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养东
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (10): 中药材三七中农药多残留分析的样品前处理方法吴娜, 刘卫 *, 严和平, 樊爱萍, 黄笃树, 周波, 陈显兰, 徐世娟, 石玲 ( 云南红河学院化学系, 云南蒙自 ) 摘要 : 建立了中药材三七中农药残留分析的两种样品前处理方法, 在样品前处理方法 I 中, 样品经正己烷与二氯甲烷 ( 体积比为 6 4) 混合溶剂超声提取, 提取液经 Envi-carb/NH 2 SPE 小柱净化 ; 在样品前处理方法 II 中, 采用基质固相分散萃取净化法对样品进行提取净化两种方法所得到的洗脱液, 于旋转蒸发仪上浓缩近干, 二氯甲烷定容后于气相色谱质谱 (GC-MS) 检测采用 GC-MS 的选择离子监测 (SIM) 方式和外标法定量在优化的样品前处理条件和 GC-MS 分析条件下, 方法简便快速, 添加水平为和 2.0 mg kg 1 进行加标回收率实验时, 采用方法 I 时的回收率为 81.90%~102.10%, 相对标准偏差 (RSD) 为 3.60%~7.10%; 采用方法 II 时的回收率为 96.26%~104.20%, RSD 为 3.52%~7.94%; 检出限在 0.48~1.34 ng g 1 之间两种前处理方法的各项技术指标满足农药残留检测要求, 适合三七样品中痕量农药残留的分析关键词 : 固相萃取 ; 气相色谱质谱 ; 三七 ; 多残留分析中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : (2013) Sample pretreatment methods of pesticide residues in Panax notoginseng of Chinese traditional medicine WU Na, LIU Wei *, YAN He-ping, FAN Ai-ping, HUANG Du-shu, ZHOU Bo, CHEN Xian-lan, XU Shi-juan, SHI Ling (Department of Chemistry, Honghe College, Mengzi , China ) Abstract: Two sample pretreatment methods of pesticide residues in Panax notoginseng of Chinese traditional medicine were developed. For Method I, the residues were extracted from homogenized tissue with n-hexane-dichloromethane (6 4) by means of ultrasonication, the crude extract was purified by an Envi-carb/NH 2 solid-phase extraction (SPE) column. For Method II, matrix solid-phase dispersion (MSPD) technique was used for extracting and cleaning up. The eluates were concentrated by rotary evaporation, and then were redissolved in dichloromethane prior to GC-MS determination. The determination was performed in selected ion monitoring (SIM) mode with the external calibration for quantitative analysis. Under the optimal conditions, the results indicated that the methods are easier and faster, the recoveries of method I for the spiked standards at concentration of 0.01, 0.5, and 2.0 mg kg 1 were 81.90% % with the relative standard deviations (RSDs) of 3.60% 7.10%. The recoveries of method II were 96.26% % with the RSDs of 3.52% 7.94%. The detection limits (S/N) for residues of pesticides were in the range of ng g 1. The results indicated that these multiresidue analysis methods can meet the requirements for determination of residue pesticides and can be appropriate for trace analysis of residue pesticides in Panax notoginseng. Key words: solid phase extraction; GC-MS; Panax notoginseng; multiresidue analysis 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家公益行业项目 ( ); 云南省应用基础研究计划青年项目 (2012FD053); 云南省应用基础研究计划自筹项目 (2013FZ121). * 通讯作者 Tel / Fax: , liuwei4728@126.com

