器或毛细管的液体流出, 以便快速顺利填充 必须将计数室充满, 但是液体不能溅入槽内 让细胞在计数室沉降 10 至 20 分钟, 然后进行计数 血细胞计数器的计数室和玻璃盖在使用前必须清洁干燥 指纹或油性薄膜可导致较大误差 为了减少细胞随机分布导致的误差, 必须计算足够数量的细胞 在实践中, 应至少计算 100 个细胞 在检查计数室内细胞是否正确分布时, 在每个区域 ( 即, 大正方形 ) 内计算的细胞数量差异应不超过 10% 对照 必须稀释两次, 并取两次计数的平均值 ; 两种计数值的差异小于 10% 血小板计数的误差来源 静脉采集的血液优于毛细血管血, 因为毛细管采血时血小板粘附到伤口上, 随之发生血液稀释, 使结果的重复性差 移液和血细胞计数的常见误差如上所示 此外, 必须特别注意确保计数室彻底清洁, 因为污垢和碎片可误计为血小板 用肥皂水清洗计数室, 然后用蒸馏水冲洗, 排干 并用无绒棉布擦拭 确保盖玻片干净 血小板凝集的出现致使计数不可靠 如果样本出现血小板聚焦, 则必须使用新的样本 草酸铵稀释剂应冷藏保存, 如果出现细菌污染, 必须丢弃 标本必须在采集后三小时内进行计数 30 血友病和其它出血性疾病诊断

37 出血时间 11 原理 出血时间是指固定深度和长度的标准皮肤割伤至出血停止之间的时间 患有血小板减少 血管性血友病 格兰兹曼氏血小板功能不全 Bernard-Soulier 综合征 血小板贮存池疾病和其他血小板疾病的患者会出现出血时间延长 纤维蛋白原是必需的, 并且 FV 也发挥作用 因此, 纤维蛋白原或 FV 缺陷症的患者出血时间可延长 出血时间延长也发生于一些肾脏疾病 异常蛋白血症和血管性疾病等 材料 / 设备 血压计 清洁棉签 标准化出血时间装置 1 mm 厚的滤纸 秒表 方法 1 将血压计袖带绕在上臂并充气至 40 毫米汞柱 在整个测试过程中均维持该压力 2 将前臂背侧面清洗干净, 之后将出血时间装置紧贴到皮肤上, 但不要有压迫感 放松触发器, 秒表启动 3 应避开浅静脉 疤痕和青肿处 4 在 30 秒间隔时间内, 用滤纸吸干血流 使滤纸靠近切口处, 不要接触伤口边缘 5 记录穿刺至出血停止的时间 释义 成人出血时间的正常范围少于 8 min, 但根据所使用的不同方法, 可能有所不同 出血时间 31

38 注释 截至撰写本文时, 市场上有两种测量出血时间的一次性装置 不论使用何种装 置, 均应确定本地的正常值范围 切口应与手臂纵向平行 与手臂垂直的切口出血时间更长 如果结果异常, 应重复测试 如果出血持续超过 20 分钟, 则无需记录终点 干扰血小板功能的药物的影响应予以考虑 例如, 含有阿司匹林的药物可能会导 致出血时间延长 因此, 如果可能, 在测试前七日内应不服用这些药物 出血时间测量切口处可能会结痂 在切开前, 这些应告知患者 参考文献 Mielke CH. Measurement of the bleeding time. Thromb Haemost 1984; 52: 血友病和其它出血性疾病诊断

39 凝血酶原时间 (PT) 12 原理 该测试反映了外源性凝血系统的整体效率 对因子 V, VII 和 X 变化比较灵敏, 但对 因子 II ( 凝血酶原 ) 变化的灵敏度较低 也不适合检测纤维蛋白原水平的微小变化, 但是, 如果纤维蛋白原水平很低, 或者存在抑制物, 则 PT 值可能会不正常 该测试 的灵敏度受所使用的试剂和技术所影响, 重要的是要建立本地的参考值范围 凝血酶原时间所测得的途径如图 12.1 所示 PT 试剂, 通常称为凝血活酶, 含有组 织因子和磷脂 许多可用的试剂已经上市 第 9 节包括了试剂选择的说明 试剂 凝血活酶 ( 可能含有氯化钙 ) 25mM 氯化钙 ( 仅在凝血活酶试剂中不含钙时需要 ) 方法 : 手工操作 1 向前两个试管中加入 0.1 ml 正常血浆, 加温至 37 C 2 分钟 2 加入 0.2 ml 预热 (37 C) 的凝血活酶试剂 ( 如果试剂中含有钙 ) 3 启动秒表 混合 并记录凝血时间 4 每个测试样本重复此操作 5 报告患者的凝血时间 ( 以秒为单位 ) 对于手工操作, 所有测试均需重复检测 两次凝血时间的差值不应超过 10% 对于变 异系数小于 5% 的自动化检测, 单次测试通常可接受, 但结果延长时需复检 注释 如果凝血活酶试剂中不含有钙, 则测试过程为 0.1 ml 血浆 0.1 ml 凝血活酶并 与 0.1 ml 预热的 25mM 氯化钙混合凝集 凝血酶原时间 (PT) 33

40 组织因子 :FVII 对 FIX 的活化发生于体内 在大多数 PT 测试条件下,FX 均被 强烈活化, 以致该检测对 FIX 或 FVIII 的缺乏不敏感 凝血活酶 / 氯化钙在使用前应预热 5 至 30 分钟 凝血时间通常受不同的凝血仪影响, 取决于如何检测以及何时确定检测终点 这 进一步强调了建立实验室目前使用方法的正常参考值范围的重要性 出现因子 II, V, VII 或 X 轻度缺乏时, 凝血酶原时间轻度延长 FII 缺乏症患者 的 PT 可能在正常范围内 有些 PT 试剂会受到狼疮抗凝物质 / 抗磷脂抗体的影响, 有些稀有抗体可能会导 致 PT 延长, 但不会延长 APTT 磷脂含量较低的试剂更容易受到影响, 如由脂 质化重组组织因子组成的试剂 无论用重组 VIIa 治疗后, 还是体内的 FVII 被活化, 均可导致 PT 缩短 其作用 取决于所使用的组织因子试剂 含牛组织因子的试剂尤其容易受到这种作用的 影响 (Kitchen et al. 1992). 血液样本在测定 PT 之前不得储存于 2 C 8 C, 否 则可导致 FVII 的冷活化 用于测定 PT 的全血可稳定至少 24 小时, 且取决于使用的试剂 (Baglin and Luddington 1997) 用含人组织因子的试剂测定的 PT 可能与使用含其它物种 ( 如 : 兔子 ) 组织因子 的试剂所测得的 PT 不同 这种情况下, 用人组织因子试剂获得的结果可能更能 提示出血的风险 关于测定 PT 相关问题的详细讨论, 请参阅 CLSI (2008) 图 凝血酶原时间测试途径 Ca ++ /PL/ 组织因子 + 因子 VII 因子 X 含 Ca ++ /PL/ 因子 V 的因子 Xa 凝血酶原 ( 因子 II) 凝血酶 ( 因子 IIa) 纤维蛋白原 纤维蛋白 PL = 磷脂 = 活化 34 血友病和其它出血性疾病诊断

41 参考文献 Baglin T, Luddington R. Reliability of delayed INR determination: implications for decentralised anticoagulant care with off-site blood sampling. Br J Haem 1997; 96: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). One-Stage Prothrombin time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test: Approved guideline, 2nd ed Clinical and Laboratory Standards Institute Document H47-A2. Kitchen S, Malia RG, Preston FE. A comparison of methods for the measurement of activated factor VII. Thromb Haemost 1992; 68: 凝血酶原时间 (PT) 35

