目录 多肽的纯化 3 重组细胞因子的纯化 7 抗体及抗体片段的纯化 10 组氨酸标签蛋白的纯化 15 GST 标签蛋白的纯化 17 MBP&Strep(II) 标签蛋白的纯化 19 膜蛋白的纯化 21 蛋白复合物的纯化 23 包涵体柱上复性 26 TCM 的纯化 28 低分子肝素的纯化 31 疫苗的

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1 GE 医疗中国 层析介质应用手册 GE 生命科学部填料应用部

2 目录 多肽的纯化 3 重组细胞因子的纯化 7 抗体及抗体片段的纯化 10 组氨酸标签蛋白的纯化 15 GST 标签蛋白的纯化 17 MBP&Strep(II) 标签蛋白的纯化 19 膜蛋白的纯化 21 蛋白复合物的纯化 23 包涵体柱上复性 26 TCM 的纯化 28 低分子肝素的纯化 31 疫苗的纯化 33 寡核苷酸的纯化 36 质粒 DNA 的纯化 37 病毒载体的纯化 39 流脑多糖的纯化 42 层析法纯化血浆蛋白 43 PEG 修饰蛋白的纯化 47 细胞色素 C 的纯化 50 合编者 : 曹白红, 董白敏, 樊丰林, 刘白静, 罗白亮, 马志宇, 王济源, 吴宝平, 谢博华, 解红艳, 周白园 ( 按照字母表排序 ) 咨询热线 : 网址 :

3 GE 生命科学部填料应用部 多肽的纯化 简介 氨基酸之间可以通过肽键相连, 分子量在 5000~3000 之间 的肽称为 大肽 ; 分子量在 3000~1000 之间的肽称为 多 肽, 分子量在 1000~180 之间的称为 小肽 寡肽 低聚肽, 也称为小分子活性多肽 大多数多肽都是化 学合成的, 只有非常少的肽是来源于天然提取 更大的肽 一般指超过 25 氨基酸需要通过重组 DNA 的技术表达生产 自然界中 20 种氨基酸, 按照其取代基团性质差异而呈现不 同的酸碱性, 疏水性, 芳香族或者极性侧链 这些侧链的 不同属性可以作为进行色谱分离的基础 多肽的紫外吸收 通常在 206 nm-220 nm, 如果含有芳香族的基团, 紫外的吸 收最大值会在 268 nm-280 nm 检测到 多肽来源分为 : 天然肽如激素, 某些抗生素, 人体内的脑 啡肽, 谷胱甘肽和细菌的毒素都是天然存在的肽 ; 合成多 肽如合成胸腺肽, 重组多肽如 EGF, 及蛋白的多肽消化片段 一 多肽纯化技术简介 1 反相分离技术 ( 首选技术, 小肽常用 ) SOURCE 骨架的反相层析填料为目前可在中压系统中操作的最小孔径凝胶 与传统的硅胶骨架的反相介质相比, SOURCE 填料能在 ph 1-14 稳定工作, 并可以用 1M NaOH 进行清洗再生, 高流速低反压, 应用范围更广, 寿命更长 图 1:SOURCE RPC 颗粒在电子显微镜下的图片 每个颗粒都是大小均匀, 绝无碎片和破碎颗粒 用 Source 5RPC 在 ph 9.5 条件下分析用胰酶消化的 BSA 的 还原肽图 System: ÄKTA purifier Sample: RVP-BSA-mT, ca 750 pmol Column: SOURCE 5RPC ST 4.6/150 Eluent A: NH4OH/HCOOH, 10 mmol/l, ph 9.5 Eluent B: 60% acetonitrile in eluent A Gradient: 0 67% B over 115 ml i.e. 46 column volumes (CV) Flow rate: 0.5 ml/min SOURCE 30RPC 适合中度或精细纯化 SOURCE 15RPC 适合精细纯化 SOURCE 5RPC 适合分析或精细纯化 图 2: 在高 ph 值下进行反相层析分析 RVB-BSA-MT 的肽图 合成的阿尔茨海默氏病人中发现的淀粉样蛋白 -ß1-42 肽肽粗产物溶解在 125 mmol/l,ph 13 的氢氧化钠溶液中, 上柱前再稀释 图 2 为优选各种方法, 其结果表明用 ph 9.0 氨水 / 甲酸能得到最好的分离 咨询热线 : 网址 : 3

