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1 2010 年 第 30 卷 有 机 化 学 Vol. 30, 2010 第 9 期, 1366~1371 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 9, 1366~1371 研 究 论 文 N ε - 苯 胺 酰 基 -N α -(3- 取 代 苯 基 异 噁 唑 -5- 基 羰 基 ) 赖 氨 酸 类 化 合 物 的 合 成 及 其 除 草 活 性 研 究 胡 德 金 刘 素 芳 黄 统 辉 涂 海 洋 * 李 伟 国 朱 晓 磊 张 爱 东 * ( 华 中 师 范 大 学 化 学 学 院 农 药 与 化 学 生 物 学 教 育 部 重 点 实 验 室 武 汉 ) 摘 要 植 物 细 胞 内 囊 体 中 的 D1 蛋 白 酶 是 近 年 来 发 现 的 潜 在 的 除 草 剂 作 用 靶 标. 以 异 噁 唑 甲 酰 赖 氨 酸 脲 先 导 结 构 信 息 为 基 础, 设 计 合 成 了 未 见 报 道 的 异 噁 唑 甲 酰 赖 氨 酸 类 化 合 物 11 个. 目 标 化 合 物 分 子 结 构 经 IR, 1 H NMR, 元 素 分 析 予 以 确 证. 平 皿 法 活 体 生 物 活 性 测 试 表 明 部 分 化 合 物 具 有 中 等 除 草 活 性 ; 化 合 物 8h 的 离 体 生 物 活 性 测 试 表 明 其 对 D1 蛋 白 酶 有 一 定 的 抑 制 作 用. 关 键 词 D1 蛋 白 酶 ; 抑 制 剂 ; 异 噁 唑 酰 赖 氨 酸 ; 合 成 ; 除 草 剂 Synthesis and Herbicidal Activities of N ε -Anilinocarbonyl-N α -{3-[(un)- substituted phenyl]isoxazol-5-ylcarbonyl}lysine Derivatives Hu, Dejin Liu, Sufang Huang, Tonghui Tu, Haiyang* Li, Weiguo Zhu, Xiaolei Zhang, Aidong* (Key Laboratory of Pesticide and Chemical Biology of Ministry of Education, College of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan ) Abstract Recently the D1 protease locating in the thylakoids of higher plants was found to be a potential herbicidal target. Based on one lead hit N α -(isoxazol-5-ylcarbonyl)lysine of D1 protease inhibitors, a series of novel N ε -anilinocarbonyl-n α -{3-[(un)substituted phenyl]isoxazol-5-ylcarbonyl}lysine derivatives were designed and synthesized, and their molecular structures were verified with IR, 1 H NMR, and elemental analysis. The biological activity examined in vivo demonstrated that most of the compounds exhibited moderate herbicidal activities. Meanwhile, the enzyme activity of one compound 8h was tested against the spinach D1 protease and the result showed its inhibitive effect against the enzyme. Keywords D1 protease; inhibitor; isoxazolecarbonyllysine derivative; synthesis; herbicide D1 蛋 白 酶 (CtpA) 作 用 于 D1 蛋 白 前 体, 剪 切 其 羧 基 端 9~16 个 氨 基 酸 残 基, 形 成 光 合 作 用 必 需 的 成 熟 D1 蛋 白, 用 于 光 合 系 统 II 锰 簇 合 物 的 组 装 [1]. 研 究 表 明 [2,3], 海 藻 Scenedesmus 及 蓝 藻 菌 Synechocystis 中 CtpA 剔 除 后 导 致 植 物 不 能 光 自 养, 这 和 传 统 的 D1 蛋 白 抑 制 剂 如 西 玛 津, 阿 特 拉 津 作 用 效 果 相 同. 因 此, 如 果 抑 制 了 D1 蛋 白 酶 的 合 成, 则 可 以 抑 制 光 合 作 用 的 发 生. 同 时, D1 蛋 白 酶 在 植 物 体 内 有 高 度 的 同 源 性 [4], 在 高 等 植 物 体 内 含 量 远 低 于 D1 蛋 白 ( 约 1% 左 右 ) [5], 因 此 可 以 预 计 D1 蛋 白 酶 抑 制 剂 将 具 有 高 效 及 广 谱 性. [6] 目 前 Duff 等 发 表 了 一 篇 有 关 D1 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 研 究 报 道, 其 采 用 的 方 法 是 利 用 荧 光 极 化 高 通 量 筛 选 获 * [email protected]; [email protected]; Tel.: Received January 5, 2009; revised May 4, 2009; accepted April 30, 国 家 自 然 科 学 基 金 (Nos , ) 资 助 项 目.