42 13 活化部分凝血活酶时间 (APTT) 原理 这是内源性系统的一种非特异检测 该测试和正常凝血酶原时间相结合, 是检测凝血因子 VIII, IX, XI 和 XII 缺乏症的最有效筛查试验 当任何涉及共同途径的缺乏症 (V, X, II 因子缺乏症, 或轻度的纤维蛋白原缺乏症 ) 和抑制物存在时,APTT 均可延长 一些治疗性凝血因子抑制物 ( 如肝素 ) 也会延长 APTT 对于 APTT 延长的患者, 请务必首先排除使用这些方法治疗的可能性 当存在前激肽释放酶原 (PKK) 或高分子量激肽原 (HMWK) 缺乏症的时候,APTT 也会延长, 除非检测试剂是一种以鞣花酸为活化剂 使用这种试剂, 即使该因子完全缺乏,APTT 也会正常 APTT 测得的途径如图 13.2 所示 试剂 APTT 试剂 25mM 氯化钙 方法 1 在使用前将含氯化钙的试管于 37 C 下放置 5 分钟 2 将 0.1 毫升的 APTT 试剂加入两个 37 C 预温的玻璃凝血管中 3 将 0.1 毫升的对照血浆加入第一个试管 4 启动主秒表 混合 5 将 0.1 毫升的对照血浆加入第二个试管 混合 6 孵育时间达到推荐的时间后 *, 先后向每个试管中加入 0.1 毫升氯化钙, 对每个试 管启动各自的秒表 混合 记录血浆凝固时间 对于手工操作, 所有测试需重复测定 两次凝血时间相差不应超过 10% 对于自动 36 血友病和其它出血性疾病诊断

43 化操作, 测定变异系数应小于 5%, 单次测定通常可接受, 结果延长时需复查 * 应遵循试剂制造商的建议 孵育时间通常为 2 至 5 分钟 孵育时间非常重要, 其通 常会影响检测结果, 对于任何特定试剂, 较长的孵育时间可缩短凝血时间 释义 应确定当地的正常值范围 如果 APTT 较长并且 PT 正常, 则表明 VIII, IX, XI, XII 因子 高分子量激肽原 前激肽释放酶可能缺乏, 或者存在抑制物 APTT 较长时, 应测试正常血浆和测试血浆的等比混合物 ( 即 1 份测试血浆和 1 份正常血浆的混合物, 以下称为 50:50 混合 ) 如果 APTT 校正值超过正常血浆和测试血浆凝血时间差值的 50%, 则表示缺乏凝血因子 校正效果低下表明可能存在抑制物, 抑制了系统中或非特异类型凝血因子之一, 例如狼疮抗凝剂 ( 参见第 25 节 ) 图 APTT 释义示例 样本 APTT 对照测试如果 50: 50 混合如果 50: 50 混合 结果 35 秒 60 秒 42 秒 ( 校正良好, 则可能存在因子缺乏 ) 52 秒 ( 校正效果差, 则可能存在抑制物 ) 注释 许多可用的试剂已经上市 包括具有不同敏感性的各种材料 试剂选择的说明 见第 9 节 对于 PT, 凝血时间可能会受到血凝仪使用的影响 在测试血浆内, 一种高含量的凝血因子可补偿其他因子的低含量 例如, 急性期 反应期间 FVIII 明显上升, 在 FIX 或 FXI 减少时,APTT 可正常, 这对临床很重 要 如果患者有相应的出血性疾病个人病史或家族病史, 则在 APTT 正常时, 特 别是在参考值范围的高值时, 有必要进行更全面的分析 ( 包括特定因子分析 ) 各种试剂的磷脂浓度明显不同 这是为什么各试剂对狼疮抗凝剂敏感性明显不同 的原因之一 如果对狼疮敏感的试剂用于初始 APTT 检测, 进行第二次 APTT 检 测将会有帮助 ( Kitchen 等人,1999 年 ), 第二次 APTT 应使用含有高浓度磷脂 活化部分凝血活酶时间 (APTT) 37

44 的试剂, 例如 Actin FS( 德国马尔堡 Dade Behring 公司 ) 如果初始 APTT 结 果延长的原因是狼疮抗凝物质, 那么第二次 APTT 将是正常的, 因为使用肌动 蛋白 FS 时狼疮抗凝物质很少能使 APTT 延长 只有 APTT 延长的研究 对于 PT 正常但 APTT 延长的患者, 应遵循的正常研究顺序是 : 1 检测凝血酶时间 ( 参见第 15 节 ) 如果凝血酶时间正常, 继续执行步骤 2 和 3 如果凝血酶时间延长, 在鱼精蛋白硫酸盐中重复本步骤 ( 参见第 16 节 ) 如果 凝血酶时间校正至正常, 则表明存在肝素, 不需要进一步进行以下检测 如果不 知道患者是否接受过肝素治疗, 则应要求重复取样检测 2 使用正常血浆和患者血浆 1:1 (50%) 的混合血浆, 检测该混合血浆的 APTT 如果 50% 混合血浆未将 APTT 校正至正常值, 则表示存在抑制物 3 用第二种试剂检测 APTT, 该试剂应含有诸如肌动蛋白 FS(Dade Behring 公司 ) 的高浓度磷脂 如果初始 APTT 明显延长 ( 超过所使用的正常上限至少三秒钟 ), 并用含肌动蛋白 FS 的试剂测得的 APTT 正常, 那么可能存在狼疮抗凝物质 这可 在随后使用的特定检测进行确认 例如稀释蝰毒蛇时间 (DRVVT, 参见第 38 节 ), 不过, 如果不考虑将狼疮抗凝物质 (LAC) 列为血栓形成的危险因素, 则 通常没有必要进行这些特定检测 极少数情况下, 使用肌动蛋白 FS 时 APTT 正 常 使用硅或高岭土作为活化剂的试剂时 APTT 明显延长, 另外一个可能原因 为前激肽释放酶原缺乏症 与大多数 LAC 一样, 这与任何出血风险无关 因此 无需再次确认 4 当初始 APTT 明显延长 ( 三秒或超过三秒 ), 并且肌动蛋白 FS 测试的 APTT 正常时, 没有必要进行因子测定 5 如果两次 APTT 均延长, 则根据需要进行 FVIII:C, FIX 和 FXI 活性检测 ( 参见 第 23 节 ) 如有需要, 可进行 FXII 测定, 因为 FXII 缺乏比较普遍, 并且查出 FXII 缺陷便可解释 APTT 延长的原因 FXII 缺乏症与出血风险增加无关, 因此不存在出血性疾病 6 使用鞣花酸作为接触活化剂的试剂, 诸如肌动蛋白 FS, 即使存在严重前激肽释放 酶原缺乏症,APTT 结果仍可正常 如有必要, 为了节省时间, 步骤 1 至 3 可同时进行 注释 使用肌动蛋白 FS 时 APTT 正常与初始 APTT(Synthasil / 白细胞介素 ) 延长相结 合一般排除了 FVIII, FIX 或 FXI 缺乏症的存在, 在这种情况下不需要再测定因子 38 血友病和其它出血性疾病诊断

45 当 FIX 或 FXI 轻度降低 (30-50 U/dl) 而 FVIII 明显升高时, 在此罕见情况下, 使 用任何试剂 APTT 均可能正常 如果 FXII 下降到 20 U/dl-50 U/dl 范围内, 使用肌动蛋白 FS 时 APTT 通常正 常 ; 使用基于高岭土或硅激活时, APTT 轻度升高 这一缺陷并没有临床相关性 少数强效狼疮抗凝物质可延长使用肌动蛋白 FS 时的 APTT FVIII( 或 FIX 或 FXI) 的特异抗体可延长 APTT, 与试剂无关 关于测定 APTT 各种问题的详细讨论, 请参阅 CLSI (2008) 图 以 APTT 测得的途径 涉及激肽释放酶原 高分子量激肽原和带负电荷表面的接触活化 因子 XII 因子 XIIa 因子 XI 含 Ca ++ /PL 的因子 XIa 因子 IX 含 Ca ++ /PL/ 因子 VIII 的因子 IXa 因子 X 含 Ca ++ /PL/ 因子 V 的因子 Xa 因子 II 因子 IIa 纤维蛋白原 纤维蛋白 PL = 磷脂 = 活化 参考文献 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). One-Stage Prothrombin time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test: Approved guideline, 2nd ed Clinical and Laboratory Standards Institute Document H47-A2. Kitchen S, Cartwright I, Woods TA, Jennings I, Preston FE. Lipid composition of 7 APTT reagents in relation to heparin sensitivity Br J Haematol 1999; 106: 活化部分凝血活酶时间 (APTT) 39