4 层析介质应用 2 分子筛技术是利用多肽分子大小 形状差异来分离纯化多肽物质 Superdex peptide 专门分离多肽类产品的高分辨率分子筛凝胶, 分离的分子量范围为 Da 高化学稳定性, ph 1-14, 兼容有机溶剂 ( 乙腈 +TFA) 图 5: 在 superdex peptide PE 7.5/300 上分离标准蛋白 3 离子交换分离技术 图 3: 不同 ph 条件下用 SOURCE 5RPC 反相层析柱分析引起老年痴呆症的淀粉样肽 当分离的多肽带有电荷的时候, 可以选择用离子交换层析进行分离, 通常离子交换会和 RPC 及 SEC 相结合分离复杂的样品, 如酶解多肽片段或者合成多肽, 及天然来源的多肽 用于精细分离的离子交换介质, 如 HP,SOURCE,Mono, Mini 等精细介质非常适合多肽的分离 样品 : 血管紧张肽 Ⅱ 和 Ⅲ 层析柱 :SOURCE 30RPC HR ml 流速 :4 ml/min 图 4: 在碱性条件下用 SOURCE RPC 分离 检测仅相差一个氨基酸的多个血管紧张肽 图 6: 通过 Q sepharose HP 将只有一个 lysine 差异的 x- 肽和它的前体 x-k 肽分开 4 咨询热线 : 网址 :

5 GE 生命科学部填料应用部 二 多肽分离技术的综合运用 对于大多数的多肽来说, 仅仅一步纯化或一种技术应用是不够的, 通常会将反相, 离子交换和凝胶过滤这三种技术综合起来进行多步纯化, 最终达到高的分辨率 例 1:PY574a 多肽,14aa,pI>10, 在酸性条件下不溶, 在碱性条件下进行纯化, 通过离子交换和反相技术的结合, 纯度达到 99% Sp Sepharose XL 粗纯 化学合成法 : 就 Tα1 的化学合成法的生产工艺而言,Tα1 的纯化通常采用反相色谱法和离子色谱法 反相色谱具有极高的分辨率, 可以分离大部分杂质, 离子色谱的分离基于带电荷的差异, 常作为反相色谱的补充纯化合成多肽 DEAE Sepharose Fast Flow Sephadex G-25 Sephadex G10 脱盐 SOURCE 15 RPC SOURCE 15RPC 精纯 合成 Tα1 的 HPLC 图谱 图 9: 化学合成 Tα1 的纯化工艺 图 7: PY574a 多肽纯化流程 例 2: 获得高纯度胸腺肽 α1 可以利用生物提取法 化学合成法 基因工程法三种途径进行生产 三种方法各有优缺点, 但不论哪种生产方法, 为获得高纯度的胸腺肽 α1 产品, 层析技术在每种生产方法中都发挥重要作用 生物提取法 : 多步柱层析法是提高胸腺肽 α1 的纯度及活性的有效方法 采用 DEAE Sepharose Fast Flow 和 CM Sepharose Fast Flow 双柱串联连接,0.02 mol/l PB 平衡, NaCl 梯度洗脱纯化 纯化后的 Tα1 玫瑰花结率达 33% ( 绝对值 ) 以上, 且与传统的超滤工艺相比过敏反应低, 安全性高 由于双离子交换收集的为流穿峰, 比较适合规模化生产 基因工程法 : 对于基因工程法来说, 将 Tα1 与其他标签蛋白进行融合表达, 通过亲和层析的方法纯化融合蛋白后, 再切除标签, 获得重组的 Tα1 由于亲和层析高度的特异选择性, 所得 Tα1 的纯度往往高于 95% DEAE Sepharose Fast Flow Sephadex G-25 SOURCE 15 RPC 重组 Tα1 的 HPLC 图谱 DEAE Sepharose Fast Flow CM Sepharose Fast Flow 图 8: 天然胸腺肽 α1 的双离子交换串联层析 图 10: 重组人胸腺肽 α1 的分离纯化 咨询热线 : 网址 : 5

