Microsoft Word - 馮資惠專討大綱

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佛巧花
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1 生化科技研究所微生物與細胞專題討論題目 : Serine 403 Phosphorylation of p62/sqstm1 regulates selective autophagic clearance of ubiquitinated proteins 作者 :Gen Matsumoto, Koji Wada, Misako Okuno, Masaru Kurosawa, and Nobuyuki Nukina 文章來源 :Molecular Cell 44, , October 21, 2011 演講人 :Tzu-Hui Feng 馮資惠指導老師 :Li Kwan Chang, PhD 張麗冠博士演講日期 :December 10, 2012 演講地點 :The 6th Classroom 摘要自噬作用是細胞將廢棄蛋白質聚合體 (protein aggregates) 透過自噬體包裹而後以溶酶體水解的胞內機制而選擇性自噬作用 (selective macroautophagy) 為其中的一類, 會透過 cargo receptor 專一性辨識特定蛋白質而水解的反應, 除了可清除廢棄蛋白質聚合體外, 還具有水解受泛素化 (Ub-) 蛋白質的功能, 透過調節蛋白質聚合體以及 Ub- 蛋白質的含量, 選擇性自噬作用成為維持胞內蛋白質平衡的重要機制當 Ub- 蛋白質無法水解而累積於細胞內, 常造成神經退化性疾病 (ex: 亨丁頓舞蹈症 ), 因此, 選擇性自噬作用如何辨識 Ub- 蛋白質, 一直是學者研究的課題 p62/sqstm1 是選擇性自噬作用中的一類 cargo receptor, 先前研究指出, 在添加蛋白酶抑制劑的情形下,p62/SQSTM1 會專一性辨識 Ub- 蛋白質, 並促進其水解, 證明 p62/sqstm1 是自噬體能辨識 Ub- 蛋白質的關鍵分子, 然而詳細調控仍不明另外, 由於作者先前發現 p62/sqstm1 可能受到轉譯後修飾, 故本篇研究中, 作者想進一步探討,p62/SQSTM1 是否因為受到轉譯後修飾, 而調控其與 Ub- 蛋白質的結合力, 進一步增進選擇性自噬作用水解 Ub- 蛋白質的能力作者首先發現 p62/sqstm1 上 S403 處的磷酸化與自噬作用有關, 而後, 證明該磷酸化會提升 p62/sqstm1 與 Ub 長鏈結合的能力 ; 另一方面,p62/SQSTM1 與 Ub 長鏈的結合, 可防止此磷酸化被磷酸酶移除, 並促進 Ub 長鏈被帶往自噬體水解 ; 最後, 作者證明出 Casein Kinase 2 (CK2) 為 S403 的磷酸激酶, 且提升磷酸化程度可降低蛋白質聚合體的累積綜合以上結果, 作者發現在選擇性自噬作用中,p62/SQSTM 的 S403 處受到磷酸化修飾, 進而協助自噬體辨識並水解 Ub- 蛋白質, 凸顯 p62/sqstm 的磷酸化, 在選擇性自噬作用扮演不可或缺的角色 Keywords: p62, phosphorylation, selective autophagy, ubiquitination 1

2 前言本研究之重要性自噬作用是調節細胞蛋白質平衡的重要機制, 而選擇性自噬作用更是擁有專一性辨識特定蛋白質聚合物 Ub- 蛋白質並予以水解的功能 (Bjorkoy et al., 2005; Kirkin et al., 2009; Komatsu et al., 2007; Korolchuk et al., 2009) 本研究揭示出磷酸化對於 p62/sqstm 功能調控的重要性, 並對選擇性自噬作用如何辨識受泛素化修飾蛋白質的機制做一完整性的闡述前人作過的研究清除受損蛋白質以及過度累積的蛋白質聚合物的機制一直是維持細胞平衡的重要途徑, 而來自環境的壓力年齡突變等等因素都會令錯誤折疊以及受泛素化修飾的蛋白質過量產生, 其中,Ub- 蛋白質的累積更是遲發型神經退化症的的特徵 (Balch et al., 2008; Morimoto, 2008; Vernace et al., 2007) 而一種受 p62/sqstm1 調控的選擇性自噬作用, 被視為是維持胞內平衡的重要反應以及蛋白質水解反應的補償性途徑 (Bjorkoy et al., 2005; Kirkin et al.,2009; Komatsu et al., 2007; Korolchuk et al., 2009), 其可透過 p62/sqstm1 辨識無用的蛋白質聚合體 (Bjorkoy et al., 2005; Filimonenko et al., 2010; Iwata et al., 2005; Martinez-Vicente et al.,2010; Ravikumar et al., 2004; Yamamoto et al., 2006) 以及多重 Ub- 蛋白質 (Deretic, 2010; Filimonenko et al., 2010; Komatsu and Ichimura,2010; Lamark and Johansen, 2010; Ponpuak et al., 2010), 進而引領自噬體將此些蛋白質水解, 以維持胞內穩定, 然而現今, 對於 p62/sqstm1 如何控制自噬體將受泛素化修飾蛋白質水解的機制仍然不明作者為何要作本研究在先前的研究中發現, 添加蛋白酶抑制劑的情形下, 可觀察到 p62/sqstm1 會與受泛素化蛋白質結合, 將其導向自噬體水解, 而在電泳結果中, 發現到 p62/sqstm 有挑高的情形 (Nagaoka et al., 2004), 因此作者認為 p62/sqstm1 可能因為受後轉譯修飾, 令自身具有調控自噬體以及 Ub- 蛋白質的能力, 而做了一系列的研究本研究欲完成之項目首先作者證實 p62/sqstm 的 Serine403 處會受磷酸化且與自噬作用有關, 而後, 作者想了解, 該處磷酸化將對 p62/sqstm 辨識 Ub- 蛋白質造成何種影響, 及其詳細機制最終, 作者找到 S403 的磷酸激酶, 將其過量表現於具有過量累積的蛋白質聚合體細胞中, 想了解是否能降低蛋白質聚合體的含量, 以確定該磷酸化可調控 p62/sqstm 在選擇性自噬中的角色 2