2 1586 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (10): 三七 (Panax notoginseng (Burk) F.H.chen) 系五加科人参属植物 [1], 主要成分除三七皂苷外还有三七素黄酮挥发油氨基酸多糖植物甾醇蛋白质微量元素等多种成分, 是我国特有的传统名贵中药材, 主要产于云南文山它具有止血散瘀以及降血压治疗心绞痛冠心病等功效 [2, 3], 有金不换与南国明珠的美称 [4] 随着三七功效的逐渐被认识和接受以及人们生活水平的不断提高和对自身健康的关注, 市场需求量逐渐增大, 使三七野生药材资源日渐枯竭因此已进入大量人工种植阶段, 在云南文山种植面积和产量占全国的 98% 三七一般栽培 3 年才能收获 [5], 在栽培过程中易受病虫害侵蚀, 如炭疽病锈病疫病等病害, 小地老虎野蜡输蚜虫等虫害 [6] 为了提高产量, 有机氯有机磷拟除虫菊酯氨基甲酸酯类等严格禁止使用的剧毒高毒高残留即具有三致 ( 致癌致畸致突变 ) 作用的农药被广泛不合理使用 [7] 随之带来中药材三七中农药残留问题, 药材质量受到影响, 极大地影响了三七药 [8] 材的质量和外贸出口, 逐渐引起了中药材市场和社会的关注 [9] 随着三七应用领域的不断扩大, 国内外对三七中农药残留量列为必检项, 然而我国至今仍未出台相关的措施, 如三七中农药残留的最低检测限量及国家标准检测方法对于三七中农药残留的相关报道 [10], 主要是三七片或者是叶中单类农药的检测, 检测手段主要集中在气相色谱仪 [11] 高效液相色谱仪, 这种分析方法仅针对一类农药化合物, 为了提高效率, 必须采用多残留方法分析更多农药本实验参考国内云南三七栽培和储存过程中使用农药情况和日本肯定列表中最高残留限量标准, 拟采用 GC-MS [12] 同时检测三七中有机氯有机磷拟除虫菊酯氨基甲酸酯类等农药残留量, 开展三七中 24 种农药残留的 GC-MS 分析方法研究, 包括了不同的前处理技术比较, 同时考察方法的线性范围检出限加标回收率和相对标准偏差为建立三七药材中的农药最大残留限量标准和安全使用标准提供科学依据材料与方法药品与材料艾氏剂仲丁灵七氯 2, 4'- 滴滴涕 4, 4'- 滴滴涕 α- 六六六 β- 六六六 γ- 六六六氰戊菊酯溴氰菊酯乐果毒死蜱久效威抗蚜威克百威甲萘威甲霜灵异菌脲百菌清三唑酮杀毒矾氟节胺菌核净和腐霉利 ( 纯度 99.0%) 均购买于德国 Dr. Ehrenstorfer 公司分别准确称取适量的各种农药对照品 g 于 25 ml 量瓶中, 用二氯甲烷分别配制成 160 µg ml 1 的标准储备液 ; 混合标准溶液 : 根据需要再用二氯甲烷逐级稀释成质量浓度分别为 µg ml 1 的系列混合标准工作溶液 Envi-carb/NH 2 SPE 小柱 (500 mg/500 mg/6 ml) 购自 Supelco 公司三七粉样品制备 : 将购自云南文山三七药材于 60 干燥 4 h, 粉碎过 40 目筛制成粉末状试样, 于干燥器中储存备用仪器气相色谱质谱联用仪 (PerkinElmer clarus 500 GC/MS, 美国 ), SPEM 萃取装置 (TALBOY 7 7 CERHOT/STIR, 美国 ) GC-MS 条件气相色谱条件 : 色谱柱为 HP-5MS (30 m 0.25 mm 0.25 µm) 石英毛细管柱 ; 载气为氮气, 纯度 %, 流速 1.2 ml min 1 ; 进样口温度为 280 ; 进样量为 0.5 µl 进样方式: 不分流进样, 1.5 min 后打开分流阀和隔垫吹扫阀 ; 柱升温程序 : 初始温度 40 ( 保持 1.0 min), 以 30 min 1 升至 130, 以 2 min 1 升至 220 ( 保持 1.0 min), 以 15 min 1 升至 300 ( 保持 5 min), 总运行 59.5 min; 质谱条件 : EI 源, 电离能量为 70 ev; 离子源温度为 230 ; GC-MS 接口温度为 280 ; 全扫描 (Scan) 测定方式的扫描范围为 45~500 u; 溶剂延迟 5 min 超声提取 - 固相萃取小柱净化法 ( 处理方法 I) 称取样品 2.00 g 置于 100 ml 的具塞三角瓶中, 正己烷二氯甲烷 (6 4) 混合溶剂超声提取 30 min, 经装有氯化钠 2 g 与无水硫酸钠 2 g 的滤纸直径漏斗过滤, 浓缩近干, 用甲苯乙腈 (1 3) 混合溶液 2 ml 溶解, 采用 Envi-carb/NH 2 SPE 小柱净化, 净化洗脱液在 40 水浴中旋转浓缩近干, 采用二氯甲烷定容至 1 ml, GC-MS 检测基质固相分散萃取净化法 ( 处理方法 II) 准确称取样品 1.00 g 于研钵中, 依次加入水 0.5 ml 硅镁型吸附剂 1.5 g 中性氧化铝 1.5 g, 以研杵研磨 5 min 左右, 至固体呈良好流动性, 装入已填好下层填料的玻璃柱中 ( 从下至上依次为脱脂棉无水硫酸钠 2 g 中性氧化铝 2 g 活性炭 0.1 g, 并以正己烷预淋洗 ), 丙酮正己烷 (3 7) 100 ml 洗脱, 收集全部洗脱液, 并在 40 水浴中旋转浓缩近干, 采用二氯甲烷定容至 1 ml, GC-MS 检测结果与讨论 1 定性及定量离子的选择 24 种农药混合对照样品 (10.0 µg ml 1 ) 的选择离子扫描及全扫描的色谱图见图 1 该图显示, 24 种