2 No. 9 胡 德 金 等 :N ε - 苯 胺 酰 基 -N α -(3- 取 代 苯 基 异 噁 唑 -5- 基 羰 基 ) 赖 氨 酸 类 化 合 物 的 合 成 及 其 除 草 活 性 研 究 1367 得 五 类 D1 蛋 白 酶 的 潜 在 抑 制 剂, 并 对 部 分 化 合 物 进 行 了 化 学 合 成 和 先 导 结 构 的 验 证. 在 我 们 前 期 工 作 中, 以 [7] Liao 等 报 道 的 斜 生 栅 藻 D1 蛋 白 酶 晶 体 结 构 为 模 板, 通 过 同 源 模 建 得 到 高 等 植 物 菠 菜 D1 蛋 白 酶 的 三 维 结 构 模 型, 并 对 自 建 化 合 物 库 和 已 知 化 合 物 库 进 行 了 虚 拟 筛 选, 获 得 了 D1 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 先 导 化 合 物 异 噁 唑 甲 酰 赖 氨 酸 脲 分 子 结 构 信 息. 本 文 在 这 一 工 作 基 础 上, 设 计 合 成 了 一 系 列 异 噁 唑 甲 酰 赖 氨 酸 类 化 合 物 (Scheme 1), 并 探 讨 了 这 类 化 合 物 的 活 体 除 草 活 性. 通 过 对 化 合 物 8h 的 离 体 生 物 活 性 测 试, 表 明 了 其 作 为 D1 蛋 白 酶 抑 制 剂 先 导 化 合 物 的 可 能 性. 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 化 合 物 熔 点 用 Electrothermal 数 字 熔 点 测 定 仪 ( 温 度 计 未 经 校 正 ) 测 定 ; 1 H NMR 用 Varian MERCURY-PLUS 400 型 核 磁 共 振 仪, 以 氘 代 氯 仿 或 DMSO-d 6 为 溶 剂, TMS 为 内 标 ; LC-MS 用 ABI 2000 型 色 谱 液 质 联 用 谱 仪 ( 美 国 ABI 公 司 ) 测 定 ; 元 素 分 析 用 Vario EL-III CHNSO 元 素 分 析 仪 测 定 ; 薄 层 层 析 用 GF25 型 硅 胶 板 ( 青 岛 海 洋 化 工 厂 ); 高 效 液 相 色 谱 采 用 Agilent 1100, Hypersil BDS C(8) (5 µm 0.46 cm 15 cm) 反 相 柱 ; D1 蛋 白 酶 由 本 实 验 室 从 菠 菜 叶 内 囊 膜 中 提 取 并 经 阴 离 子 交 换 和 凝 胶 柱 层 析 提 纯 得 到 ; D1 蛋 白 前 体 底 物 模 拟 物 24 肽 (S24) 由 上 海 吉 尔 生 化 有 限 公 司 采 用 固 相 法 合 成. 所 有 进 口 或 国 产 试 剂 均 为 AR, 使 用 前 经 常 规 除 水 处 理. 1.2 中 间 体 的 合 成 芳 基 -5- 羟 基 亚 甲 基 异 噁 唑 (2a~2k) 及 其 对 应 的 3- 芳 基 -5- 异 噁 唑 甲 酸 (3a~3k) 合 成 化 合 物 2a~2k 参 照 文 献 [8] 合 成, 其 中 已 知 化 合 物 通 过 薄 板 层 析 纯 度 分 析 和 熔 点 测 定, 并 与 文 献 值 对 照. 2a: 白 色 固 体, 产 率 50%. m.p. 52~53 ( 文 献 值 [8] : 52~53.5 ). 2b: 白 色 固 体, 产 率 78%. m.p. 103~105 ( 文 献 值 [10] : 99~101 ). 2c: 无 色 油 状 物, 产 率 57%. 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.43 (s, 1H, ArH), 7.05~7.35 (m, 3H, ArH), 6.5 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.78 (s, 2H, CH 2 ), 3.83 (s, 3H, OCH 3 ), 2.10 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: (M + +1). Anal. calcd for C 11 H 11 NO 3 : C 64.38, H 5.40, N 6.83, found C 64.69, H 5.24, N d: 淡 黄 色 针 状 晶 体, 产 率 64%. m.p. 114~116 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.00 (d, J=8.4 Hz, 1H, ArH), 7.73~7.61 (m, 3H, ArH), 6.38 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.84 (s, 2H, CH 2 ), 2.20 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: (M + ). Anal. calcd for C 10 H 8 N 2 O 4 : C 54.55, H 3.66, N 12.72, found C 54.72, H 3.59, N Scheme 1

3 1368 有 机 化 学 Vol. 30, e: 淡 黄 色 晶 体, 产 率 66%. m.p. 120~122 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.63 (s, 1H, ArH), 8.32 (d, J= 5.2 Hz, 1H, ArH), 8.18 (d, J=4.8 Hz, 1H, ArH), 7.63 (t, J= 10.4 Hz, 1H, ArH), 6.68 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.88 (s, 2H, CH 2 ), 2.05 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: (M + +1). Anal. calcd for C 10 H 8 N 2 O 4 : C 54.55, H 3.66, N 12.72, found C 54.48, H 3.75, N f: 黄 色 晶 体, 产 率 