doc

Size: px

Start display at page:

Download "doc"

钮萧
7 years ago
Views:

1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): 毛细管电泳中万古霉素拆分氧氟沙星对映体手性识别位点的探讨胡昌勤 1*, 洪建文 1, 2 (1. 中国药品生物制品检定所, 北京 ; 2. 广东省药品检验所, 广东广州 ) 摘要 : 以大环类抗生素万古霉素和去甲万古霉素为手性选择剂, 通过比较手性选择剂的浓度电泳缓冲液 ph 分离电压对氧氟沙星安妥沙星及其右旋异构体拆分的影响作用, 结合利用 Chem 3D 软件中的分子力学算法 (molecular mechanical method) 对万古霉素去甲万古霉素不同空间区域 (domain) 与氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体相互作用的最稳定结合能的计算结果, 探讨万古霉素在毛细管电泳中拆分氧氟沙星的手性识别位点万古霉素和去甲万古霉素均可形成 2 个不同的空间域, 万古霉素 I 区为拆分氧氟沙星的手性识别位点 ; 氧氟沙星 C-6 的羧基与万古霉素糖链中羟基的氢键相互作用氧氟沙星分子与万古霉素 I 区形成的袋状结构的匹配程度和氧氟沙星 C-10 哌嗪侧链中的甲基与万古霉素分子中 N 甲基亮氨酸中的甲基的疏水相互作用, 决定了万古霉素手性识别位点与氧氟沙星的相互作用程度关键词 : 手性识别位点, 万古霉素 ; 去甲万古霉素 ; 氧氟沙星 ; 毛细管区带电泳 ; 分子力学算法中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : (2009) Investigation on the chiral recognition site of enantioselective separation of ofloxacin by capillary zone electrophoresis using vancomycin as a chiral selector HU Chang-qin 1*, HONG Jian-wen 1, 2 (1. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing , China; 2. Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou , China) Abstract: The chiral recognition site of the macrocyclic antibiotic vancomycin, used as a chiral selector in capillary electrophoresis (CE), was studied with ofloxacin, antofloxacin (a new fluroquinolone antibiotic under development) and R-antofloxacin, as well as with norvancomycin. Enantioselectivity of vancomycin and norvancomycin was compared. The influence of vancomycin concentration, ph of buffer, and separation voltage in CE were examined in order to investigate interactions between enantiomers and vancomycin. Furthermore, interactions of chiral selectors and enantiomers were calculated by molecular mechanics method with Chem 3D software. The result indicates that both vancomycin and norvancomycin have two domains in 3D structure, and the domain I of vancomycin was considered to be the chiral recognition site of ofloxacin. The degree of interaction between vancomycin and ofloxacin is determined as follows: hydrogen bond occurring with carboxylic group at C-6 of ofloxacin and hydroxyl group of sugar part of vancomycin, the matching degree of molecular sizes of ofloxacin with the pocket in domain I of vancomycin and the hydrophobic interaction between methyl group at C-10 of piperidine group of ofloxacin and N-methylleucine of vancomycin. Key words: chiral recognition site; vancomycin; norvancomycin; ofloxacin; capillary zone electrophoresis; molecular mechanics method 收稿日期 : * 通讯作者 Tel: , Fax: , hucq@nicpbp.org.cn 万古霉素 (vancomycin) 是一种糖肽大环抗生素手性选择剂, 具有篮型的化学结构 ( 图 1) 和 18 个手 [1] 性中心, 自 1994 年被 Armstrong 等作为手性选择剂