6 层析介质应用 三 不同来源多肽纯化的总结 : 用 SOURCE 骨架的反相填料, 可以在更宽的 ph 进行工艺优化, 具有更强的适用性以分离各种肽类 离子交换技术很适合合成多肽和天然多肽的纯化, 特别在粗纯的步骤 如果反相和离子交换技术都效果不好, 原因可能是溶解性的问题 使用凝胶过滤如 Superdex peptide,sephadex LH20 都很好的用在多肽纯化中 需要增加选择性, 载量和稳定性 : 用多维纯化方法, 可以将离子交换, 分子筛和反相层析等多种技术结合, 而代替一步反相或反复用反相柱子纯化 四 订货信息 产品 数量 货号 Superdex 30 prep grade 1,000 10, SOURCE 5RPC ST 2.1/ SOURCE 5RPC ST 4.6/ SOURCE 15RPC ST 4.6/ RESOURCE 15RPC 1ml RESOURCE 15RPC 3ml SOURCE 15RPC 10ml SOURCE 30RPC 10ml SOURCE 30RPC 200ml SOURCE 15RPC 10ml Peptide Marker Kit 五 参考文献 1. Staffan Renlund. Purification of a phosphorylated PDGF a-receptor derived 2. peptide at high ph using a polymer stationary phase AB Application Note Courtesy of professor da-fu Cui, Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS 4. ChaoYu et al, Pharmaceutical Biotechnology, (2), Q-H Huang et al, Pharmaceutical Biotechnology, (4), Detection and characterisation of oligosaccharides in column effluents using surface plasmon resonance. Fourteenth International Symposium on the separation and analysis of Proteins, Peptides, and Polynucleotides, Heidelberg, Germany. (1994). Fägerstam, L., Blikstad, I., Bhikhabhai, R. et al. 7. the new geneartion of polystyrene divinyl benzene Reversed Phase Chromatography media, Downstream 29,P18-19, Reverse Phase Chromatograph 手册 李光谱, 迟春萍, 张秀霞, 关晓峰, 王志武, 盛军, 郭岩. 胸腺肽纯化工艺的改进. 中国生物制品学杂志,2003,16(3): 刘标, 汤斌. 高纯度胸腺肽 α1 的制备. 化工学报,2013,64(7): 秦伟涛, 陈劲春 重组人胸腺肽 Tα1 在大肠杆菌中的表达与分离纯化 6 咨询热线 : 网址 :

7 GE 生命科学部填料应用部 重组细胞因子的纯化 简介 重组细胞因子是利用基因工程技术生产的细胞因子的产品, 作为药物用于治疗肿瘤 感染 造血障碍等, 可收到良好 的疗效 通过基因工程技术和多种层析分离技术表达纯化 的高纯度活性细胞因子可以有效促进免疫细胞 干细胞的 体外生长, 用于细胞治疗等相关研究领域 多种相关新药 已经上市 近年出现的动物细胞表达的细胞因子具有完整的糖基化等翻译后修饰, 避免蛋白复性, 稳定的天然构象使因子比活和长期稳定性有显著改进, 逐渐成为技术发展趋势 新型 Capto 系列层析填料, 为来自不同表达系统的多种细胞因子提供高效的生产纯化技术工具, 通过对于宿主杂蛋白 DNA 以及未糖基化修饰完全的变体和异构体的有效去除, 成功得到多种性质均一的活性细胞因子, 提高比活性 常见的重组细胞因子有 : 干扰素 (Interferon, IFN) 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子 (colony-stimulating factor) 趋化因子(chemokine) 生长因子 (growth factor, GF) 白细胞介素系列(interleukin, IL) 等 一 原核表达细胞因子的纯化工艺 1 重组人干扰素 α2b(rh-ifnα2b) 的纯化 : 大肠杆菌发酵 包涵体变性复性 DEAE Sepharose FF Sephacry s-l100 rh-ifnα2b 图 2: 干扰素纯化流程图及电泳检测图谱, 纯度可达 95% 以上, 比活达到 IU/m 以上 ) 2 肿瘤坏死因子 (TNF) 纯化工艺 : 大肠杆菌包涵体表达 变性取上清液 DEAE-SepharoseFF Sephacryls-200 TNF 98% 纯度 Sephacryls 200 图谱 :Peak1 洗脱峰为目的峰 图 3:TNF 的纯化流程图 3 重组人集落刺激因子 (rhg-csf) 纯化工艺 : 大肠杆菌发酵 包涵体变性复性 图 1: 细胞因子的功能 phenyl HP Sephadex G-25 脱盐 Rh G-CSF 图 4: rhgcsf 的纯化流程图及电泳检测图谱, 纯度 >98% 咨询热线 : 网址 : 7