54%. m.p. 163~164 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.34 (d, J=8.8 Hz, 2H, ArH), 8.00 (t, J=8.8 Hz, 2H, ArH), 6.66 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.88 (d, J=5.2 Hz, 2H, CH 2 ), 2.15 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: (M + ). Anal. calcd for C 10 H 8 N 2 O 4 : C 54.55, H 3.66, N 12.72; found C 54.78, H 3.79, N g: 白 色 固 体, 产 率 65%. m.p. 78~79 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 7.72 (d, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.49 (d, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.44~7.26 (m, 2H, ArH), 6.72 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.85 (s, 2H, CH 2 ), 2.22 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: (M + +1). Anal. calcd for C 10 H 8 ClNO 2 : C 57.30, H 3.85, N 6.68; found C 57.59, H 3.76, N h: 白 色 固 体, 产 率 43%. m.p. 114~115 ( 文 献 值 [8] : 114 ). 2i: 白 色 固 体, 产 率 51%. m.p. 118~120 ( 文 献 值 [10] : 114~116 ). 2j: 无 色 晶 体, 产 率 63%. m.p. 52~54 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 7.62~7.41 (m, 2H, ArH), 7.41~ 7.21 (m, 1H, ArH), 7.08~7.05 (m, 1H, ArH), 6.72 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.85 (s, 2H, CH 2 ), 2.15 (s, 1H, OH). LG-MS m/z: (M + +1). Anal. calcd for C 10 H 8 FNO 2 : C 62.18, H 4.17, N 7.25; found C 62.41, H 4.46, N k: 无 色 晶 体, 产 率 83%. m.p. 89~90 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 7.92~7.76 (m, 3H, ArH), 7.28~ 7.18 (m, 1H, ArH), 6.72 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.85 (s, 2H, CH 2 ), 2.12 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: (M + ). Anal. calcd for C 10 H 8 FNO 2 : C 62.18, H 4.17, N 7.25; found C 61.95, H 4.42, N 芳 基 -5- 异 噁 唑 甲 酸 3a~3k 按 文 献 [9] 方 法 合 成, 其 分 子 结 构 用 1 H NMR 确 定 N ε - 苯 胺 酰 基 赖 氨 酸 (7) 的 合 成 16.7 g (65.7 mmol) CuSO 4 5H 2 O, 40 ml 水 溶 液 中, 加 入 20.0 g (110 mmol) Lys HCl, 回 流 2 h, 冷 却 至 室 温. 调 节 溶 液 ph 值 至 9, 室 温 机 械 搅 拌 下 滴 加 g 苯 基 异 氰 酸 酯 20 ml 二 噁 烷 溶 液, 1 h 后 得 到 深 蓝 色 混 浊 液, 抽 滤, 水 洗 至 滤 液 无 色, 热 乙 醇 溶 液 50 ml 3 洗 涤, 得 到 蓝 色 固 体 粉 末 状 的 赖 氨 酸 苯 基 脲 的 铜 盐 20 g, 产 率 62%. 铜 盐 固 体 20 g, 加 入 300 ml 水, 浓 盐 酸 调 节 酸 性 至 ph=2, 通 入 H 2 S 气 体 2 h, 得 到 棕 褐 色 混 浊 液, 抽 滤, 水 洗, 滤 液 用 0.5 mol L -1 NaOH 调 节 ph 值 6~8 之 间, 得 到 白 色 混 浊, 抽 滤, 得 白 色 固 体 产 品 g, 产 率 84%. m.p. 240~241 ; 1 H NMR (CDCl 3 +CF 3 COOH, 400 MHz) δ: 8.86 (s, 1H, NH), 7.61 (s, 2H, NH 2 ), 7.40 (d, J=10.8 Hz, 2H, ArH), 7.23~7.15 (m, 1H, ArH), 6.69~93 (m, 3H, ArH), 6.55 (s, 1H, NH), 3.28~3.42 (m, 1H, CH), 3.51~3.73 (m, 2H, CH 2 ), 1.55~1.69 (m, 2H, CH 2 ), 1.30~1.42 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3410, 3306, 2935, 2861, 1647, 1580, 1499 cm -1 ; LC-MS m/z: (M), (M+Na + ). 1.3 目 标 产 物 8a~8k 的 合 成 化 合 物 mmol 溶 于 2 ml SOCl 2, 2 ml 甲 苯 溶 液, 回 流 2~3 h, 减 压 蒸 去 溶 剂, 冷 却 备 用. 在 50 ml 三 颈 瓶 中 加 入 赖 氨 酸 苯 基 脲 g (2 mmol), 水 5 ml, NaOH 0.08 g (2 mmol), 搅 拌 溶 解, 冷 却 至 10. 