46 14 异常 PT 和 APTT 进一步研究的混合检测 原理 发现有异常筛查试验结果 ( 即 PT/APTT) 的血浆样本要进行进一步研究, 用混合试 验确定异常 首先, 需证明患者血浆 APTT 延长可用正常血浆纠正, 以排除抑制物的 存在 通过添加下述的一种试剂纠正异常 APTT, 则表明所加试剂含有测试样本所缺 乏的物质 如果筛查测试结果异常, 则使用添加物和测试血浆等体积 ( 以下称为 50:50) 混合物 重复检测 以下试剂可用于混合试验 : 正常血浆 老年人血浆 吸附血浆 乏 FVIII 血浆 乏 FIX 血浆 老年人血浆 1 正常静脉血与 0.1M 草酸钠按 9:1 体积混合 2 离心血液获得乏血小板血浆, 在无菌条件下分离并在 37 C 下培养两至三天 3 这段时间结束时凝血酶原时间应超过 90 秒, 并对凝血活酶敏感 4 然后, 在塑料容器中等分, 并保存于 -35 C( 或更低温度 ) 下 老年人血浆缺乏因子 V 和 VIII 吸附血浆 1 将 1 g 湿凝胶与 4 ml 蒸馏水混合为稳定的混悬液, 从而制得氢氧化铝凝胶 ( 氧 化铝 ) 40 血友病和其它出血性疾病诊断

47 2 柠檬酸化乏血小板血浆采集自 5 位正常献血者, 储存 3 1/10 体积的氢氧化铝加入预温的血浆, 混合, 并于 37 C 下培养 3 分钟 4 然后立即离心 (1700 g, 3 分钟 室温 ) 混合物使凝胶沉淀 5 将上清移至塑料容器中, 可于 - 35 C 下保存数周 吸附血浆缺乏因子 II, VII, IX 和 X( 维生素 K 依赖性因子 ) 用敏感试剂测试, 凝血 酶原时间应为 > 60 秒 注 : 须注意吸附时间, 过度吸附将导致其它凝血因子丢失 FVIII/FIX 缺乏性血浆 从 FVIII 或 FIX 单一严重缺乏 (< 1 IU/dl) 的患者中获取的血浆对混合研究很有用 如有可能, 应优先于老年人血浆和吸附血浆使用 为此目的选定的血浆应具有正常的 PT, 确认肝脏中合成的其它凝血因子在正常水平 可冻干这些血浆进行长期储存, 或在 -35 C( 或更低温度 ) 下保存至少三个月 使用按 50:50 比例混合的添加物和患者血浆的混合物, 可检测出特定的异常 在 APTT 单一延长的情况下, 乏 FVIII 血浆优于老年人血浆 同样, 乏 FIX 血浆优于吸附血浆 注释 : 氢氧化铝可从 BDH 公司获得 ( 地址 :Poole, BH15 ITD, England) 虽然含有较弱抑制物或低滴度抑制物的血浆可能会被正常血浆部分纠正, 但是影 响 APTT 的非特异性抑制物 ( 如狼疮抗凝物质 ) 通常不能被纠正 抗 FVIII 的特异性抑制物的存在导致的 APTT 延长可能不能被正常血浆立即纠正 在其它情况下, 正常血浆可立即纠正 APTT, 之后混合物的 APTT 随之逐渐延长 测试血浆和正常血浆的混合物可于 37 C 下孵育 1 小时后再进行检测, 同时可对 单独孵育的正常血浆和测试血浆分别进行 APTT 检测 针对其他凝血因子的特异性抑制物十分少见, 但依旧存在 除了 FIX 抑制物是即 可反应抑制物, 其他的抑制物很难在混合实验中总结他们的特性 图 14.2 中给出了获得性 A 型血友病的 APTT 并显示抗 FVIII 抗体滴度的一些 示例, 并且描述了添加 20% 和 50% 正常混合血浆的作用 所使用的 APTT 检测 方法中,37 秒为正常范围的上限 这说明, 如果存在抗 FVIII 抗体, 按 50:50 比 例混合的患者血浆和正常混合血浆的混合物在某些情况下可能发生完全纠正 如 果这些混合物在 37 C 下孵育, 由于抗 FVIII 抗体抑制 FVIII,APTT 会逐渐延长 异常 PT 和 APTT 进一步研究的混合检测 41

48 图 出现单个因子缺乏情况下的混合检测结果模式 测试血浆缺乏 APTT 老年人血浆或 FVIII 缺乏 吸附血浆或 FIX 缺乏 正常血浆 FVIII abn no corr corr corr FIX abn corr no corr corr FXI/FXII abn corr corr corr 抑制物 abn no corr no corr no corr 测试血浆缺乏 PT APTT 老年人血浆 吸附血浆 正常血浆 FII abn abn corr no corr corr FV abn abn no corr corr corr FVII abn norm corr no corr corr FX abn abn corr no corr corr abn = 异常 ;no corr = 未纠正 ;corr = 纠正 图 获得性 A 型血友病中的混合研究 Bethesda 滴度 (U/ml) APTT( 秒 ) APTT + 20% 正常血浆 ( 秒 ) APTT + 50% 正常血浆 ( 秒 ) 血友病和其它出血性疾病诊断

49 凝血酶时间 15 原理 凝血酶时间反映了凝血酶与和纤维蛋白原之间的反应 凝血酶 纤维蛋白原 纤维蛋白 在以下情况下, 凝血酶时间延长 : 纤维蛋白原水平非常低 ( 小于 1.0 g/l) 时 ; 存在 肝素和肝素样物质时 ; 出现其它抑制物时, 如纤维蛋白 ( 原 ) 降解产物 (FDP); 纤 维蛋白原定性异常 ( 异常纤维蛋白原血症 ), 包括肝病继发性先天和后天性缺乏 试剂 在大约 15 分钟内诱导正常血浆凝结的凝血酶溶液 作用更强的溶液测得的凝血酶时间较短, 并且轻度缺乏时结果正常 方法 : 手工操作 1 将 0.2 ml 血浆加入玻璃凝血管 2 加温至 37 C 3 加入 0.2 ml 凝血酶 4 启动秒表 记录血浆凝固时间 5 应确定本地的正常参考值范围 6 重复测定两次 凝血酶时间 43

50 注释 所使用的凝血酶浓度为能使正常混合血浆 ( 对照 ) 测得凝血时间大约为 15 秒的 浓度 如果使用高浓度凝血酶, 则在生理盐水中稀释至约 U/ml, 并按要求 进一步稀释, 直到得到适当的对照时间 重组凝血酶可储存于 -35 C 或更低温度下, 并且在稀释后方可使用 稀释过的凝血酶在室温下会变质 每组测试均应包含正常混合血浆 44 血友病和其它出血性疾病诊断

51 鱼精蛋白硫酸中和凝血酶时间检测肝素 16 普通肝素和低分子量肝素的存在可导致凝血酶时间延长 延长凝血酶时间的分子量较大的肝素, 可用鱼精蛋白硫酸盐 (PS) 中和 很多医院的药房都提供鱼精蛋白硫酸盐, 用作逆转肝素效果的治疗性药物 治疗制剂的药物浓度通常远高于用于实验室检测目的制剂 因此, 应用生理盐水稀释至浓度为 40 mg% 的工作溶液 含 PS 的凝血酶工作溶液可通过将九份凝血酶试剂与一份 40 mg% 的 PS 混合而制得 可用于替代第 15 节所述的凝血酶溶液 应同时检测正常对照血浆 如果凝血酶时间延长但可纠正至不超过对照结果两秒, 则确认有肝素存在 鱼精蛋白硫酸中和凝血酶时间检测肝素 45

52 17 爬虫酶时间 原理 爬虫酶是从矛头蛇 (Bothrops atrox) 中获取的一种蛇毒 它是类似于凝血酶的一种酶, 直接作用于纤维蛋白原将其转化为纤维蛋白 抗凝血酶不对其产生抑制作用, 所以不会受到肝素的抑制 因此, 可用来评估肝素存在时纤维蛋白原 纤维蛋白的转换率 它有助于核查延长的凝血酶时间是否由样本中存在肝素所致 如果凝血酶时间延长但爬虫酶时间正常, 则最有可能的原因便是肝素的存在 存在异常纤维蛋白原血症时, 爬虫酶时间可能比凝血酶时间更灵敏 ( 即, 时间更长 ) 试剂 浓度为 25 mg/15 ml Owren 缓冲液溶解的爬虫酶 (Sigma Aldrich 公司, 代号 V5375) 该试剂有危险, 须小心避免吸入粉末 操作人员应佩戴手套和口罩 储备溶液应储存于 -70 C 下, 每等份 0.5 ml 在该条件下, 至少可稳定两年 使用前解冻储备试剂, 并用 Owren 缓冲液按 1/10 稀释 ; 分成等份, 然后于 -70 C 下再次冷冻备用 这种工作试剂在上述条件下至少可稳定三个月 分装的等份工作液应在 37 C 下水浴至少 3 分钟进行解冻 在 20 C 25 C 的环境 温度下使用时至少可稳定 12 小时 正常血浆 : 按第 7 部分所述制备的正常混合血浆 在 37 C 下水浴约 3 分钟进行 解冻 方法 所有检测均需重复 1 将足量的 mm 玻璃凝血管放在 37 C 下水浴 ( 每名患者血浆用二支, 加上 对照血浆两支 ) 2 将 0.3 ml 血浆 ( 对照血浆或患者血浆 ) 加入预温的凝血管中 3 加温 1 至 2 分钟 46 血友病和其它出血性疾病诊断