8 层析介质应用 4 趋化因子 (chemokine) 纯化工艺 : 大肠杆菌发酵 菌体破碎收集上清 Ni Sepharose FF 超滤浓缩 SephacrylS-200 Ni 亲和层析图谱 :500 mmol/l imidazole 洗脱 趋化因子图 5: 趋化因子的纯化流程图及层析图 Left: TNFa from HEK293(ActiveMax*):Active trimmer Right: Refolded TNFa from E Coli:Monomer 图 8: 趋化因子的纯化流程图及层析图 Superdex 分子筛结果显示,HEK293 细胞来源 TNFa 可保持天然的三聚体结构 ( 表观分子量 54kD), 具有更好的比活和稳定性 2 重组血管内皮生长因子 (VEGF165) 纯化工艺 : HEK293 细胞化学界定无血请培养 二 动物细胞表达细胞因子纯化工艺 相比细菌原核表达的细胞因子而言, 哺乳动物细胞, 如 HEK293 人细胞表达过程中避免了包涵体形成和复性, 天然的正确折叠构象和翻译后修饰有利于提高比活性 GE Healthcare 可以提供多种层析分离技术, 用于高纯度细胞因子的纯化 生产和分析 1 重组人肿瘤坏死因子 (TNFa) 纯化工艺 : HEK293 细胞化学界定无血请培养 离心过滤澄清 CaptoS 阳离子交换 Capto MMC 多模式阳离子交换 VEGF165 图 9:HEK293 表达 VEGF165 纯化流程图 1 分子量 Marker 细胞培养上清 3 Capto S 洗脱 4 Capto MMC 洗脱 离心过滤澄清 Capto DEAE 阴离子交换 Capto phenyl 疏水层析 1 分子量 Marker 细胞培养上清 3 Capto DEAE 洗脱 4 Capto phenyl 洗脱 TNF 98% 纯度 图 6:HEK293 表达 TNFa 纯化流程图 图 10:Capto MMC 精纯 VEGF165 层析图谱 使用新型多模式 Capto MMC 阳离子交换层析,S 洗脱峰可以高盐直接进样, 免去样品进样前的脱盐或稀释步骤, 有利于层析步骤间的衔接 Capto MMC 温和的洗脱方式有利于保护蛋白活性, 最终得到高纯度 VEGF165, 和较低等昆虫细胞表达 VEGF165 相比具有正确均一的糖基化, 因而具有更高的比活 图 7:Capto phenyl 精纯层析图谱 ( 红色部分为活性组分 ) Capto 系列疏水层析介质提高载量的同时, 通过改进传质效果进一步减小洗脱峰宽度, 因而具有更好的分辨率和收率 8 咨询热线 : 网址 :