3 材料與方法細胞株本篇研究所使用的細胞株皆為溶有 5% CO 2 並含有 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin-100 µg/ml streptomycin (Wako),,250 µg/ml hygromycin (Wako), 以及 30 µg/ml blasticidin (invivogen) 的 DMEM 培養的 mir 細胞株或是以含有 400 µg/ml G418 (invivogen) 培養的 R-Ub cells 至於肝臟細胞的分析, 則是採用培養於以 Matrigel 覆蓋 35-mm glass-bottom dishes 中 (MatTek Corp.). 共軛焦顯微鏡分析將細胞組織直接或是以 4%PFA 固定後至於顯微鏡下觀察, 過程參閱 (Lamark et al., 2003) 而活體細胞則於 37 度下含有 10% 血清的 Hanks medium 下拍攝免疫沉澱法將細胞視情形培養於含有 2 m M MG132 (Calbiochem), 100 nm epoxomycin (Peptide Institute), 1 m M Bafilomycin A1 (SC Lab), 20 m M DMAT (CK2 inhibitor 2, Calbiochem), 50 m M TBBt (CK2 inhibitor 1, Calbiochem), and/or 0.1 m M okadaic acid (Calbiochem) 的環境下, 再以含有 ultrasound 並添加 phosphatase inhibitors (2 mm imidazole [Sigma], 1 mm NaF [Sigma]) andprotease inhibitor cocktail (Roche) 的 PBS 打破細胞至於共免疫沉澱方面, 將 GFP 抗體混勻 protien G sepharose 共同作用後, 再加入打破的 G-p62 細胞液, 移除與 GFP 非專一性結合的沉澱物而在 S403-phospho-p62 蛋白質的免疫純化方面, 首先, 將已抑制 Atg5 表現的 G-p62wt cells 細胞株利用 0.1 mm OA 培養 24 hr, 而後將細胞沉澱以溶於 PBS 的 0.1% 的 SDS 處理, 以釋出內源的多重泛素化蛋白質, 再以溶於 PBS + 0.1% Triton X-100 and 0.01% SDS 並結合於 protein A sepharose 的 GFP 抗體將 G-p62 沉澱下, 接以西方點墨法進行分析本篇研究所有分析皆至少驗證 2 次, 且以不同實驗方式確認超過三次以上 In Vitro Assay 將 50 m g/ml (0.5 m M) 經純化且具有 p62 (TF-p62) 融合蛋白的 His6-trigger factor 與含有不同支鏈的重組 polymerized ubiquitin (ENZO life science) 混合, 再添加 100 m l TALON (TAKARA),pulled down 後, 以 0.5 M TF-p62-bound-TALON loaded filter cups (Bio-Rad) 的 imidazole 洗下, 以西方點墨法分析 3