2 906 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): 使用以来, 在毛细管电泳 (CE) 分离对映体的研究中被广泛应用, 且至今依然是一类重要的手性选择剂 [2] 去甲万古霉素 (norvancomycin) 与万古霉素具有相似的化学结构, 但万古霉素分子中的 N 甲基亮氨酸被亮氨酸取代, 因此使其对对映体的选择特性与万古霉素不同 [3] ; 万古霉素类似物作为潜在的手性选择剂亦引起人们极大的兴趣 [4] ; 近年来已有多篇利用去甲万古霉素作为手性选择剂分离手性药物的报道, 并探讨其与万古霉素手性选择作用的差异 [5, 6] 尽管糖肽大环抗生素手性选择剂已用于多种物质的分离, 对其手性识别的机制也有了一定的认识, 但它们的识别机制并未被完全阐明 [2, 7] 阐明这些选择试剂的手性识别位点及其作用程度, 不仅可为正确预测分离条件可分离物质对的类型对映体分离的数量级及洗脱顺序等提供有价值的信息, 还可以为寻找新的具有高分离能力的手性选择试剂提供一定的理论指导氧氟沙星 (ofloxacin, OFLX) 作为第 3 代喹诺酮抗生素, 对大多数需氧性革兰阴性菌具有较强的抗菌活性氧氟沙星为左旋异构体与右旋异构体组成的消旋混合物, 其中左旋异构体 (levofloxacin, S-OFLX) 比右旋异构体 (R-OFLX) 的抗菌活性强 8~128 倍左氧氟沙星的 8- 氨基衍生物安妥沙星 (antofloxacin) ( 图 2) 是国内正在开发的新药, 目前正在进行临床研究采用 CE 技术已成功地实现了对氧氟沙星对映异构体的拆分 [8 10] [10] Arai 等以万古霉素为手性选择剂, 不仅拆分了氧氟沙星对映体, 并依据万古霉素与氧氟沙星对映体及其衍生物相互作用后电泳行为的差异, 对万古霉素拆分氧氟沙星的机制进行了推测本文利用 CE 技术, 比较以万古霉素和去甲万古霉素分别为手性选择剂时, 对氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋体的拆分情况 ; 并通过计算化学中的分子力学算法 (molecular mechanical method), 根据最低能量原理, 分别计算万古霉素与氧氟沙星对映体相互作用的最稳定结构 ; 进而分析其相互作用位点程度, 进一步探讨万古霉素的手性识别位点 Figure 2 Structure of levofloxacin (R=H) and antofloxacin (R=NH 2) 材料与方法仪器与试药 Agilent HP3D 毛细管电泳仪 ; 熔融石英毛细管 55 cm 75 μm (ID) ( 有效柱长为 50 cm); 二极管阵列检测器 ; HP3D 工作站 ; Millpore 纯水机盐酸氧氟沙星盐酸左氟沙星盐酸安妥沙星及其右旋异构体均由中国药品生物制品检定所提供 ; 万古霉素去甲万古霉素为国家标准品, 由中国药品生物制品检定所提供 ; 其他试剂均为分析纯实验用水为 Millpore 超纯水 HPCE 方法参照文献 [10] 方法运行缓冲液 : 100 mmol L 1 醋酸钠缓冲液, 其中含有不同浓度的万 Vancomycin R=CH 3 Norvancomycin R=H Vancomycin Figure 1 Structures of vancomycin and norvancomycin. In the 3D (three-dimensional) structure, gray represents atoms of C; red, atoms of O; blue, atoms of N; green, atoms of Cl; sky-blue, atoms of H