9 GE 生命科学部填料应用部 和细菌表达相比,HEK293 细胞表达 IL-4 ( 左图 ) 因糖基化修 饰具有较大分子量 ( 左图, 20kDa), 比活性相应提高 5 倍 (Data not shown) 三 订货信息 产品数量货号 图 11: 不同细胞宿主表达 VEGF165 的活性比较 3 重组人白介素 -4 纯化工艺 : HEK293 细胞化学界定无血请培养离心过滤澄清 IL-4 受体亲和层析 IL-4>98% 纯度图 12:HEK293 表达 IL-4 纯化流程图 Hiprep 16/60 Sephacryl S-100 HR Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR DEAE Sepharose FF (25ml) Q Sepharose HP (75ml) Phenyl Sepharose 6 FF (HS) Phenyl SepharoseHP (75ml) Sephadex G-25 Fine(100g) Sephadex G-50 Superfine (100g) Ni SepharoseHP(25ml) HiTrapCapto Q 5 1 ml HiTrapCapto S 5 1 ml HiTrapCapto DEAE 5 1 ml Capto Q1 25 ml Capto S1 25 ml Capto DEAE1 25 ml HiTrap Desalting 5 5 ml Capto MMC 25 ml HiTrapCapto MMC 5 1 ml Capto Phenyl (high sub) 25 ml HiTrap* Capto Phenyl (high sub) 5 1 ml Superdex75 10/30GL NHS activated 4FF 25ml 四 参考文献 图 13: 受体亲和层析纯化 IL-4 层析图谱 使用 NHS 预活化介质螯合制备 IL-4 receptor 受体亲和层析介质, 用于 HEK293 细胞表达 IL-4 的特异亲和纯化, 可以一步达到 98% 以上的纯度 1. 重组人干扰素 α2b 的提取和纯化 2. 重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺的研究 3. 肿瘤坏死因子的分离纯化 4. 趋化因子受体 CXCR4b 在大肠杆菌中的高效表达 增溶及纯化 5. 两步连续离子交换制备层析分离纯化聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子 6. 重组人白介素 18 的发酵 纯化及功能鉴定技术 7. ActiveMax : Best Cytokines Expressed in Human Cells, Best-Cytokines-Expressed-in-Human-Cells.html# Special thanks: Left: IL-4 from HEK293(ActiveMax*):20kDa Right: IL-4 from E Coli:15kDa 图 14: 不同宿主细胞表达 IL-4 的比较 以上 HEK293 细胞表达细胞因子工艺相关数据由 ACROBiosystems USA 友情提供 ActiveMax* 无动物源性成分活性细胞因子为 ACROBiosystems 公司商标 咨询热线 : 网址 : 9

10 层析介质应用 抗体及抗体片段的纯化 简介 抗体是一大类能与抗原产生特异性结合的蛋白, 抗体也叫 免疫球蛋白 (Ig) 是体液免疫的重要效应分子, 介导 B 细胞 接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白 抗体 的应用有 : 治疗性应用 : 癌症治疗 / 免疫性疾病治疗 诊断应用 : 体内诊断 / 体外诊断 / 检测试剂 分析应用 : 酶联免疫分析 / 抗体芯片 结构功能研究 : 蛋白的结构与功能抗体结构与功能 Ig 是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成的 4 肽链分子, 称为 Ig 的基本结构 根据重链 C 区氨 基酸组成及顺序不同, 将重链分为 :γ α μ δ ε 根 据重链组成不同, 将 Ig 分为五类 :IgG IgA IgM IgD IgE 轻链区可以分为 kappa 轻链和 Lambda 轻链两种类型 图 1: 抗体的基本结构 可变区指轻链和重链中氨基酸序列变化较大的区域 (V 区 ) V 区位于 Ig 分子的 N 端, 占轻链的 1/2 和重链的 1/4 或 1/5 这种变异决定了抗体与抗原结合的特异性 恒定区是指免疫球蛋白轻链和重链中氨基酸序列较保守的区域 (C 区 ) C 区位于 Ig 分子的 C 端, 占轻链的 1/2 和重链的 3/4 或 4/5; 小分子抗体片段药物, 因为缺乏 Fc 片段仍保留着轻链及可变区, 能特异性靶向结合目标分子, 易于用原核系统进行表达 由于它们的分子量小, 更容易的组织渗透而适合很多诊断及治疗应用 近年来小分子抗体药物产品正在快速发展 GE 公司针对抗体和小分子抗体片段提供高特异亲和层析技术为核心的纯化技术平台, 亲和层析粗纯一步即可达到很高的纯度和回收率, 对于大部分应用就已经足够 对于对抗体药物质量要求更为严格的应用, 在亲和层析之后, 除了可以采用离子交换, 凝胶过滤等常规的高分辨率精纯技术外, 还可以应用我公司新推出的高分辨率多模式填料进行精细纯化, 以满足生物制药的需求 一 IgG 的纯化 来源于金黄色葡萄球菌的 Protein A 能特异的与 IgG 的 Fc 片 段结合, 来源于链球菌的 Protein G 能特异的与 IgG 的 Fc 片 段和 Fab 片段结合 选择哪种亲和填料时请参考下表, 不同 种属来源的抗体对 Protein A 和 Protein G 有不同亲和力 种属 Protein G Protein A 人 IgG IgG IgG IgG 兔 母牛 ++ + 马 ++ - 山羊 ++ + 豚鼠 + ++ 绵羊 ++ - 狗 + ++ 猪 小鼠 + - 大鼠 + + 鸡 - - 表 1:Protein A 和 Protein G 对抗体的结和力差异 新一代高流速高动态载量的抗体亲和家族 MabSelect 用高动态载量的刚性骨架偶联 Protein A 或者耐碱的改构 Protein A 具有更好的化学耐受性和寿命, 并带来极高的通量,60 mg/ml 的载量是目前市面上载量最高的抗体亲和胶 MabSelect 家族的选择 载量 (IgG) CIP 配基 Mabselect 30 mg/ml 100 mm- 硫化甘油 重组蛋白 A +15 mm NaOH Mabselect Xtra 40 mg/ml 100 mm- 硫化甘油 重组蛋白 A +15 mm NaOH Mabselect Sure 30 mg/ml 0.1 to 0.5 M NaOH 耐碱改构蛋白 A Mabselect Sure LX 60 mg/ml 0.1 to 0.5 M NaOH 耐碱改构蛋白 A 表 2: 不同种类 Mabselect 介质的性质 10 咨询热线 : 网址 :