上 述 酰 氯 5 ml 甲 苯 溶 液, 0.4 mol L -1 NaOH 的 5 ml 水 溶 液, 分 别 置 于 两 个 滴 液 漏 斗 中, 同 时 滴 加 入 反 应 瓶 中, 加 完 后 室 温 1 h, 分 离 水 层, 水 层 酸 化 至 ph=1, 得 到 固 体 沉 淀, 抽 滤, 干 燥, 乙 醇 - 水 重 结 晶 得 化 合 物 8, 产 率 50%~81%. 8a: 白 色 固 体, 产 率 53%. m.p. 176~178 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.19 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.39 (s, 1H, NH), 7.83~7.95 (m, 2H, ArH), 7.70 (s, 1H, NH), 7.48~7.57 (m, 3H, ArH), 7.29~7.40 (m, 2H, ArH), 7.13~7.21 (m, 2H, ArH), 6.85 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.15 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 2.98~3.10 (m, 2H, NHCH 2 ), 1.79~1.91 (m, 2H, CH 2 ), 1.42~1.50 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3458, 3298, 3088, 1680, 1600, 1580, 1500 cm -1 ; LG-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 24 N 4 O 5 : C 63.29, H 5.54, N 12.84; found C 63.27, H 5.53, N b: 白 色 固 体, 产 率 75%. m.p. 175~177 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.28 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.89 (s, 1H, ArH), 7.85 (s, 1H, ArH), 7.58~6.68 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.84 (s, 3H, OCH 3 ), 3.03~3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.79~1.88 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.47 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3458, 3300, 3088, 1680, 1600, 1580, 1505 cm -1 ; LG-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 24 H 26 N 4 O 6 : C 61.79, H 5.62, N 12.01; found C 61.81, H 5.60, N

4 No. 9 胡 德 金 等 :N ε - 苯 胺 酰 基 -N α -(3- 取 代 苯 基 异 噁 唑 -5- 基 羰 基 ) 赖 氨 酸 类 化 合 物 的 合 成 及 其 除 草 活 性 研 究 c: 白 色 固 体, 产 率 71%. m.p. 173~174 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.20 (d, J=7.8 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.79 (d, J=7.2 Hz, 1H, ArH), 7.53 (d, J=9.6 Hz, 2H, ArH), 7.31~7.40 (m, 2H, ArH), 7.24~7.08 (m, 4H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.90 (s, 3H, OCH 3 ), 3.04~3.13 (m, 2H, CH 2 ), 1.84~ 1.91 (m, 2H, CH 2 ), 1.44~1.53 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3460, 3305, 3090, 1680, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LG-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 24 H 26 N 4 O 6 : C 61.79, H 5.62, N 12.01; found C 61.78, H 5.62, N d: 淡 黄 色 固 体, 产 率 56%. m.p. 180~181 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.27 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.34 (s, 1H, NH), 7.99 (d, J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.78~7.62 (m, 3H, ArH), 7.70 (s, 1H, ArH), 7.57~7.64 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.04~3.12 (m, 2H, CH 2 ), 1.86 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.46 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3478, 3306, 3094, 