53 4 加入 0.1 ml 爬虫酶稀释液, 并启动秒表 5 倾斜 3 次混合, 然后每 5 秒钟倾斜 3 次, 直至血浆凝固 6 记录血浆凝固时间 7 对照时间应为 15 至 18 秒 ( 如果时间不足, 则用 Owren 进一步稀释爬虫酶试 剂进行调整 ) 8 如果血浆没有凝固, 则报告 >90 秒 正常参考值范围 患者血浆凝固时间应不超过对照血浆 3 秒 对照时间应和患者时间一同报告 释义 图 凝血酶时间延长解释 凝血酶时间 爬虫酶时间 原因 备注 延长 同等延长 低 / 无纤维蛋白原血症 测量纤维蛋白原 延长 大大延长 异常纤维蛋白原血症 先天或后天 延长 正常 肝素 延长 略有延长 肝素伴有低 / 异常纤维蛋白原血症 异常纤维蛋白原血症罕见病例可表现出这种模式 延长同等延长弥散性血管内凝血 (DIC) 测量 D - 二聚体 注意 有几个制造商提供工作浓度的爬虫酶试剂 这些试剂的优势是, 无需处理有健康和安全问题的粗毒制剂 如果使用其中一种试剂, 请遵照制造商的使用说明 正常参考值范围可能与以上所述不同, 但对结果的解释如图 17.1 所示 爬虫酶是一种昂贵的试剂, 可使用鱼精蛋白中和 / 凝血酶时间法 ( 第 16 节 ) 确认测试样本中是否含有肝素 爬虫酶时间 47

54 18 纤维蛋白原 ( 改良的 CLAUSS 检测法 ) 原理 将已知纤维蛋白原含量的标准正常血浆用甘恶啉缓冲液稀释 加入凝血酶后测定血浆凝固时间, 并以纤维蛋白浓度及血浆凝固时间作图 凝血时间与纤维蛋白原浓度成正比, 取 1/10 稀释液表示标准制剂的值 测试血浆稀释为 1/10, 结果从标准线中读取 试剂 含已知纤维蛋白原浓度的标准或参考血浆 凝血酶 30 U/ml 100 U/ml( 浓度根据不同来源可不同 ) 咪唑缓冲液 ( 甘恶啉 ) 或 Owren 缓冲液,pH 7.35 方法 1 用咪唑缓冲液按 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 稀释标准血浆 2 将两份 0.2 ml 每种稀释液加入玻璃凝血管内 3 加温至 37 C 2 分钟 4 加入 0.2 ml 凝血酶 (30 U/ml 100 U/ml) 并记录血浆凝固时间 5 对于手工操作, 测试需重复 如果采用自动化测试, 大多数凝血仪不需要如此 6 在双对数图纸上绘制平均血浆凝固时间与纤维蛋白原浓度曲线, 取 1/10 稀释液 表示标准值 7 测试血浆稀释为 1/10, 测定血浆凝固时间, 并从图上读取数值 应确定本地的正常参考值范围, 通常接近 1.5 g/l 3.5 g/l 对于大多数 Clauss 技术, 血浆凝固时间与纤维蛋白原在一定范围内呈线性关系, 通 常为 10 到 25 秒 48 血友病和其它出血性疾病诊断

55 对于正常测试血浆, 可按 1/10 稀释 对于低浓度 ( 例如,0.75 g/l 1.5 g/l) 血浆, 应按 1/5 稀释 ( 从图表中的读取值 再乘以 5/10 的值 ) 对于 <0.75 g/l 浓度的血浆, 应按 1/2 稀释 ( 从图表中的读取值再乘以 2/10 的值 ) 对于较高浓度 (>4 g/l) 的血浆, 应按 1/20 稀释 ( 从图表中的读取值再乘以 20/10 的值 ) 本检测不受静脉血栓栓塞所用治疗浓度肝素的影响 但是, 心肺分流术后所用的较 高浓度的肝素可延长血浆凝固时间, 从而使纤维蛋白原值检测值偏低, 除非试剂中 含有肝素中和剂 典型校准数据 注 : 校准曲线用当地使用的试剂建立 标准血浆 :2.1 g/l 纤维蛋白原 图 纤维蛋白原校准示例 标准稀释纤维蛋白原浓度 (g/l) 凝血时间 ( 秒 ) 1/ / / / 示例 : 测试血浆 1: 1/10 稀释液, 凝血时间 15 秒 纤维蛋白原 = 1.9 g/l( 根据校准图 ) 测试血浆 2: 1/5 稀释液, 凝血时间 16 秒 纤维蛋白原 = 1.8 g/l( 根据校准图 ) 5/10( 按 1/5 稀释, 而不是 1/10) = 0.9 g/l 有些凝血分析仪可通过测定凝血酶原时间估算纤维蛋白原水平 上述情况是有可能的, 因为血浆凝固导致的光散射或透射的变化与最初纤维蛋白原浓度成正比 这些方法通常被称为 PT 衍生的纤维蛋白原测定法 大部分 PT 衍生测定法具有局限性 特别是, 当纤维蛋白原水平非常低 (<1.5 g/l) 或升高 ( 超过 5 g/l) 时, 得到的结果往往比 Clauss 检测法的结果高出许多 有异常纤维蛋白原时, 结果通常为正常 关于这些问题, 请参阅 Mackie 等人 (2003) 的文献 纤维蛋白原 ( 改良的 CLAUSS 检测法 ) 49

56 此外, 还存在可测定未稀释测试血浆的 Clauss 纤维蛋白原含量测定方法, 但其结果 不可与运用稀释血浆的 Clauss 法测定结果等同 (Jennings et al. 2009) 参考文献 Jennings I, Kitchen DP, Woods TA, Kitchen S, Walker ID. Differences between multifibrin U and conventional Clauss fibrinogen assays: data from the UK National External Quality Assessment scheme. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20: Mackie IJ, Kitchen S, Machin SJ, Lowe GD. Guidelines on fibrinogen assays. Br J Haematol 2003; 121: 血友病和其它出血性疾病诊断

57 血浆中肝素的去除 19 原理 肝素酶 1(Hepzyme 的活性成分 ) 特异性针对肝素, 在每个分子的多个位点裂解, 产生失去抗血栓活性的寡糖 Hepzyme 是肝素黄杆菌中产生的一种纯化细菌肝素酶 1 它能消除每毫升血浆最多 2 IU 的肝素 Hepzyme 可用于中和样本中的肝素, 以便评估潜在的凝血状态 它特别适用于肝素污染的情况 试剂 Hepzyme 是一瓶含肝素酶 1 和稳定剂的干粉制剂 制造商 :Dade Behring 贮存 :4 C 稳定性 : 按制造商说明的有效期内 每瓶仅用于测试 1 名患者 方法 1 加入 1.0 ml 乏血小板枸橼酸钠抗凝血浆至 Hepzyme 瓶 2 加塞, 并轻轻翻转 5 至 10 次 3 室温下放置 15 分钟 4 转移至 2 ml 塑料样本杯中, 等待片刻让所有气泡消失 5 进行所需测试 检查所有肝素是否被成功去除时应包括凝血酶时间 测试应尽快进行 ( 即, 在该程序的测试指南规定的时间内 ) 释义 这种酶不会去除任何凝血因子 ( 不像有些去除肝素的替代技术 ), 因此,APTT 凝血酶时间或 PT 经 Hepzyme 处理后凝血时间大大缩短则表明肝素的存在 普通肝素和低分子肝素均可由这种酶降解 血浆中肝素的去除 51