11 GE 生命科学部填料应用部 耐碱改构的蛋白 A 称为 SuRe 配基, 该配基蛋白可以耐受 0.5 M NaOH 的清洗, 通过显著延长填料的寿命而降低生产成本 ; SuRe 配基对蛋白酶稳定性更好, 脱落低 洗脱 ph 更加温和 例 1: 用 MabSelect Sure 纯化小鼠腹水来源的鼠 IgG 1, 一步 可以达到 95% 以上的纯度 载量 30 mg/ml ( 图 2) 柱子 : HiTrap MabSelect Sure, 1 ml 样品 : 来源于小鼠腹水的鼠 IgG1 结合缓冲液 : 20 mm Sodium Phosphate 2.5 M NaCl PH 8.0 洗脱缓冲液 : 0.1 M Sodium Citrate PH 4.5 图 4: 抗体药物的纯化平台 抗体纯化平台的建立显示了多模式填料在抗体精细纯化上 的应用优势 为了更有效地去除细胞培养上清中的抗体聚 集体 病毒 抗体的电荷异构体 抗体片段等杂质, 我们 需要高选择性和高分辨率兼备的新填料, 为此我们新推出 Capto adhere ImpRes 和 Capto MMC ImpRes 两款高分辨率的多模式填料 图 2: 用 Hitrap MabSelect SuRe 纯化鼠的 IgG1 例 2: 用 MabSelect SuRe 进行人源化单抗的纯化, 洗脱更加 温和, 纯度 >98%, 回收率 >95%, 动态载量 >30 mg/ml ( 图 3) 样品 : 澄清的细胞培养上清, 人单抗层析柱 :HiTrap MabSelect SuRe 1 ml 结合缓冲液 :20 mm 磷酸钠,0.15 M NaCl, ph 7.4 洗脱缓冲液 :0.1 M 甘氨酸 - HCl, ph 3.5 多模式的强阴离子填料 Capto adhere ImpRes, 粒径仅为 40um, 比 75um 粒径的 Capto adhere 分辨率更高, 同时具有更高的动态结合载量 ( 图 5a) 和更好的抗体聚集体去除效果 ( 图 5b), 在流穿模式 (flow through,ft) 下使用时, 是抗体两步纯化中精细纯化步骤的一个新选择 不仅如此,Capto adhere ImpRes 还可以在结合 / 洗脱模式 (bind/ elute,b/e) 下对抗体进行精细纯化, 这个特性特别适合于那些具有中性或者偏酸性等电点的抗体, 因为这些抗体无法使用流穿模式进行纯化, 同时,Capto adhere ImpRes 的结合 / 洗脱模式的纯化方法, 对抗体片段和异构体的去除特别有很好的效果 图 3: 用 Mabselect Sure 进行人源化单抗的纯化 二 精细纯化 IgG 的方法 对于抗体药物来说, 仅仅经过一步亲和层析还是不够的, 在细胞培养上清中含有大量的宿主蛋白,DNA, 内毒素, 病毒及抗体的聚集体和脱落的亲和配基都需要通过精细纯化步骤进行去除 新型的离子交换填料 Capto Q,Capto S 比传统的离子交换填料具有更好刚性和动态载量, 而 Capto adhere 具有多模式的结合方式, 能一步将内毒素,DNA, 聚集体,protein A,HCP 去除, 开发出更加高效的抗体纯化两步法 图 5:Capto adhere ImpRes 的动态载量 (a) 和聚集体去除 (b) 咨询热线 : 网址 : 11