1682, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+K + ). Anal. calcd for C 23 H 23 N 5 O 7 : C 57.38, H 4.82, N 14.55; found C 57.38, H 4.84, N e: 黄 色 晶 体, 产 率 50%. m.p. 133~134 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.28 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.69 (s, 1H, NH), 8.24~8.43 (m, 3H, ArH), 7.93 (s, 1H, ArH), 7.82~7.91 (m, 1H, ArH), 7.35 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.14 (t, J=9.6 Hz, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.02~3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.84~1.91 (m, 2H, CH 2 ), 1.43~1.51 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3459, 3305, 3090, 1680, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 N 5 O 7 : C 57.38, H 4.82, N 14.55; found C 57.39, H 4.86, N f: 白 色 固 体, 产 率 75%. m.p. 154~157 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.29 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 8.32~8.40 (m, 2H, ArH), 8.22 (d, J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.83 (s, 1H, ArH), 7.57~7.64 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.03~ 3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.80~1.89 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.46 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3478, 3306, 3094, 1682, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 N 5 O 7 : C 57.38, H 4.82, N 14.55; found C 57.39, H 4.82, N g: 白 色 针 状 晶 体, 产 率 81%. m.p. 174~175 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.28 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.75~7.60 (m, 2H, ArH), 7.53~7.58 (m, 2H, ArH), 7.52 (t, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.01~3.09 (m, 2H, CH 2 ), 1.84 (m, 2H, CH 2 ), 1.40~1.51 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3308, 3098, 1680, 1600, 1580, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 ClN 4 O 5 : C 58.66, H 4.92, N 11.90; found C 58.67, H 4.90, N h: 白 色 固 体, 产 率 70%. m.p. 171~172 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.17 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.38 (s, 1H, NH), 7.81~7.92 (m, 2H, ArH), 7.64 (s, 1H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.09 (d, J=9.0 Hz, 2H, ArH), 6.85 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.36 (s, 1H, CH), 3.01~3.12 (m, 2H, CH 2 ), 1.78~1.89 (m, 2H, CH 2 ), 1.38~1.47 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3309, 3098, 1680, 1600, 1580, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 22 Cl 2 N 4 O 5 : C 54.66, H 4.39, N 11.09; found C 54.66, H 4.41, N i: 白 色 固 体, 产 率 76%. m.p. 174~175 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.24 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.88 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.75~7.73 (m, 3H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.04~3.13 (m, 2H, CH 2 ), 1.82~1.94 (m, 2H, CH 2 ), 1.40~1.51 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3309, 3098, 1680, 1600, 1580, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 BrN 4 O 5 : C 53.60, H 4.50, N 10.87; found C 53.62, H 4.50, N j: 白 色 固 体, 产 率 57%. m.p. 177~179 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.29 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, NH), 7.83 (s, 1H, ArH), 7.48~7.59 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.24~7.34 (m, 1H, ArH), 7.16~7.22 (m, 1H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.01~ 3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.82~1.90 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~4.47

5 1370 有 机 化 学 Vol. 30, 2010 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3310, 3098, 1682, 1601, 1583, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 FN 4 O 5 : C 60.79, H 5.10, N 12.33; found C 60.81, H 5.12, N k: 白 色 固 体, 产 率 76%. m.p. 127~129 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: (s, 1H, COOH), 9.24 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.86 (d, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.75~7.84 (m, 1H, ArH), 7.68~7.73 (m, 1H, ArH), 7.40~7.49 (m, 1H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.19~7.30 (m, 1H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.01~3.12 (m, 2H, CH 2 ), 1.81~1.93 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.47 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3482, 3310, 3098, 1680, 1601, 1583, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: (M + ), (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 FN 4 O 5 : C 60.79, H 5.10, N 12.33; found C 60.76, H 5.12, N 活 体 和 离 体 除 草 活 性 活 体 除 草 活 性 测 定 : 采 用 国 家 十 一 五 新 农 药 创 制 生 测 标 准 方 法 ( 平 皿 法 ) 测 定 了 标 题 化 合 物 在 浓 度 分 别 为 100 和 10 mg L -1 时 对 单 子 叶 植 物 稗 草 ( 根 / 茎 ) 和 双 子 叶 植 物 油 菜 ( 根 / 茎 ) 的 抑 制 率 (%). 离 体 除 草 活 性 测 定 : 采 用 的 高 效 液 相 测 定 条 件 是 C8 反 相 柱, 洗 脱 相 为 水 相 ( 含 0.1% TFA) 和 有 机 相 CH 3 CN( 含 0.065% TFA). 保 留 时 间 0~1.00 min 用 10% 有 机 相 平 衡 反 相 柱, 1.01~16.00 min 采 用 有 机 相 进 行 体 线 性 梯 度 (10%~40%) 洗 脱, 紫 外 检 测 波 长 为 220 nm. 利 用 从 菠 菜 中 提 取 出 的 D1 蛋 白 酶 ( 本 实 验 室 提 取 ) 直 接 与 抑 制 剂 进 行 相 互 作 用 来 进 行 离 体 生 物 活 性 测 试, 验 证 目 标 化 合 物 是 否 对 D1 蛋 白 酶 有 直 接 的 抑 制 作 用. 选 择 D1 蛋 白 前 体 (pre-d1) 剪 切 点 附 近 的 24 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 多 肽 (S24) 作 为 底 物 模 拟 物 [11], 其 序 列 为 + NH 3 -VMHERNAHNFPLDLA*AIEAPSTNG-COO -, 其 中 带 星 号 的 丙 氨 酸 的 羧 端 是 D1 蛋 白 酶 的 剪 切 位 点. 取 10 µl D1 蛋 白 酶 (2.77 mg ml -1 ), 底 物 S24 (5 mmol L -1 ) 4 µl, 化 合 物 8h (1 mmol L -1 ) µl, 均 以 缓 冲 液 G (50 nmol L -1 HEPES, ph=7.7, 100 mmol L -1 NaCl, 100 ml 甘 油, 0.5 g L -1 曲 拉 通 X-100) 配 制, 并 补 足 至 80 µl. 于 25 恒 温 反 应 6 h 后 加 入 20 µl TFA (0.1 mol L -1 ) 中 止 反 应, 离 心 10 min (14000 g) 后 取 20 µl 上 清 液 进 行 高 效 液 相 测 定. 