3 吴娜等 : 中药材三七中农药多残留分析的样品前处理方法 1587 农药在 GC-MS 中的分析时间约为 55 min 采用选择离子模式 (SIM) 与单一标准溶液进样相结合对 24 种农药 ( 包括有机磷有机氯拟除虫菊酯氨基甲酸酯等 ) 定性, 在选择离子扫描的基础上采用提取单一离子的方法进行定量, 以提高分析灵敏度及降低干扰本文所选的定性定量离子及各农药的保留时间见表 1 所示, 其中克百威甲奈威氰戊菊酯各有 2 个同分异构体 2 线性关系相关系数和检出限对系列浓度的 24 种农药的混合标准工作溶液进行测定分析, 用农药标样峰面积对其相应农药浓度进行回归分析, 得到线性范围为 0.1~10.0 µg ml 1 的线性方程相关系数通过进行低水平回收率实验, 以 3 倍信噪比计算得各种农药的检出限, 加标量是 0.01 mg kg 1 结果见表 2 3 方法回收率精密度称取三七样品, 每份 1 g, 分别采用超声提取固相萃取小柱净化法和基质固相分散萃取净化法进行添加水平为 mg kg 1 的样品加标回收率实验, 每个浓度水平平行测定 3 次, 每批样品做一个空白, 回收率为样品加标回收平行测定 3 次的平均值, 精密度以样本数为 3 计算相对标准偏差表 3 为 3 个浓度水平平均回收率的平均值以及相对标准偏差的平均值由表 3 可知, 所测定的 24 种农药采用超声提取固相萃取小柱净化法的回收率为 81.90%~ %, 相对标准偏差为 3.60%~7.10%; 基质固相分散萃取净化法的回收率为 96.26%~104.20%, 相对标准偏差为 3.52%~7.94%, 两种方法均能符合农药残留量测定要求 Table 1 The names, retention times, qualitative ions, quantitative ions and their relative abundances of 24 pesticides. * Quantitative ions Pesticide t R/min m/z (relative abundances) Thiofanox (84), 83, 115 * (100), 161 Carbofuran 7.24, Carbaryl 11.87, (91), 131 (63), 164 * (100), 221 (17) 89 (79), 116 (40), 144 * (100), 201 (24) Alpha-HCH * (100), 183 (98), 221 (47), 254 (6) Dimethoate (86), 143 (24), 229 (21), 87 * (100) Beta-HCH * (100), 217 (78), 181 (94), 254 (12) Gamma-HCH * (100), 181 (74), 219 (93), 221 (40) Chlorothalonil * (100), 264 (72), 268 (49), 109 (12) Pirimicarb * (100), 238 (23), 72 (15), 138 (6) Heptachlor * (100), 237 (40), 337 (27) Matalaxyl * (100), 249 (53), 234 (38) Aldrin * (100), 265 (65), 293 (40), 329 (8) Chlorpyrifos * (100), 258 (57), 286 (42), 197 (23) Triadimefon * (100), 210 (50), 181 (74) Dimetachlone * (100), 187 (84), 124 (56), 247 (38) Butralin * (100), 224 (16), 295 (60) Procymidone * (100), 285 (70), 255 (15) Flumetralin * (100), 157 (34), 404 (19) 2, 4'-DDT * (100), 237 (63), 165 (37), 199 (14) Oxadixyl * (100), 233 (58), 278 (81) 4, 4'-DDT * (100), 237 (65), 246 (7), 163 (84) Iprodione * (100), 187 (47), 345 (73), 124 (19) Fenvalerate 54.08, * (100), 225 (53), 419 (37), 181 (41) Deltamethrin * (100), 172 (25), 174 (25) Figure 1 Total ion current chromatogram of mixed solution of 24 pesticide standards by SIM mode and scan mode (10.0 µg ml 1 )