3 胡昌勤等 : 毛细管电泳中万古霉素拆分氧氟沙星对映体手性识别位点的探讨 907 古霉素或去甲万古霉素, 使用前用 0.45 μm 滤膜过滤 ; 电极电压 : 10 kv; 检测波长 : 297 nm; 柱温 : 25 ; 进样 : 压力 (345 kpa) 进样 4 s; 每次更换运行缓冲液前, 用 1 mol L 1 氢氧化钠冲洗 5 min, 超纯水冲洗 2 min, 再用运行缓冲液冲洗 5 min 供试溶液 : 取盐酸氧氟沙星适量, 精密称定, 加水溶解并稀释成 1 mg ml 1 的溶液 ; 取盐酸左氟沙星适量, 精密称定, 加水溶解并稀释成含 0.5 mg ml 1 的溶液 ; 取盐酸安妥沙星及其右旋对映异构体适量, 精密称定, 加水溶解并稀释成分别含 0.5 mg ml 1 的溶液及混合溶液 ; 使用前均用 0.45 μm 滤膜过滤结果 1 万古霉素的手性选择性 HPCE 中万古霉素作为手性选择剂, 对氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体均有手性识别能力, 且均表现为左旋异构体 (S 构型的化合物 ) 的迁移时间较短 ( 图 3); 在同样的电泳条件下, 万古霉素对氧氟沙星对映体的拆分效果比其对安妥沙星与其右旋异构体 (R 构型的化合物 ) 的拆分效果好 ( 表 1) 但保持电泳条件不变, 以去甲万古霉素作为手性选择剂时, 虽然氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体的迁移行为与万古霉素作为手性选择剂时的迁移行为相似, 但对映体的拆分效果非常差 ( 图 3) 上述结果提示, 万古霉素去甲万古霉素对氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体的手性识别机制相同 ; 但万古霉素分子中的 N 甲基亮氨酸被亮氨酸取代后, 其对氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体的手性拆分能力大大减弱 2 电泳条件对氧氟沙星对映体拆分的影响以含不同浓度万古霉素的醋酸钠缓冲液 (100 mmol L 1, ph 4.0) 为运行缓冲液, 在电极电压为 10 kv 条件下, 考察手性选择剂浓度对拆分的影响未添加万古霉素时, 氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体的迁移时间分别为 6.4 min 和 6.3 min; 随万古霉素浓度的增加, 药物对映体的迁移时间变长, 分离度变大 ( 表 1); 当万古霉素的浓度为 7 mmol L 1 时, 安妥沙星与其右旋异构体, 以及氧氟沙星异构体之间, 均可达到基线分离以含 7 mmol L 1 万古霉素的不同 ph 醋酸钠缓冲液 (100 mmol L 1 ) 为运行缓冲液, 在电极电压为 10 kv 条件下, 考察缓冲液 ph 对拆分的影响, 结果显示 ( 表 1), 缓冲液 ph 为 4.0~4.5 时, 万古霉素对氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体的拆分效果最佳 ; 随 ph 的降低或升高, 拆分效果变差, 当 ph 为 3.0 时, 手性选择作用消失 ; 对映体的电泳迁移时间在 ph 3.0~4.5 内, 随 ph 的增加而逐渐缩短, 但当 ph 由 4.5 增至 5.0 时, 电泳迁移时间大幅度增加 Figure 3 Electropherograms of vancomycin and norvancomycin as chiral selector. Separation voltage: 10 kv from positive pole to negative pole; column temperature: 25 ; wavelength: 297 nm. A: Antofloxacin/R-antofloxacin enantiomers; B: Ofloxacin enantiomers; A1, B1, running buffer: the acetate buffers at a concentration of 100 mmol L 1 with 7 mmol L 1 of vancomycin (ph 4.0); A2, B2, running buffer: the acetate buffers at a concentration of 100 mmol L 1 with 7 mmol L 1 of norvancomycin (ph 4.0)

4 908 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): Table 1 Effect of electrophoretic conditions on ofloxacin (OFLX) and antofloxacin/r-antofloxacin chiral separation Compound Parameter Concentration a of vancomycin/mmol L 1 ph b Separation voltage c /kv OFLX t 1 /min t 2/t R s Antofloxacin t 1 /min t 2/t R s a: Separations were performed using various concentrations of vancomycin in 100 mmol L 1 acetate buffer (ph 4.0). The run voltage was +10 kv; b: Separations were performed using 7 mmol L 1 vancomycin in 100 mmol L 1 acetate buffer. The run voltage was +10 kv; c: Separations were performed using 7 mmol L 1 vancomycin in 100 mmol L 1 acetate buffer 以含 7 mmol L 1 万古霉素的醋酸钠缓冲液 (100 mmol L 1, ph 4.0) 为运行缓冲液, 改变电极电压, 发现随电极电压的增加, 对映体的迁移时间变短, 分离度变小 ( 表 1) 3 分子力学算法计算万古霉素与氧氟沙星对映体的相互作用采用 Chem 3D 软件中的分子力学算法 (molecular mechanical method) 利用计算机构建万古霉素和去甲万古霉素的分子模型, 从不同视角观测模型是否存在袋状结构, 根据对其三维结构的分析 ( 图 1), 认为它们至少可形成 2 个不同的空间域 (Domain); 根据最低能量原理, 分别计算氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体与万古霉素去甲万古霉素不同空间区域相互作用的最稳定结合能 (the most steady combination energy), 见表 2 最稳定结合能越大, 表明物质间的相互作用能越低, 其彼此间相互作用的稳定性越差表 2 结果提示, 万古霉素 I 区与氧氟沙星右旋体和安妥沙星右旋异构体的相互作用能均高于与左氟沙星和安妥沙星的相互作用能, 二者均约相差 10 kcal mol 1, 即万古霉素的 I 区与氧氟沙星及其衍生物的右旋异构体 (R 构型化合物 ) 的结合较稳定 ; 去甲万古霉素 I 区与氧氟沙星右旋异构体和安妥沙星右旋异构体的相互作用能, 虽然也略高于其与左旋异构体 (S 构型的化合物 ) 的相互作用能, 但二者的差小于 4 kcal mol 1 ; 而万古霉素去甲万古霉素的 II 区与氧氟沙星对映体和安妥沙星及其右旋异构体的相互作用能基本相同, 即此区域与氧氟沙星及其衍生物的左旋或右旋异构体结合具有相同的稳定性据此推测万古霉素 I 区是万古霉素拆分氧氟沙星对映体的手性识别位点由分子力学算法计算出的万古霉素 I 区分别与氧氟沙星对映体安妥沙星及去甲万古霉素与左氟沙星相互作用形成的最稳定的空间结构 ( 图 4) 可见, 氧 Table 2 The most steady combination energy of vancomycin interaction with ofloxacin and antofloxacin/r-antofloxacin enantiomers (kcal mol 1 ) Vancomycin Domain I Domain II Norvancomycin Domain I Domain II Levofloxacin R-Ofloxacin Antofloxacin R-Antofloxacin 氟沙星 C-6 的羧基与万古霉素糖链中羟基的氢键相互作用氧氟沙星分子与万古霉素 I 区形成的袋状结构的匹配程度和氧氟沙星 C-10 哌嗪侧链中的甲基与万古霉素分子中 N 甲基亮氨酸中甲基的疏水相互作用, 决定了氧氟沙星与万古霉素的相互作用程度 ; 氧氟沙星 C-3 手性基团的位置, 致使分子具有不同的立体形状, 直接影响了对映体与万古霉素 I 区袋状结构 [10] 的匹配程度 Arai 等根据万古霉素与氧氟沙星对映体及其衍生物相互作用后电泳行为的差异, 认为氧氟沙星对映体和万古霉素的相互作用基于 : 氧氟沙星 C-6 和 C-7 的羧基和酮基与万古霉素中酰胺键之间的氢键相互作用药物的分子大小与万古霉素形成的疏水袋的匹配程度和喹啉环的芳香作用, 并受氧氟沙星 C-10 电负性基团 (electronegative group) 的影响 ; 与本文结果相似但不完全相同 [11] Peyrin 等认为, 万古霉素在溶液中形成的非共价键二聚体有助于其对手性化合物的拆分 ; 溶液中由万古霉素形成二聚体的结合常数约为 700 L mol 1 [12] ; 在本实验中, 7 mmol L 1 万古霉素溶液中万古霉素应 [13, 主要以二聚体的形式存在根据 Williams 等 14] 的报道, 万古霉素通过氢键相互作用形成二聚体, 所涉及的基团为万古霉素 II 区中酰胺键的羰基与氨基 ; 此时, 万古霉素 II 区很难再成为氧氟沙星对映体的手性识别位点, 因此万古霉素对氧氟沙星对映体的手性识别位点应在 I 区