依 据 该 反 应 条 件, 化 合 物 8h 与 酶 的 反 应 浓 度 为 100 mg L -1. 在 酶 抑 制 状 态 下 根 据 模 拟 底 物 S24 肽 的 浓 度 增 加 或 水 解 产 物 9 肽 或 15 肽 浓 度 的 降 低, 可 以 计 算 出 化 合 物 对 D1 蛋 白 酶 的 抑 制 率. 2 结 果 与 讨 论 2.1 合 成 方 法 及 条 件 选 择 在 合 成 3- 芳 基 异 噁 唑 亚 甲 基 醇 时, 利 用 经 典 1,3- 偶 [12,13] 极 环 加 成 反 应 形 成 异 噁 唑 环. 有 报 道 利 用 CH 2 Cl 2 作 溶 剂 从 肟 出 发 一 锅 法 合 成 该 异 噁 唑 化 合 物 [14]. 在 本 实 验 中, 部 分 取 代 苯 基 肟 在 CH 2 Cl 2 中 溶 解 性 较 差, 影 响 反 应 产 率, 如 硝 基 芳 基 肟 ; 且 在 一 锅 法 中 从 取 代 肟 形 成 氯 代 肟 时 剧 烈 放 热, 不 易 控 制, 使 得 最 终 产 物 收 率 不 高. 本 文 选 择 两 步 反 应 进 行 合 成 异 噁 唑 亚 甲 基 醇. 取 代 苯 基 肟 与 NCS 反 应, DNF 作 溶 剂, 得 到 纯 度 较 高 的 可 直 接 用 于 下 步 反 应 的 取 代 苯 基 氯 代 肟, 再 进 行 环 加 成, 收 率 较 高, 且 易 于 提 纯. 赖 氨 酸 形 成 铜 盐 时 其 α- 羧 基 和 α- 氨 基 被 同 时 螯 合, 末 端 的 氨 基 直 接 与 苯 基 异 氰 酸 酯 形 成 脲 的 结 构, 避 免 了 α- 羧 基 和 α- 氨 基 的 较 为 繁 琐 的 保 护 及 脱 保 护 过 程. 成 脲 反 应 时, 将 异 氰 酸 酯 配 成 溶 于 水 的 二 噁 烷 溶 液, 并 滴 加 到 赖 氨 酸 的 溶 液 中, 一 方 面 可 以 稀 释 异 氰 酸 酯 的 浓 度, 使 得 滴 入 的 异 氰 酸 酯 立 即 反 应, 避 免 水 解 ; 另 一 方 面 增 加 异 氰 酸 酯 水 溶 性, 加 快 了 反 应 速 率, 反 应 收 率 相 对 于 直 接 滴 加 异 氰 酸 酯 提 高 30% 左 右. 在 目 标 化 合 物 的 合 成 中, 直 接 将 N ε - 脲 基 赖 氨 酸 溶 于 碱 性 水 溶 液, 使 羧 基 成 盐, 只 留 氨 基 一 个 反 应 位 点, 从 而 避 免 了 氨 基 酸 复 杂 的 保 护 及 脱 保 护 的 过 程. 尝 试 用 溶 于 水 有 机 溶 剂 的 THF, 二 噁 烷 稀 释 酰 氯, 滴 加 到 氨 基 酸 脲 的 碱 性 [NaOH, Et 3 N, (i-pr) 2 Net] 水 溶 液 中, 酰 氯 易 水 解, 收 率 很 低. 采 用 甲 苯 作 溶 剂 稀 释 酰 氯 进 行 缓 慢 滴 加, 同 时 在 冰 水 浴 冷 却 的 条 件 下 缓 慢 地 滴 加 稍 过 量 的 NaOH 溶 液, 保 持 反 应 始 终 处 于 碱 性, 避 免 了 羧 基 的 副 反 应, 也 避 免 了 酰 氯 的 水 解, 反 应 进 行 顺 利, 收 率 较 高. 2.2 目 标 化 合 物 的 除 草 活 性 测 试 室 内 平 皿 法 活 体 生 物 活 性 测 试 结 果 表 明, 所 有 化 合 物 均 表 现 出 一 定 的 除 草 活 性. 其 中 异 噁 唑 3- 位 苯 环 上 邻 位 取 代 无 论 是 供 电 子 基 团 (OCH 3 ) 还 是 吸 电 子 基 团 都 比 无 取 代 苯 环 衍 生 物 的 生 物 活 性 要 好 ; 在 苯 环 其 它 位 置 含 有 取 代 基 时, 吸 电 子 基 团 的 效 果 较 好. 其 中, 二 氯 代 苯 基 异 噁 唑 衍 生 物 在 100 mg L -1 时 可 以 达 到 93% 的 抑 制 率. 但 所 有 化 合 物 在 浓 度 降 低 时 活 性 下 降 较 多, 可 能 是 由 于 抑 制 酶 的 量 较 少, 未 能 显 著 影 响 植 物 的 光 合 作 用 过 程, 导 致 抑 制 作 用 效 果 明 显 下 降. 2.3 化 合 物 8h 的 离 体 生 物 活 性 图 1 是 D1 蛋 白 酶 催 化 水 解 S24 肽 在 加 入 化 合 物 8h 前 ( 曲 线 A) 和 8h 后 ( 曲 线 B) 的 HPLC 分 析 结 果. 其 中, 保 留 时 间 13.8 min 的 峰 为 S24; 保 留 时 间 11.6 和 5.4 min

6 No. 9 胡 德 金 等 :N ε - 苯 胺 酰 基 -N α -(3- 取 代 苯 基 异 噁 唑 -5- 基 羰 基 ) 赖 氨 酸 类 化 合 物 的 合 成 及 其 除 草 活 性 研 究 1371 表 1 化 合 物 8a~8k 的 除 草 活 性 ( 相 对 抑 制 率 %) Table 1 Herbicidal activities (inhibition rate/%) of title compounds 8a~8k 油 菜 ( 根 / 茎 ) 稗 草 ( 根 / 茎 ) Compd. 100 mg L mg L mg L mg L -1 8a 80.0/ / / /82.7 8b 84.0/ / / /31.8 8c 78.8/ / / /31.8 8d 80.0/ / / /40.9 8e 81.3/ / / /22.7 8f 82.8/ / / /40.9 8g 82.5/ / / /27.3 8h 93.0/ / / /36.4 8i 85.0/ / / /22.7 8j 80.9/ / / /22.0 8k 87.7/ / / /12.2 的 峰 分 别 为 S24 被 D1 蛋 白 酶 水 解 生 成 的 15 肽 和 9 肽. 在 加 入 化 合 物 后, 24 肽 的 对 应 峰 高 和 峰 面 积 相 对 于 未 加 8h 时 有 所 增 大, 而 15 肽 和 9 肽 的 峰 高 和 峰 面 积 则 相 应 减 少, 说 明 化 合 物 8h 一 定 程 度 上 抑 制 了 D1 蛋 白 酶 催 化 活 性. 通 过 对 面 积 积 分, 得 到 化 合 物 8h 对 D1 蛋 白 酶 的 抑 制 率 为 43.6%. 