4 結果與討論 p62/sqstm 的多處胺基酸可被磷酸化首先為了探討 p62/sqstm 在蛋白質受抑制的條件下, 何處會受何種後轉譯修飾, 作者在 Neuro2a 細胞株中轉染表現帶有 GFP tagged 的人類 p62 蛋白質, 簡稱 G-p62, 再以 SDS 萃取後經由 LC-MS/ MS 分析, 找出其具有 7 個受磷酸化的 serine 位, 以及 1 個受磷酸化的 threonine 位, 而其他修飾型在本次的分析中並無被發現 p62/sqstm 的 S403 受磷酸化會促進自噬體的形成接下來作者希望找出在何位的磷酸化會與自噬作用有關, 因此, 作者利用 RNAi 的方式降低表現一種 autophagosome 形成的必要蛋白質,Atg5, 並添加蛋白酶抑制劑 MG132 結果發現, 在 S24 S207 S403 等處受磷酸化的 p62/sqstm 將會增加, 進一步以 autophagosome-lysosome fusion inhibitor,bafa 處理後, 發現其中僅有 S403 處磷酸化的 p62/sqstm 會有累積的現象, 表示其會參與自噬作用, 而後利用一種磷酸酶抑制劑,OA(okadaic acid), 將 p62/sqstm 維持在磷酸化態, 偵測自噬體形成的含量結果發現, 一旦有較多的 p62/sqstm 的 S403 處於磷酸態中, 則自噬體的形成也越顯著, 表示 p62/sqstm 的 Serine403 處磷酸化具有促進自噬體形成的功能 S403-P 的 p62/sqstm 分布作者利用螢光顯微鏡觀察 S403-P 的 p62/sqstm 的分布情形, 可發現其與 G-p62 一同分布於細胞質處, 且在添加磷酸酶抑制劑,OA, 或是 autophagosome-lysosome 抑制劑,BafA, 的情形下,S403-P 的 p62/sqstm 會大幅出現 p62/sqstm 的 S403E-P 會增進 p62 與泛素的結合力為了研究 S403 的磷酸化角色, 作者將 p62/sqstm 的 S403 突變為 S403E, 且證明 p62/sqstm 的 S403E 同樣可受到磷酸化, 仍可與 G-p62 聚集成 p62 bodies, 並參與自噬作用而後, 作者以 p62/sqstm 的 S403E 作為研究核心, 由於 p62/sqstm 的 S403 正位於 p62/sqstm 的 ubiquitin binding domain (UBD) 處, 因此, 作者認為也許該處的磷酸化會影響到與泛素的結合因此, 利用螢光顯微鏡觀察發現,RFP-Ub 有 80% 位於 S403E 的 G-p62 bodies, 而僅 20% 位於 S403A 的 G-p62 bodies 中, 而後, 透過免疫沉澱法, 發現 S403E 的 p62 與多重 Ub- 蛋白質的結合能力高於 S403A 的 p62 ( 不受磷酸化 ) S403E 的 p62/sqstm 會促進多重泛素化蛋白質與自噬體結合作者在外加 BafA (autophagosome-lysosome 抑制劑 ) 的情形下, 顯著觀察到與 S403E p62/sqstm 結合的 Ub- 蛋白質有顯著的提升, 表示 p62/sqstm 會透過 S403E 處的磷酸化與泛素化蛋白質結合, 並將其帶往自噬作用 4

5 S403 磷酸化能防止自身被去磷酸化由於 S403 位於 p62/sqstm 的 UBD 處, 因此作者懷疑此處因與 Ub 結合, 形成一複合體, 因此可抵抗胞內去磷酸酶的作用因此, 作者將一組 S403-P p62/sqstm 與 Ub 長鏈作用, 而另一組不與 Ub 長鏈作用, 再外加磷酸酶結果發現, 僅事先與 Ub 長鏈作用組可觀察到 p62/sqstm 的 S403 上的磷酸化仍舊存在, 表示 p62/sqstm 與 Ub 長鏈的複合體可防止 p62/sqstm 上 S403 的磷酸化被移除 CK2 為 p62/sqstm 上的 S403 磷酸化的磷酸激酶, 過度表現下, 可降低突變的亨丁頓蛋白質聚合體的累積由於先前有研究指出, 在胞外實驗中,Casein Kinase 2 (CK2) 會磷酸化 p62/sqstm (Yanagawa et al., 1997), 因此作者想測試是否為 CK2 將 S403 磷酸化在胞外實驗中, 作者在外加 ATP 以及促進因子的環境下, 將 p62/sqstm 與 CK2 共同作用, 結果發現 p62/sqstm 上 S403 確實會被磷酸化, 證實 CK2 為 p62/sqstm 的 S403 的磷酸激酶最終, 作者將 CK2 或是磷酸酶抑制劑, OA, 過量表現於具有突變的亨丁頓蛋白質聚合體的細胞株中, 結果發現蛋白質聚合體的數量明顯下降, 表示 p62/sqstm 上 S403 的磷酸化可增進選擇性自噬作用, 並降低蛋白質聚合體的累積參考文獻 Balch, W.E., Morimoto, R.I., Dillin, A., and Kelly, J.W. (2008). Adapting proteostasis for disease intervention. Science 319, Bjorkoy, G., Lamark, T., Brech, A., Outzen, H., Perander, M., Overvatn, A.,Stenmark, H., and Johansen, T. (2005). p62/sqstm1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J. Cell Biol. 171, Deretic, V. (2010). A master conductor for aggregate clearance by autophagy. Dev. Cell 18, Nagaoka, U., Kim, K., Jana, N.R., Doi, H., Maruyama, M., Mitsui, K., Oyama, F., and Nukina, N. (2004). Increased expression of p62 in expanded polyglutamine-expressing cells and its association with polyglutamine inclusions. J. Neurochem. 91, Vernace, V.A., Schmidt-Glenewinkel, T., and Figueiredo-Pereira, M.E. (2007). Aging and regulated protein degradation: who has the UPPer hand? Aging Cell 6, Yanagawa, T., Yuki, K., Yoshida, H., Bannai, S., and Ishii, T. (1997).Phosphorylation of A170 stress protein by casein kinase II-like activity in macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 241,

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