4 1588 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (10): Table 2 The linear regression equation, the correlation coefficients and LOD of 24 pesticides Pesticide Linear regression equation r 2 LOD /ng g 1 Thiofanox y = x ± Alpha-HCH y = x ± Dimethoate y = x ± Carbofuran y = x ± Beta-HCH y = x ± Gamma-HCH y = x ± Chlorothalonil y = x ± Pirimicarb y = x ± Heptachlor y = x ± Carbaryl y = x ± Matalaxyl y = x ± Aldrin y = x ± Chlorpyrifos y = x ± Triadimefon y = x ± Dimetachlone y = x ± Butralin y = x ± Procymidone y = x ± Flumetralin y = x ± , 4'-DDT y = x ± Oxadixyl y = x ± , 4'-DDT y = x ± Iprodione y = x ± Fenvalerate y = x ± Deltamethrin y = x ± Table 3 Three levels spiked recoveries and the relative standard deviation (RSD) of 24 pesticides ( n = 3) Pesticide MSPD/% Average RSD recoveries SPE/% Average recoveries RSD Thiofanox Alpha-HCH Dimethoate Carbofuran Beta-HCH Gamma-HCH Chlorothalonil Pirimicarb Heptachlor Carbaryl Matalaxyl Aldrin Chlorpyrifos Triadimefon Dimetachlone Butralin Procymidone Flumetralin , 4'-DDT Oxadixyl , 4'-DDT Iprodione Fenvalerate Deltamethrin 讨论本研究建立了气相色谱质谱联用技术分析测定三七中多种残留农药的两种样品前处理方法, 样品前处理方法 I 主要的影响因素是提取溶剂和洗脱溶剂采用正己烷与二氯甲烷 (6 4) 混合溶剂作为提取溶剂提取效果较好, 对全部农药回收率都较高, 回收率均高于 80% 采用乙腈提取时, 虽部分农药的提取效果更好, 但是不能将全部农药完全提取, 如 β- 六六六艾氏剂及七氯, 其回收率仅达到 50% 左右采用甲苯与乙腈 (1 3) 混合的混合洗脱剂洗脱效果佳, 回收率达 90% 以上样品前处理方法 II 需考虑基质和洗脱剂用量, 通过三七样品与空白样品的加标回收率实验可见三七样品基质对检测目标物干扰较小为了进一步考察目标物的提取效率以及填料的吸 [13] 附效率, 在文献基础上对提取完一次后的样品研磨继续洗脱检测目标物, 结果表明均还含有一定的目标物残留, 对提取完两次后的样品继续洗脱检测, 发现仅有部分目标物检出, 对经 3 次提取后的样品研磨洗脱检测, 均未检测到目标物如果增加研磨次数, 时间长操作繁琐, 实验通过增加洗脱剂用量 ( 和 100 ml), 增加至 100 ml 时, 检测目标物均被提取出, 样品加标回收率得到改善因此, 基质固相分散萃取净化法洗脱溶剂体积为 100 ml 实验结果显示两种前处理方法的各项技术指标满足农药残留检测要求, 适合三七样品中痕量农药残留的分析 References [1] Zhe JJ, Liu L, Hua XG. The profiles of Panax notoginseng and its industry [J]. Contemp Eco-Agric ( 当代生态农业 ), 2001, z2: [2] Xie GX, Qiu YP, Qiu MF, et al. Analysis of dencichine in Panax notoginseng by gas chromatography-mass spectrometry with ethyl chloroformate derivatization [J]. J Pharm Biomed Anal, 2007, 43: [3] Laua AJ, Toha DF, Chuab TK, et al. Antiplatelet and anticoagulant effects of Panax notoginseng: comparison of raw and steamed Panax notoginseng with Panax ginseng and Panax quinquefolium [J]. J Ethnopharmacol, 2009, 125:

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DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI