液相色層層析分離

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1 離子交換層析 (Ion exchange chromatography) 國防醫學院生物化學科 王明芳老師

2 定義 : 離子交換層析 (Ion exchange chromatography) 離子交換層析乃利用物質間酸鹼性 極性等差異, 通過離子間的吸附 (Adsorption ) 脫吸附, 而將電解質溶液 (Electrolyte solution) 中各成分分開 是 Liquid chromatography 的一種 液相色層層析分離 (Liquid chromatography) Sample 在 Stationary phase 中滯留, 然後被 Mobile phase 帶離開的過程 由於 Sample 在 Stationary phase 中可作不同程度的滯留, 所以可將 Sample 分離開來 1. Stationary phase:column 內的填充物質 ; 即 Media 2. Mobile phase: 即 Eluate 2

3 離子交換劑 : 必須不溶於水或其他有機溶劑中 必須具有功能基團 (functional groups) 或電荷基團 ( charged groups ) 以便攜帶可被交換之離子 (exchangeable counter ion), 而與溶液中同性離子進行交換作用 必須很穏定, 且為顆粒性巨形分子 種類有 : A. anion exchanger B. cation exchanger 陰離子交換樹脂 ( 帶正電 ) 吸附帶有負電之離子 陽離子交換樹脂 ( 帶負電 ) 吸附帶有正電之離子 3

4 1. Bind the substance of interest and allow the contaminants to pass through the column. 2. Bind the contaminants and allow the substance of interest to pass through. 4

5 5

6 Media : 1. Gel filtration: Size 2. Ion exchange: Charge 3. Hydrophobic interaction: Nonpolar 4. Affinity: Key-Lock 5. Normal phase: Silica Polar 6. Reverse phase: Silica-AlkyI Hydrocarbon chains. Nonpolar 5&6 Solid 6

7 Ion exchange chromatography 有些分子會帶電荷, 也可能同時帶有 Positive 及 Negative charge 在 Ion exchange 中, 看的不是 Net charge 而是相同 Charge 集中的一個趨勢 7

8 Properties of various ion exchangers: 8

9 由於離子交換劑上電荷基團之形式與電荷性質不同, 故有強弱離子交換劑之分 最常使用的離子交換劑是由單體苯乙烯 (styrene) 和交聯劑苯二乙烯 (divinylbenzene) 進行聚合 (polymerization) 及交聯反應 (cross-linking reaction), 形成具三維網狀結構的聚苯乙烯 - 苯二乙烯 (polystyrene divinylbenzene) 高聚合物 9

10 Addition of anionic groups to a polystyrene resin 10

11 Strong ion exchangers: sulphonic & quanternary amino group (completely ionized over a wide ph range) (exchange capacity) DE-cellulose: Diethylaminoethyl cellulose -OC 2 H 4 N + H(CH 2 CH 3 ) 2 11

12 Separation based on Surface Charges on the Protein mixture 12

13 The Net Charge of a protein as function of ph 13

14 The effect of ph upon the net charge of a protein 14

15 Amerlite IRC 50 15

16 Resolution in ion exchange chromatography 16

17 Resolution(Rs)in ion exchange chromatography: W: 波峯帶寬 (W 1 W 2 ) V 2 -V 1 : 波峯頂點的距離 Rs 愈高, 表解析能力好 則 V 2 -V 1 要大, 而 (W 1 + W 2 ) 小 17

18 18

19 解析能力 a: selectivity( 管柱選擇性 ) N: efficiency( 管柱效率 ) Theoretical plate, N k : capacity factor( 容積因素 ) a: 兩 sample 間之分離程度 k v v v a k v v v ' ' a 愈大, 兩 sample 分得愈開, 理想值在 1.05 ~ 2.00 之間 s k : sample 在 media 中的滯留強度 k' k v m k 愈大, 即 sample 在靜止相 media 中愈易滯留, 理想值在 1 ~5 之間 v N: sample 的 Band width( 帶寬 ) L: column 的長度 ( ) H: 平板的厚度 ( ) N 愈大, 增加帶寬 L N H 最後的 Resolution 必須視 a, k 及 N 的綜合影響而定 19

20 親和性層析 (Affinity chromatography): Affinity chromatography is a method that overcomes limitation by exploiting the unique interaction of one molecule with a second, complementary binding molecule (ligand). It is one of the most useful and effective fractionations that can be applied and often proteins can be purified in single affinity chromatography step. 基本原理 : Separation based on the reversible interaction of a specific ligand with a selective stationary phase. Requirement: (1)A specific ligand which can be cross-linked to the stationary phase (2)Reversible Protein-Ligand interaction(stationary phase). (3)Simple change in medium should release bound protein. 20

21 Utilizes unique properties of proteins to interact with specific substances: Enzymes with substrates Receptors with ligands (protein-cell surface receptor) Antigens with antibodies (Ag-Ab) Basic procedure: 21

22 Affinity chromatography applications are not limited to protein purification and some general types of molecules which have been isolated by affinity chromatography and their complementary ligands Substance Isolated by Affinity Chromatography Ligand Enzyme Antibody Polysaccharide, glycoprotein Nucleic acid binding protein Hormone receptor Substrate, cofactor Antigen, Virus, Cell Lectin Nucleic Acid Hormone 22

23 離子交換層析實驗 ( Experiment of ion exchange chromatography ) 本次實驗使用弱酸性陽離子交換樹脂 Amberlite IRC-50, 其功能基為 - COOH(pKa = 4.76), 在 ph = 6 的 NaPi 緩衝液中呈 COONa 型式 本次實驗用其來分離 Amino acids(tyrosine 及 arginine), 步驟如下 : 實驗步驟 : ( 一 )Regeneration of ion exchanger: 1. 取約 5 ml Amberlite IRC-50 置於 50ml 錐形瓶中 2. wash with dd H 2 O(50ml x 2) (2 次 ) 3. wash with acetone(5ml x 2) 4. wash with 1N NaOH(10ml x 2) 5. wash with 1N HCl(10ml x 2) 6. wash with 0.1M NaPi 6.0 (10ml x2)(50ml 離心管 ) 23

24 ( 二 )Packing: 1. 先將管柱加入 0.1 M NaPi 6.0 數毫升, 將點滴夾夾緊 2. 緩慢倒入泡在 0.1 M NaPi 6.0 的 Amberlite IRC-50, 並以緩衝液沖洗管柱 (0.1 M NaPi 6.0 : 0.1 M sodium phosphate ph 6.0) 3. 最後, 維持緩衝液高於樹脂 1 cm 處 ( 三 )Sample apply : 1. 控制流速 ( 約 1 ml/ min) 將緩衝液流至高於樹脂 0.2 cm 處 2. 將 0.5 ml sample(tyrosine+arginine) 加至樹脂上 ( 沿管壁慢慢加入, 小心不要破壞樹脂液面 ) 3. 待 sample 液面流至高於樹脂 0.2 cm 處時, 再加入 1 ml 緩衝液 4. 待液面再流至高於樹脂 0.2 cm 處時, 夾緊點滴夾 5. 加入 3 ml 緩衝液至樹脂上方, 並維持緩衝液 3 ml 高度不變 24

25 ( 四 )Elution collection: ( 五 )Assay: 1. 打開點滴夾並開始收集流出液, 每管收集 4 ml(1 ml / tube / 1 mins) 2. 待收集到第七管後, 吸去樹脂上方多餘的緩衝液 3. 換加入含有 1 M NaCl 之緩衝液, 同樣收集到第七管 ( 每管收集 4 ml) 後, 將點滴夾夾緊, 吸走樹脂上方多餘的含 1 M NaCl 的緩衝液 (1M NaCl in buffer) 4. 並加入緩衝液重新平衡 (Amberlite IRC-50 要回收 ) 1. Bio-Rad Protein assay(based on the method of Bradford): (1) 從前五管收集管取出 0.2 ml 溶液, 加入 Coomassie blue dye 1 ml (CBD) (2) 混合均勻, 室溫下反應至少 5 分鐘, 測波長 595 nm 吸光值 ( 以 0.2 ml 緩衝液 +1 ml Coomassie blue dye 當 blank) 25

26 2. Sakaguchi reaction:(p102, Sakaguchi Test) (1) 從加入 1 M NaCl 之緩衝液後所收集的五管取出 0.4 ml 溶液, 加入 0.2 ml 10 % NaOH (A) 及 0.04 ml 0.2 % 8- hydroxyquinoline (B) (8-HQ) (2) 置於室溫 5 min 後, 加入 0.2 ml NaOBr (C), 搖振數秒後 (3) 加入 0.2 ml 40 % Urea (D) (4) 測波長 500 nm 吸光值 ( 以 0.4 ml 緩衝液 ml 10 % NaOH ml 0.2 % 8-hydroxyquinoline 室溫 5 min 後 ml NaOBr 搖振數秒後 ml 40 % Urea, 當 blank) ( 六 )Results: 1. 以 Bio-Rad Protein assay 吸光值為縱軸, 溶液體積為橫軸, 作圖 ( 溶液體積需累加 ) 2. 以 Sakaguchi reaction 吸光值為縱軸, 溶液體積為橫軸, 作圖 ( 溶液體積需累加 ) 3. 解釋說明實驗結果 ( 討論 ) 26

分析物種A及B在管柱中的分離效 果由選擇因子決定 3. Selectivity factor (α)(relative retention)--選擇因子(相對滯留率) α =KB/KA KB KA α 1 KB大 為 樣品愈慢出來 KA小 為 樣品愈快出來 α大表示選擇性高 4.Number of

分析物種A及B在管柱中的分離效 果由選擇因子決定 3. Selectivity factor (α)(relative retention)--選擇因子(相對滯留率) α =KB/KA KB KA α 1 KB大 為 樣品愈慢出來 KA小 為 樣品愈快出來 α大表示選擇性高 4.Number of 三 層析相關術語 1.基線(base line) 無試樣通過檢測器時 檢測到的信號即為基線 2.滯留時間 retention time tr 組成分從進樣(樣品注入)到管柱後出現濃度極大值 時所需的時間 3.層析(波)峰(peak) 組成分從柱後出現 被偵檢器偵測到所產生的訊號 值 因此一個波峰代表一個或一個以上 混合物 也就是未分離成功 的分析成分 1 峰高(peak height) 2 峰寬(peak

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