5 胡昌勤等 : 毛细管电泳中万古霉素拆分氧氟沙星对映体手性识别位点的探讨 909 Figure 4 The most steady 3D structure of interaction between vancomycin and ofloxacin. In the 3D structure, gray represents atom of C; red, atom of O; blue, atom of N; green, atom of Cl; sky-blue, atom of H; light-red, lone pair electrons. a: Vancomycin and levofloxacin; b: Vancomycin and R-ofloxacin; c: Vancomycin and antofloxacin; d: Norvancomycin and levofloxacin 讨论氧氟沙星的 2 个 pk a 值分别为 5.74 和 7.90, 在电泳条件下带正电 ; 安妥沙星及其右旋异构体为氧氟沙星的 8- 氨基衍生物, 在相同条件下也应带正电万古霉素具有 6 个不同的 pk a 值 ( ), 其带电状态与溶液的 ph 有关 [1], 当 ph 5.5 时, 万古霉素带正电, 而此时电泳中 (ph 3~4) 的电渗流 (electroosmotic flow) 作用可忽略 [10] 实验中发现, 当未添加万古霉素或去甲万古霉素时, 氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体的电泳迁移时间分别为 6.4 min 和 6.3 min; 随万古霉素浓度的增加, 药物对映体的迁移时间变长 ; 随电极电压的增加, 对映体的迁移时间缩短 ( 表 2); 提示氧氟沙星对映体及氧氟沙星 - 万古霉素复合物在电泳条件下均带正电, 氧氟沙星 - 万古霉素复合物较氧氟沙星分子本身的电泳迁移率慢因此认为万古霉素与氧氟沙星 R S 异构体相互作用能的差异, 决定了万古霉素与氧氟沙星结合的稳定性 ; 而结合的氧氟沙星与游离药物电泳迁移速率的不同, 使得不同对映体具有不同的电泳迁移率 ; 这种差异越大, 手性拆分能力越强比较分子力学算法得到的万古霉素 I 区分别与氧氟沙星对映体安妥沙星及其右旋异构体相互作用形成的最稳定结合能 ( 表 3), 发现其最稳定结合能越低, 即氧氟沙星 - 万古霉素复合物越稳定, 溶质的电泳迁移率越慢 ( 表 2); 与实验中观察到的现象一致 [10] Arai 等发现氧氟沙星 C-9 取代基的电负性越强, 氧氟沙星对映体的分离越好, 并认为其原因是通过影响氧氟沙星 C-10 的碱性而发挥作用 ; 但万古霉素和去甲万古霉素拆分氧氟沙星具有完全不同的效果 ( 图 3); 由图 3 可见, 去甲万古霉素对氧氟沙星手性选择作用的消失, 是由于其失去了与氧氟沙星哌嗪侧链中甲基相互作用的疏水作用位点所致, 与氧氟沙星 C-10 的碱性无关 ; 而氧氟沙星 C-8 C-9 取代基对氧氟沙星对映体分离的影响, 应通过取代基的共轭作用影响氧氟沙星 C-6 的羧基与万古霉素形成氢键而发挥作用此外, 实验中发现 ph 对万古霉素拆分氧氟沙星 [10] 的影响, 与 Arai 等的结果相似 ; 但 Arai 等未能合理地解释这种影响氧氟沙星羧基的 pk a 为 5.74, 醋

6 910 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): 酸钠缓冲液中羧基的 pk a 为 4.74 根据本实验模型, 当缓冲液为 ph 3.0 时, 两者都是以 R-COOH 的形式存在, 此时, 形成的氧氟沙星 - 万古霉素复合物很难解离, 使得万古霉素对氧氟沙星的手性选择作用消失 ; 随着缓冲液 ph 的增加, 氧氟沙星 - 万古霉素复合物的稳定性变差 ; 当缓冲液的 ph 为 4.0~4.5 接近二者的等当电时, 虽然两者此时仍主要以 R-COOH 的形式存在, 但此时复合物最不稳定 ( 氧氟沙星的电泳迁移时间最短 ), 因此手性拆分效果最好 ; 当电泳缓冲液的 ph 进一步变至 5.0 时, 氧氟沙星的羧基仍主要以 R-COOH 的形式存在, 而醋酸盐的羧基主要以 R-COO 的形式存在, 和缓冲液 ph 为 4.0~4.5 时的结果比较, 氧氟沙星的电泳迁移时间又相应增加, 且手性拆分效果变差, 说明此时的复合物更不易解离上述结果提示, 拆分过程中醋酸盐缓冲液的羧基 (-COOH) 可能与氧氟沙星的羧基共同竞争万古霉素的氢键结合位点, 醋酸盐羧基的竞争抑制作用使得复合物稳定性变差, 导致氧氟沙星对映体电泳迁移率的差异加大 ; 当醋酸盐的羧基以 -COO 的形式存在时, 其竞争抑制作用消失, 此时复合物的稳定性增加, 表现为对映体的电泳迁移时间增加, 但手性拆分效果变差 References [1] Armstrong DW, Tang YB, Chen SS, et al. Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography [J]. Anal chem, 1994, 66: [2] Gübitz G, Schmid MG. Chiral separation by capillary electromigration techniques [J]. J Chromatogr A, 2008, 1204: [3] Ding GS, Huang XJ, Liu Y, et al. Chiral separation of racemates of drugs and amino acid derivatives by highperformance liquid chromatography on a norvancomycinbonded chiral stationary phase [J]. Chromatographia, 2004, 59: [4] Ghassempour A, Aboul-Enein HY. Vancomycin degradation products as potential chiral selectors in enantiomeric separation of racemic compounds [J]. J Chromatogr A, 2008, 1191: [5] Ding GS, Tang AN. Capillary electrochromatographic separation of racemates on a norvancomycin-bonded monolithic column under reversed-phase conditions [J]. J Chromatogr A, 2008, 1208: [6] Guo ZS, Wang H, Zhang Y. Chiral separation of ketoprofen on an achiral C8 column by HPLC using norvancomycin as chiral mobile phase additives [J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 41: [7] Hui FM, Chen YL, Chen XG, et al. High performance liquid chromatography and capillary electrophoresis chiral recognition mechanisms using glycopeptide macrocyclic antibiotics as selectors [J]. Chin Anal Chem ( 分析化学 ), 2004, 32: [8] Yu J, Wang YM, Luo GA. Chiral separation of ofloxacin enantiomers by capillary electrophoresis [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 1997, 32: [9] Liu XY. Separation of ofloxacin enantiomers by high performance capillary electrophoresis [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 1998, 33: [10] Arai T, Nimura N, Kinoshita T. Investigation of enantioselective separation of quinolonecarboxylic acids by capillary zone electrophoresis using vancomycin as a chiral selector [J]. J Chromatogr A, 1996, 736: [11] Slama I, Dufresne C, Jourdan E, et al. Vancomycin dimerization and chiral recognition studied by high-performance liquid chromatography [J]. Anal Chem, 2002, 74: [12] Gerhard U, Mackay JP, Maplestone RA, et al. The role of the sugar and chlorine substituents in the dimerization of vancomycin antibiotics [J]. J Am Chem Soc, 1993, 115: [13] Waltho JP, Williams DH. Aspects of molecular recognition: solvent exclusion and dimerization of the antibiotic ristocetin when bound to a model bacterial cell-wall precursor [J]. J Am Chem Soc, 1989, 111: [14] Beauregard DA, Williams DH, Gwynn MN, et al. Dimerization and membrane anchors in extracellular targeting of vancomycin group antibiotics [J]. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39:

Microsoft Word 王德伟-二校 3088

Microsoft Word 王德伟-二校 3088 6 8 Vol. 6 No. 8 2015 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2015 王德伟 *, 游景水, 黄远英 (, 519040) 摘要 : 目的 (RP-HPLC) 方法 (ph 4.6), RP-HPLC, ph4.6, C 18, A 0.1%, B 0.09%(V:V) 90%(V:V),, 214 nm, 0.7 ml/min