58 20 纤维蛋白原抗原检测 放射状免疫扩散法 (RID) 简介 当 Clauss 纤维蛋白原检测结果明显低于凝血酶原时间衍生的纤维蛋白原或纤维蛋白原抗原法检测的结果时, 则怀疑有异常纤维蛋白原血症 (II 型纤维蛋白原缺乏症 ) Clauss 法通过加入高浓度凝血酶后确定纤维蛋白形成率而检测纤维蛋白原, 而其衍生方法则通过血浆凝固后形成的纤维蛋白凝块检测光密度 / 光散射的变化 纤维蛋白原抗原检测通过 Clauss 法检测活性降低, 抗原含量正常来诊断异常纤维蛋白原血症 无纤维蛋白原血症与血浆凝血异常和血小板功能缺陷导致的出血相关 众多缺陷导致异常纤维蛋白原血症, 可能表现为纤维蛋白肽 A/B 释放障碍以及纤维蛋白单体聚合异常 II 型缺陷可能无临床症状, 但有些变化与出血或血栓形成倾向有关 患者的出血或血栓形成倾向也可能与异常纤维蛋白原血症无关, 可能只是偶然发现 材料 NOR-Partigen 纤维蛋白原 R.I.D. 平板制造商 :Dade Behring 每板有 12 个孔 试剂 含已知浓度纤维蛋白原 ( 可追溯至 WHO 纤维蛋白原国际标准 ) 的校准血浆 待检血浆 : 枸橼酸钠抗凝血浆通常用生理盐水中稀释 ( 稀释或不稀释均可 ) 至约 2.5 g/l 的浓度 ( 如果该浓度预计大于 5 g/l) 小于 0.5 g/l 的结果报告为 <0.5 g/l( 灵敏度的下限 ) 方法 1 让 RID 板升温至室温, 然后取下盖子, 打开 5 分钟蒸发多余的水分 2 标准血浆在 100% 浓度以及用生理盐水按 75%, 50% 和 25% 稀释后进行检测 52 血友病和其它出血性疾病诊断

59 3 向孔中精确加入不同稀释度的 5μl 标准品 质量控制物 患者血浆 ( 最好两份 ) 需要加入小体积时, 精确移液器必不可少 4 样本扩散入凝胶 ( 加入样本后不超过 5 分钟 ) 后立即更换盖子, 并将平板在室温下平放于湿箱内约 48 小时 5 只要直径不超过 5.5 mm, 即可在 18 小时后估算结果 最终结果必须在 2 天后报告, 若直径大于 8 mm, 将平板再放一天, 让其完全扩散 直径 > 9.3 mm 表明纤维蛋白原水平超过分析灵敏水平, 在这种情况下, 样本必须用生理盐水稀释后重新检测 6 使用 Behring 板读取装置 ( 与板一起提供 ) 测量沉降直径 测量至最近的 0.5 mm 处, 并读取两次 ( 直径相互成 90 ) 7 绘制标准曲线 : 以直径 ² 与标准品浓度值于线性图纸上作图 8 从该曲线中读取质量控制血浆浓度和患者血浆浓度 9 如果质量控制血浆浓度在目标范围内, 则以 g/l 为单位报告 纤维蛋白原抗原检测 放射状免疫扩散法 (RID) 53

60 21 凝血因子 XIII 筛查 原理 凝血酶和钙激活 FXIII, 将纤维蛋白交联为稳定形式 在此方法中, 尽管使用枸橼酸钠抗凝血浆, 仍然有足够的钙离子来激活 FXIII 正常乙二胺四乙酸 (EDTA) 抗凝血浆用于对照 在该血浆中,EDTA 导致钙离子完全螯合,FXIII 不能交联纤维蛋白 加入 2% 乙酸或 5M 尿素导致非交联的纤维蛋白分解, 而 FXIII 活性大于 10 U/dl 的枸橼酸钠抗凝血浆仍有不溶性凝块 一般来说, 使用乙酸 ( 非尿素 ) 的检测灵敏度较高, 因为乙酸存在时纤维蛋白凝块会在 FXIII 较高水平时溶解 (Jennings et al. 2003) 材料 / 试剂 mm 的玻璃管 0.9% 生理盐水 30 U/ml 凝血酶 正常 EDTA 血浆 2% 乙酸 方法 1 加入 0.2 ml 柠檬酸化测试血浆至含 0.2 ml 0.9% 生理盐水的玻璃管 对于阳性对 照, 用 0.2 ml EDTA 血浆重复 对于阴性对照, 用 0.2 ml 柠檬酸化正常血浆重复 2 加入 0.1 ml 30 U/ml 凝血酶 混合 3 于 37 C 下放置 30 分钟 4 轻轻拍打试管使两侧散开 5 加入 5 ml 2% 乙酸, 给试管加塞 室温下放置 12 小时 54 血友病和其它出血性疾病诊断

61 结果 EDTA 血浆无可见凝块 柠檬酸化正常血浆应有完整可见的凝块 如果血块不可见, 则受试者有 FXIII 缺乏症 正常范围 对于正常受试者,2% 乙酸中在 12 小时后仍可见到凝块 注释 可使用 5M 尿素替代 2% 乙酸, 所需孵育时间为 18 小时 该方法比使用乙酸的 ( 如上所述 ) 灵敏度低 加钙使血浆凝固再用尿素使凝块溶解只有在 FXIII 水平低于 5 U/dl 时才会产生 异常结果 相比之下, 用 30 U/ml 凝血酶使血浆凝固后用再 2% 乙酸溶解可使 FXIII 水平低于 10 U/dl 时便有异常结果 (Jennings et al. 2003) FXIII 水平高于 5 U/dl 的患者也有可能出血 ( 参阅 Bolton-Maggs 等人 2004 年 的文献 ) 参考文献 Bolton-Maggs PH, Perry DJ, Chalmers EA, Parapia LA, Wilde JT, Williams MD, Collins PW, Kitchen S, Dolan G, Mumford AD. The rare coagulation disorders review with guidelines for the management from the UK Haemophilia Centre Doctors Organization. Haemophilia 2004; 10(5): Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Problems relating to the diagnosis of FXIII deficiency. Thromb Haemost 2003; 1: 凝血因子 XIII 筛查 55

62 22 凝血因子 II, V, VII 或 X 活性检测 基于 PT 法 原理 凝血因子 II, V, VII 和 X 均可使用基于凝血酶原时间的一步法进行检测 该检测包括比较标准或参考血浆和待检血浆稀释液纠正已知完全缺乏某种凝血因子血浆的凝血酶原时间的能力 例如 ( 如下所述 ), 在凝血因子 V 活性的检测中, 血浆缺乏凝血因子 V, 但含有正常量的凝血因子 II, VII, X 和纤维蛋白原 凝血因子 II, VII 和 X 可用类似方法检测, 可用以下示例中的乏 FV 血浆替代待检因子的乏因子血浆, 并使用含已知浓度待检凝血因子的参考血浆 试剂 y 乏 FV 血浆为凝血因子 V 先天性或后天性 ( 老年人血浆 ) 缺乏 y Owren 缓冲盐水 OBS 或甘恶啉缓冲液 ( 见第 9 节 ) y 乏血小板枸橼酸钠抗凝血浆 : 待检血浆和标准血浆标准血浆使用 20 名供血者正常混合血浆 ( 保存于 -70 C 或以下 ) 或商用参考或标准血浆 凝血活酶 / 钙 ( 与 PT 测试中使用的一样 ) 方法 1 按图 22.1 所示在塑料试管中制备待检血浆和标准血浆稀释液 图 测试和标准血浆稀释液的制备 稀释 血浆 (ml) OBS (ml) 1/ / / (1/10) 0.5 1/ (1/20) 血友病和其它出血性疾病诊断