该 结 果 说 明 化 合 物 8h 在 100 mg L -1 的 浓 度 下, 对 D1 蛋 白 酶 有 一 定 的 抑 制 作 用, 表 明 8h 可 能 是 D1 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 先 导 化 合 物. 图 1 化 合 物 8h 加 入 前 (A) 和 后 (B) D1 蛋 白 酶 水 解 S24 的 HPLC 图 Figure 1 HPLC elution profile of D1 protease catalyzed S24 hydrolysis before (A) and after (B) the addition of compound 8h 3 结 论 本 文 在 以 D1 蛋 白 酶 为 模 板 虚 拟 筛 选 得 到 异 噁 唑 甲 酰 赖 氨 酸 先 导 结 构 信 息 化 合 物 的 基 础 上, 设 计 合 成 了 一 系 列 新 颖 的 异 噁 唑 甲 酰 赖 氨 酸 类 化 合 物. 在 合 成 中 采 用 铜 盐 螯 合 赖 氨 酸 α- 氨 基 和 羧 基 进 行 同 时 保 护, 与 三 光 气 和 胺 反 应 一 锅 法 形 成 N ε - 苯 胺 酰 基 赖 氨 酸. 该 合 成 策 略 具 有 方 便 快 捷 的 特 点, 避 免 了 赖 氨 酸 α 和 ε 氨 基 以 及 羧 基 较 为 繁 琐 的 正 交 保 护. N ε - 苯 胺 酰 基 赖 氨 酸 与 3- 苯 基 异 噁 唑 -5- 甲 酰 氯 通 过 两 相 ( 水 和 甲 苯 ) 反 应 得 到 目 标 化 合 物, 具 有 较 好 的 收 率. 目 标 化 合 物 分 子 结 构 经 IR, 1 H NMR, 元 素 分 析 予 以 确 认. 平 皿 法 活 体 生 物 活 性 测 试 表 明 部 分 化 合 物 具 有 中 等 除 草 活 性 ; 化 合 物 8h 的 酶 水 平 生 物 活 性 测 试 表 明 其 对 D1 蛋 白 酶 的 有 一 定 的 抑 制 作 用, 表 明 这 类 化 合 物 可 能 是 D1 蛋 白 酶 的 抑 制 剂. References 1 Nixon, P. J.; Trost, J. T.; Diner, B. A. Biochemistry 1992, 31, Anbudurai, P. R.; Mor, T. S.; Ohad, I.; Shestakov, S. V.; Pakrasi, H. B. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, Trost, J. T.; Chisholm, D. A.; Jordan, D. B.; Diner, B. A. J. Biol. Chem. 1997, 272, Inagaki, N.; Satoh, K. Handbook of Proteolytic Enzyme, Vol. 2, 2nd ed., Academic Press, London, 2004, pp. 2028~ Fabbri, B. J.; Duff, S. M. G.; Remsen, E. E.; Chen, Y.-C. S.; Anderson, J. C.; CaJacob, C. A. Pest Manage. Sci. 2005, 61, Duff, S. M. G.; Chen, Y.-C. S.; Fabbri, B. J.; Yalamanchili, G.; Hamper, B. C.; Walker, D. M.; Brookfield, F. A.; Boyd, E. A.; Ashton, M. R.; Yarnold, C. J.; CaJacob, C. A. Pest. Biochem. Physiol. 2007, 88, 1. 7 Liao, D-I.; Qian, J.; Chisholm, D. A.; Jordan, D. B.; Diner, B. A. Nat. Struct. Biol. 2000, 7, Aicher, T. D.; Balkan, B.; Bell, P. A.; Brand, L. J.; Cheon, S. H.; Deems, R. O.; Fell, J. B.; Fillers, W. S.; Fraser, J. D.; Gao, J.-P.; Knorr, D. C.; Kahle, G. G.; Leone, C. L.; Nadelson, J.; Simpson, R.; Smith, H. C. J. Med. Chem. 1998, 41, Luca, L. D.; Giacomelli, G.; Riu, A. J. Org. Chem. 2001, 66, Barbachyn, M. R.; Cleek, G. J.; Dolak, L. A.; Garmon, S. A.; Morris, J. J. Med. Chem. 2003, 46, Oelmüller, R.; Herrmann, R. G.; Pakrasi, H. B. J. Biol. Chem. 1996, 271, Wang, H.-Y.; Liu, F.-M.; Yan, Q.; Guo, Q.-S. J. Org. Chem. 2005, 25, 75 (in Chinese). ( 王 厚 勇, 刘 方 明, 阎 琴, 郭 群 胜, 有 机 化 学, 2005, 25, 75). 13 Li, X.-L.; Wang, Y.-P.; Chen, H.; Li, Z.-W.; Xing, C.-Y. J. Org. Chem. 2008, 28, 1750 (in Chinese). ( 李 小 六, 王 彦 坡, 陈 华, 李 志 伟, 邢 春 勇, 有 机 化 学, 2008, 28, 1750.) 14 Liu, L.-J.; Yong, J.-P.; Dai, X.-J.; Jia, J.; Wang, X.-Z.; Wang, J.-W. Chem. J. Chin. Univ. 2006, 27, 1669 (in Chinese). ( 刘 利 军, 雍 建 平, 戴 小 军, 贾 炯, 王 西 照, 王 建 武, 高 等 学 校 化 学 学 报, 2006, 27, 1669.) (Y Qin, X.; Zheng, G.)