63 注 : 在使用 1/10 稀释液制备 1/20 稀释液之前, 要充分混匀 1/10 稀释液 在使用 1/20 稀释液制备 1/40 稀释液之前, 要充分混匀 1/20 稀释液 血浆稀释液应在制 备后立即测试 如果室温超过 25 C, 有必要在分析之前将稀释液于湿冰上保存 2 按以下操作检测参考或标准血浆的稀释液 : i. 将 0.1 ml 的各种稀释度的稀释液加入 mm 的玻璃试管内 ii. 加入 0.1 ml 乏凝血因子 V 血浆 iii. 加温至 37 C 2 分钟 iv. 加入 0.2 ml 预加温的凝血活酶 / 钙试剂 v. 启动秒表并混合 注 : 如果凝血活酶试剂不含有钙, 则将 0.1 ml 凝血活酶加入稀释液和乏因子血浆的混合物中 升温至 37 C 1-2 分钟后, 混合物中加入 0.1 ml 预加温 ( 至 37 C) 的钙溶液中 3 记录血浆凝固时间 4 重复各种稀释度血浆的检测 对于预期正常的待检血浆, 检测按 1/10 1/20 和 1/40 稀释的稀释液 对于预期 凝血因子含量下降的待检血浆, 检测按 1/5 1/10 和 1/20 稀释的稀释液 对于 空白 管也应按以下操作检测 : 0.1 ml OBS 0.1 ml 乏凝血因子 V 血浆 0.2 ml 凝血活酶 / 钙试剂 空白 管的血浆凝固时间反映了乏因子血浆的质量, 其因子活性应小于 1% 结果 在 3 2 周期对数表上以对照和待检血浆的血浆凝固时间和 FV 的浓度绘图 该类图表的示例 (FVIII 检测法 ) 如第 23 节所示 1/10 稀释代表 100% 活性, 因此,1/5 稀释相当于 200% 活性, 以此类推 在对数标尺上绘制浓度, 在线性标尺上绘制血浆凝固时间 从这些图中推断出相对于正常血浆或标准参考血浆的患者血浆中的 FV 相对含量 示例参见基于 APTT 检测法一节 ( 图 23.1) 等于 100% 活性的检测血浆的凝血时间 (100% 浓度的标准血浆处对应的待测血浆的 PT 值 ) 可从标准曲线中读取, 不同浓度 凝血因子 II, V, VII 或 X 活性检测 基于 PT 法 57

64 的标准血浆均对应着各自的 PT 值 由此曲线可以得出待测血浆中的凝血因子相对于 标准血浆因子活性的百分比 该百分比乘以标准血浆中凝血因子浓度 ( 单位为 IU/dl) 可得出待检血浆中的凝血因子浓度 ( 单位为 IU/dl) 注释 对于上述每种凝血因子, 应确定当地的正常参考值范围, 但 FV FVII 和 FX 的 下限通常为 IU/dl 正常 FII 的下限值较高 在一项研究中, 有 FII 缺乏症 家族史的正常受试者以及其它无关的正常受试者的 FII 含量范围为 IU/dl (Girolami et al.1998) 另一个中心报告了 IU/dl 的参考值范围 (Bolton Maggs et al. 2004) FV 含量下降的个体也应进行 FVIII 检测, 以排除 FV 和 FVIII 联合缺陷症 在有些 FVII 缺乏症的病例中, 根据凝血活酶来源不同, 所测得的 FVII:C 含量可 能有差异 因此, 建议使用人凝血活酶, 在此基础上获得的结果可能更能反映出 体内的活性 参见 Bolton-Maggs 等人 (2004) 的文献 在某些罕见情况下, 如果 使用兔凝血活酶, 结果可能会偏低, 但如果检测中使用人凝血活酶, 则正常 这 可能是有些重度 FVII 缺乏症患者无出血症状的原因 参考文献 Bolton-Maggs PH, Perry DJ, Chalmers EA, Parapia LA, Wilde JT, Williams MD, Collins PW, Kitchen S, Dolan G, Mumford AD. The rare coagulation disorders review with guidelines for the management from the UK Haemophilia Centre Doctors Organization. Haemophilia 2004; 10(5): Girolami A, Scarano L, Saggiorato G, Girolami B, Bertomoro A, Marchiori A. Congenital deficiencies and abnormalitoies of prothrombin. Blood Coagul Fibrinol 1998: 9: 血友病和其它出血性疾病诊断

65 FVIII:C, FIX, FXI 或 FXII 一步法检测 基于 APTT 23 原理 本节描述了 FVIII 一步法检测 这种检测法基于比较标准和待检血浆稀释液纠正已知完全缺乏 FVIII, 但含有正常凝血所需的其它所有因子血浆的 APTT 的能力 对于因子 IX, XI 和 XII, 检测方法基本相同, 以相关因子缺乏血浆替代乏 FVIII 血浆以及选择适当的参考血浆后进行检测 试剂 y 乏血小板柠檬酸化待检和标准血浆所使用的标准血浆应是本地制备的混合血浆 ( 保存于 -70 C 或以下 ) 或商用标准血浆 无论是哪种情况, 参考血浆都必须用 FVIII 的国际标准进行校准 正常混合血浆有 100 U/dl 的 FVIII:C 是一种理想的假设 y 乏 FVIII 血浆该血浆可从商业途径获得, 也从 FVIII 水平低于 1 U/dl 不含抗 FVIII 抗体 两周未接受过治疗 以及肝功能正常的献血者中采集 肝功能异常可导致其它凝血因子水平的下降, 从而影响该检测的特异性 该血浆可等份储存于 -37 C 最好使用正常血浆经 FVIII 免疫吸附 ( 使用单克隆抗体 ) 产生的乏 FVIII 血浆 可从商业途径获得, 与接受过血浆产品治疗的血友病患者的血浆相比, 其被病毒污染的可能性更小 然而, 并非所有免疫吸附血浆中的 FVIII 水平都 <1 U/dl, 应注意核实 有些专家认为, 乏 FVIII 血浆中含有正常浓度的 VWF 可能更好, 并且在 FVIII 活性检测作为 FVIII 抑制物测定的部分, 有证据支持这种优势 APTT 试剂 Owren 缓冲生理盐水 (OBS 或甘恶啉缓冲液 ; 见第 9 节 ) 25mM CaCl 2 方法 1 用塑料试管中的生理盐水制备标准和待检血浆的 1/10 稀释液 ( 如果测试血浆预期凝血因子 VIII 含量很低, 则以 1/5 稀释开始 ) FVIII:C, FIX, FXI 或 FXII 一步法检测 基于 APTT 59

66 2 取 0.2 ml 体积, 在塑料试管中制备按 1/10 至 1/40 稀释的标准和待检血浆 OBS 的倍比稀释液 ( 在转移到下一个试管之前将每个稀释液充分混匀 ) 血浆稀释液应在制备后立即检测 如果室温超过 25 C, 有必要在测试之前将稀释液于湿冰上保存 3 将 0.1 ml 的每份标准稀释液加入 75 x 10 mm 的玻璃试管内 4 加入 0.1 ml 乏 FVIII 血浆, 并转至 37 C 水浴 5 加入 0.1 ml APTT 试剂, 并孵育 5 分钟 6 5 分钟后加入 0.1 ml CaCl 2 并记录血浆凝固时间 同时, 空白 对照应按如下步骤进行 : 0.1 ml OBS 0.1 ml 乏 FVIII 血浆 0.1 ml APTT 试剂 孵育 5 分钟 0.1 ml CaCl 2 空白对照物的凝血时间不得长于校准表中标准血浆 1% FVIII 活性所对应的时间 如果时间较短, 则表明基质血浆仍含有一定量的 FVIII, 因此, 不是一种合适的 基质血浆 结果 结果绘制如第 22 节所示, 要求为双对数或对数 / 线性标尺图纸 将 1/10 稀释的标准血浆 FVIII:C 赋值为 100%,1/20 稀释为 50%,1/40 稀释为 25% 应获得两条互相平行的直线 读取待检样本的浓度, 如图 22.1( 第 22 节 ) 所示 在此示例中, 待检样本的 FVIII 浓度是标准样本 FVIII 浓度的 7% 如果标准样本的浓度为 85 IU/dl, 则测试样本的浓度为 85 IU/dl 7% = 6 IU/dl 如果直线不平行, 则应重复检测 直线不平行也可能是技术误差所致 如果排除了技术误差, 则有可能是血浆中含有抑制物所致, 这些抑制物可能是特异的 FVIII 抑制物或是狼疮型抗凝物质, 呈现出聚合模式 交叉直线通常发生于被激活的样本 注释 如果待检血浆 FVIII( 或 FIX FXI 或 FXII) 浓度接近零 ( 即, 所有稀释液的凝 血时间与空白对照类似 ), 则可出现不平行的直线 60 血友病和其它出血性疾病诊断

67 应确定当地的正常参考值范围, 但 FIX 或 FXI 的下限值通常为 IU/dl 对于 FXI, 国际单位最近已确立 在撰写本文时, 报导的以 IU 为单位的 FXI 正 常含量值的相关资料很少 以往提出的以 IU 为单位的文献指出,FXI 正常范围 的下限值为 U/dl( 参见 Bolton-Maggs 等人 2004 年的文献 ) 图 23.1.FVIII 检测图 200 Clotting 凝血时间 Time ( 秒 (sec) ) 待检血浆 Test 标准血浆 Standard /40 1/20 1/ % 因子 Factor VIII VIII 活性 Activity % 参考文献 Bolton-Maggs PH, Perry DJ, Chalmers EA, Parapia LA, Wilde JT, Williams MD, Collins PW, Kitchen S, Dolan G, Mumford AD. The rare coagulation disorders review with guidelines for the management from the UK Haemophilia Centre Doctors Organization. Haemophilia 2004; 10(5): FVIII:C, FIX, FXI 或 FXII 一步法检测 基于 APTT 61

68 24 冷沉淀中的凝血因子 VIII:C 检测 如果待检样本中含有正常或接近正常水平的 FVIII:C, 则第 23 节所述的检测条件可以采用 如果水平高于 150IU/dl, 则这些条件需要调整以使检测方法可行 冷沉淀中 FVIII:C 的水平可因供体个体不同而不同, 但一般均在 IU/dl 范围内 在这些水平中, 待检标本必须在检测前预先稀释以降低浓度 对于大多数冷沉淀, 按 1:5 或 1:10 的比例预稀释将浓度降低至第 23 节所述检测方法所要求的水平 ( 即, 预稀释标本在分析缓冲液中按所述方法以 1/5 1/10 1/20 进一步稀释 ) 如果冷沉淀未预先稀释至合适的浓度, 则不能获得线性的样本曲线, 或样本曲线不能与校准曲线相平行 这样的检测将失败, 并且结果也不准确 在 FVIII:C 检测之前应立即完成冷沉淀的预稀释 有些中心使用 FVIII:C 检测法中的缓冲液来稀释 ( 如 :Owren 缓冲液或咪唑 / 果绿定 ), 而另一些中心则使用乏 FVIII 血浆稀释 一般情况下, 如果使用乏 FVIII:C 血浆, 这种预稀释液可能更稳定 因此, 乏 FVIII:C 血浆为首选稀释剂 各中心对冷沉淀的 FVIII 检测精度与检测血浆样本时的精度要求类似 (Jennings et al. 2009) 参考文献 Jennings I, Kitchen DP, Woods TA, Kitchen S, Walker ID, Preston FE. Laboratory performance in the World Federation of Hemophilia EQA programme Haemophilia 2009; 15: 血友病和其它出血性疾病诊断

69 凝血因子 VIII:C 的两步法凝血检测 25 原理 在 1955 年, 此法作为凝血活酶稀释检测的改良方法 两步法 FVIII:C 检测原理是 : 在含有过量 FX 激活的 FIX 磷脂 钙和 FV 的检测混合液中, 系统中的 FVIII 含量限制了凝血速率 氢氧化铝吸附血浆去除了活化的因子及维生素 K 依赖性因子 需去除凝血酶原, 使最初孵育混合液中不含有这种酶 如果没有这一步骤, 则混合液中将包含形成纤维蛋白所需的所有成分, 之后混合液将凝固 被吸附的标准和待检血浆的稀释液在第 1 步用组合试剂进行孵育后生成 FXa 正常混合血浆中凝血酶原和纤维蛋白原将在第 2 步加入, 使凝块形成并使血浆凝固时间依赖于凝血因子 VIII:C 的最初含量 试剂 组合试剂 ( 参见以下的 组合试剂的生产 ) Owren 佛罗那缓冲液 正常混合血浆 ( 基质血浆 ): 超冷冻储存 标准血浆或参考血浆 内部质量控制 (IQC) M Cacl 2 ( 如 :APTT 测试中使用的按 1:2 稀释的 0.025M CaCl 2 ) 氢氧化铝混悬液 ( 如 :SIGMA 目录代号 A8222): 在室温下储存 样本要求 枸橼酸钠抗凝血浆, 如果需要, 可在测试前冷冻保存 方法 1 用蒸馏水重悬标准血浆 10 分钟后使用, 并且用 3 ml M CaCl 2 重组组合试 剂至少 15 分钟后使用 2 制备 IQC 血浆和基质血浆 如果有任何血浆冻结, 则使用前在 37 C 下解冻 5 分钟 凝血因子 VIII:C 的两步法凝血检测 63

70 3 为盛放每份样本 ( 包括 IQC 和标准样本 ) 的一次性塑料试管贴标签 4 将 0.45 ml 标准 IQC 和患者血浆放入对应的塑料试管中 5 将 50 μl 充分混匀的氧化铝溶液加入每根试管, 充分混匀 6 对于少量血浆, 加入 ml 血浆和 25 μl 氧化铝溶液 7 在 37 C 下孵育 3 分钟, 以 5000 g 旋转 2 分钟 8 立即将上层血浆转移至与使用的分析仪兼容的塑料量杯或试管中 注意不要混起沉淀的氧化铝 注 : 以下步骤以使用 Sysmex CA 系列分析仪为基础 该检测可在一些其他制造商的仪器上执行 本手册的一名共同作者已成功地用来自 Instrumentation Laboratory 的分析仪进行了检测, 该方法与其它类型的分析仪也兼容 因此, 这种特殊的方法列为一个示例介绍 9 装载组合试剂 检测缓冲液 正常混合血浆 / 基质血浆至自动分析仪上 1 0 吸附血浆按以下顺序用于分析中 : 标准血浆 IQC 血浆 患者血浆 最后用第二份标准血浆 FVIII 浓度正常的样本通常使用 1/50 1/400 三种不同的稀释方法进行检测 如果 FVIII 含量低 (< 0.05 IU/dl), 可按 1/10 1/20 和 1/50 稀释 如果 FVIII 含量升高 (>1.5 IU/dl), 可按 1/800-1/3200 稀释 否则, 患者剂量反应线可能与标准线不平行 结果 结果绘制和 FVIII 活性计算如一步法检测中 ( 第 23 节 ) 所述 25.1 两步法因子 FVIII:C 检测所用的混合试剂的制备 取足量的 FV 和磷脂与稀释的老年人血清按 5:1:1 的比例制备 ( 即,5 份血清对 1 份 磷脂和 1 份 FV) 例如,240 ml 稀释血清 48 ml FV 和 48 ml 磷脂 ( 或 180 ml: 36 ml:36 ml) 试剂 老年人血清 1. 玻璃试管中采集自至少 6 名正常供血者的 10 ml 血液 ; 无添加物 64 血友病和其它出血性疾病诊断

71 2. 在 37 C 下孵育 4 小时, 然后在 4 C 下过夜 3. 以 3000 rpm 旋转 10 分钟 4. 在硅化玻璃管中分离并吸出, 制备混合血清 ( 可冷冻保存 ) y 牛 FV(Diagnostic Reagents 公司, 地址 :Thame, Oxfordshire, England) 用 1 ml 甘恶啉缓冲液重悬每份样本 y 磷脂 (Bell 和 Alton,Diagnostic Reagents 公司, 地址 :Oxford England) 用 1 ml 甘恶啉缓冲液 ( 即,5 倍浓度 ) 重悬每份样本 甘恶啉缓冲液 HEPES 酸 (Sigma H3375) 方法 1 用甘恶啉缓冲液按 1/10 比例稀释老年人血清 2 每毫升血清中加入一个小玻璃球 ( 路标玻璃球 ) 激活稀释血清一小时, 然后放置于旋转混合器上一小时, 并用实验室所用薄膜覆盖在顶部 ( 注 :100 个路标玻璃球的重量为 3.7 g) 注 : 对于第 3 至第 8 步, 要尽快执行 3 用 1 ml 甘恶啉缓冲液重悬 FV 血浆 4 用 1 ml 甘恶啉缓冲液重组磷酸 5 稀释的活化血清 FV 和磷酸按 5:1:1 的比例混合 6 充分混匀, 加入 HEPES 粉, 使之浓度为 1%, 以将 ph 值稳定于 7.0( 例如, 如 果为 300 ml 液体, 则加入 3 g HEPES) 7 分为每份 0.5 ml 8 可冻干 ( 参见第 40 节关于冻干处理内容 ) 9 按以下所述检验新试剂的最佳条件 FXa 生成稳定状态评估 最佳样本稀释方法 培养时间 检测所用的总体积 M CaCl 2 重悬体积 重悬 时间 以及重悬混合试剂的稳定性需要系统评估以了解 FXa 生成的稳定状态 凝血因子 VIII:C 的两步法凝血检测 65

72 以下情况发生的顺序和程度尚不明确 根据批号不同, 会有变化 很好的出发点是 在相同条件下使用当前批次, 然后, 每次变化一个参数 含 M CaCl 2 的重组体积 :0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml, 2 ml, 2.5 ml, 3 ml, 3.5 ml 使用前的重组时长 / 重组后的稳定性 : 使用前立即重组 5 分钟 10 分钟 30 分 钟 60 分钟 120 分钟 培养时间 :5 分钟 6 分钟 7 分钟 8 分钟 9 分钟 10 分钟 样本稀释 : 1/20, 1/50, 1/80, 1/100. 检测所用组合试剂的体积 :20 μl, 30 μl, 40 μl, 50 μl 等 每次进行检测时, 根据图 25.1 中的示例在双对数图纸上绘制所有结果 选择有曲线 直线部分中大部分点的稀释法和条件 第一次稀释的理想条件中, 凝血时间约为 20 至 30 秒 注释 : 正常混合血浆 / 底物来自于凝血筛查中检测后剩余的正常血浆或来自于健康正常 人的血浆 每份混合血浆的 PT 和 APTT 均要正常 正常混合血浆可以 3 ml 或 5 ml 装入塑料瓶, 在 -80 C 下储存至少六个月 图 25.1.FXa 生成稳定状态示例 66 血友病和其它出血性疾病诊断

73 发色底物法 FVIII:C 的检测 26 简介 很多年以来, 全球最常用 FVIII:C 的检测方法为一步法检测, 如第 23 节所述 一步法检测有诸多局限, 包括 : 如果存在狼疮抗凝物则有干扰 更重要的是, 一步法检测的正常 FVIII:C 含量结果不能排除轻度血友病 A 几个研究报道显示采用不同的检测法测定测得的轻度血友病 A 患者的 FVIII 活性存在差异 (Parquet-Gernez et al. 1988, Duncan et al. 1994, Duncan et al. 1999) 20% 以上的轻度血友病 A 患者与此差异相关, 表明不同检测系统所得结果存在着两倍差异 (Parquet- Gernez et al. 1988) 在有些病例中, 一步法检测获得的结果比两步法或发色底物法获得的结果高五倍 (Parquet- Gernez et al.1988) 最常见的是, 一步法获得的结果比两步法或发色底物法获得的结果高两倍以上 但在上述四分之三以上的患者中, 所有检测结果低于参考范围的下限, 从而不论使用何种方法进行分析, 均可作出可靠的诊断 然而, 在一小部分患者中, 一步法获得的结果完全在正常值范围内, 但是两步法或发色底物法测得的结果降低 (Keeling et al.1999, Mazurier et al.1997) 这些患者有出血病史, 与两步法或发色底物法测得的低水平一致 在很多病例中, 基因缺陷以被检测到, 所以毫无疑问这些受试者确实患有血友病 (Rudzi et al. 1996, Mazurier et al. 1997) 根据文献, 约有 5%-10% 经基因分析确认为轻度血友病 A 的患者一步法 FVIII:C 检测正常 由于 FVIII 活性在一步法 APTT 检测中正常, 因此,APTT 在这些患者检测中也正常就不足为奇 这提示有轻型血友病 A 临床病史的患者还用采用两步法 ( 参见第 25 节 ) 或发色底物法检测, 即使 APTT 和一步法检测结果为正常也应如此 发色底物法检测 FVIII:C 有商业化试剂盒提供 适用于一步法 FVIII:C 检测正常血友病 A 患者的进一步检测 这些患者结果的示例如图 26.1 所示 应用 Siemens/Dade Behring 公司提供的商用发色底物检测试剂盒, 但是其最终结果并没有显示出优于其它类似检测方法, 这些方法也同样成功地用于类似的检测 有这样的轻型血友病 A 病例 : 一步法检测结果 FVIII:C 下降, 但是两步法或发色底物法测得结果正常 (Mumford et al. 2002, Lyall H et al. 2008) 有许多病例( 但不是全部病例 ), 没有个人或家族出血病史也不需要 FVIII 替代治疗, 他们的临床表型与发色底物法或两步法检测 FVIII:C 相一致 (Lyall H et al. 2008) 发色底物法 FVIII:C 的检测 67

74 图 经基因确认为轻度血友病 A 患者以及检测结果差异示例 病例 一步法 (IU/dl) 两步法 (IU/dl) 发色底物法 (IU/dl) A B C D E F G 基于上述结果, 血友病中心应该能够进行发色底物法及两步法检测 FVIII:C 应对 APTT 正常且一步法检测 FVIII:C 正常的个人和家族临床出血史与轻型血友病相一致的受试者中进行上述两种方法测试 一种改良的发色底物法 (Coamatic 检测法的改良版本,Instrumentation Laboratory 公司 ) 已有报道 适合于 FVIII 水平非常低时检测 (Yatuv et al. 2006) 据报道这种方法在 FVIII:C 为 IU/dl 范围内可准确和精确测量 FVIII(0.1-2% FVIII, 或 IU/ ml) 分析原理 在有些 ( 但不是全部 ) 发色底物法中, 样本中的所有 FVIII 被凝血酶激活 在活化的 FIX 磷脂和钙离子存在条件下, FVIII a 加速 FX 向 FXa 转换 FXa 活性通过水解 FXa 特异的对硝酸苯胺基质而进行计算 在 405 nm 下测得的对硝酸苯胺 ( 黄色 ) 释放初始率与 FXa 活性成正比, 与样本中的 FVIII 活性也成正比 请参阅 Lundblad 等人 (2000) 的文献 参考文献 Duncan EM, Duncan BM, Tunbridge LJ, Lloyd JV. Familial discrepancy between the one-stage and two-stage factor VIII assay methods in a subgroup of patients with haemophilia A. Br J Haematol 1994; 87: Keeling DM, Sukhu K, Kemball-Cook G, Waseem N, Bagnall R, and Lloyd JV. Diagnostic importance of the two stage FVIII:C assay demonstrated by a case of mild hemophilia associated with His1954 Leu substitution in the FVIII A3 domain. Br J Haematol 1999; 105: 血友病和其它出血性疾病诊断

75 Lundblad RL, Kingdon HS, Mann KG, White GC. Issues with the assay of FVIII activity in plasma and FVIII concentrates. Thromb Haemost 2000; 84: Lyall H, Hill M, Westby J, Grimley C, Dolan G. Tyr346 Cys mutation results in factor VII:C assay discrepancy and a normal bleeding phenotype: Is this mild haemophilia A? Haemophilia 2008; 14: Mazurier C, Gaucher C, Jorieux S, Parquet-Gernez A. Mutations in the FVIII gene in seven families with mild haemophilia A. Br J Haematol 1997; 96: Mumford AD, Laffan M, O Donnell J, McVey JH, Johnson DJD, Manning RA, Kemball-Cook G. A Tyr346 Cys substitution in the interdomain acidic region a1 of FVIII in an individual with FVIII:C assay discrepancy. Br J Haematol 2002; 118: Parquet-Gernez A, Mazurier C, Goudemand M. Functional and immunological assays of FVIII in 133 haemophiliacs: Characterisation of a subgroup of patients with mild haemophilia A and discrepancy in 1- and 2-stage assays. Thromb Haemost 1998; 59: Rudzi Z, Duncan EM, Casey GJ, Neuman M, Favaloro RJ, Lloyd JV. Mutations in a subgroup of patients with mild haemophilia A and familial discrepancy between one-stage and two-stage factor VIII:C methods. Br J Haematol 1996; 94: Yatuv R, Dayan I, Baru M. A modified chromogenic assay for the measurement of very low levels of FVIII activity (FVIII:C). Haemophilia 2006; 12: 发色底物法 FVIII:C 的检测 69