12 层析介质应用 Capto MMC ImpRes 是一款多模式的弱阳离子填料, 它继承了 Capto MMC 填料可以在高盐下结合样品的特性 ( 图 6), 并且在抗体精细纯化上, 比 Capto MMC 具有更好的动态结合载量 ( 图 7a) 和聚集体去除效果 ( 图 7b) 三 抗体片段 ScFv,Fab,Dab 的纯化 Fab 片段及重组 Fab Fv 和单链抗体 scfv 用木瓜蛋白酶分解全分子抗体纯化得到 Fab 片段, 如果恒定区片段是人源性的则称为重组 Fab 将重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 通过共价健结合得到完整抗原结合活性的最小功能片段即为 Fv 如用一段肽链将二者连接起来形成单一链分子即得到单链抗体 (scfv) 双体分子 Dab 一条单链抗体分子上的 VH 和 VL 与另一条相同的单链抗体分子上的 VL 和 VH 分别配对形成双价的抗体分子 表 3: 抗体片段的类型 图 6:Capto MMC ImpRes 在不同 ph 和盐浓度下的动态载量 Capto L 填料将 L 蛋白偶联于高流速琼脂糖骨架,L 蛋白能特异性结合 kappa 轻链的可变区, 因此 Capto L 也可以用于 相应的 IgA,IgD,IgG 和 IgM 等抗体纯化, 对于包括人, 大 鼠和小鼠在内的不同种属抗体具有亲和作用, 具有高载量 高纯度特点 LambdaFabselect 填料能特异性结合 Lambda 轻链恒定区, 对含有 Lambda 轻链的 IgA,IgE and IgM 有亲和力, 一步可以达到高纯度和高回收率 Kappaselect 填料能特异结合 Kappa 轻链恒定区, 对 IgA, IgE and IgM 的 kappa 轻链片段有亲和性, 一步可以达到高纯度和高回收率 例 3: 用 CaptoL 从转基因动物血浆中纯化 ScFv 片段, 能将牛 IgG 与人和鼠的 IgG 有效分离, 避免了牛抗体的干扰 图 7:Capto MMC ImpRes 的动态载量 (a) 和聚集体去除 (b) 图 9: 用 Capto L 纯化转基因动物血浆中的 ScFv 片段 图 8: 抗体精细纯化解决方案 12 咨询热线 : 网址 :

13 GE 生命科学部填料应用部 例 4: 从大肠裂解液中纯化含 Lambda 轻链的抗体片段, 回 收率达 99%, 一步纯度达 89% 柱子 : 0.4 ml LambdaFabSelect 样品 : 6 ml 同源的大肠裂解液加 1.1 mg/ml human Fab lambda 结合缓冲液 : PBS, ph 7.4 洗脱缓冲液 : 100 mm acetate, ph 3.2 CIP: 120 mm phosphoric acid, 167 mm acetic acid, ph 1.5 流速 : 0.4 ml/min 四 IgM 和 IgY 的纯化 样品 :Hybridoma cell culture containing IgM 柱子 :HiTrap IgM Purification HP,1 ml 结合缓冲液 :20 mm sodium phosphate,0.8 M (NH4)2SO4,pH 7.5 洗脱缓冲液 :20 mm sodium phosphate,30% isopropanol, 20 mm sodium phosphate,ph 7.5 图 10: 用 UV280 检测人的 Lambda 抗体片段的洗脱峰 图 11: 用 Hitrap IgM 纯化淋巴瘤细胞培养的 IgM 五 特异性纯化人血清中所有 IgG 亚型 IgSelect 填料专门针对人的所有 IgG 亚型进行共纯化的目的而开发的, 包括对 Protein A 没有亲和力的 IgG 3 通过 IgSelect 扑捉人血浆中的 IgG, 对纯化后 IgG 亚型进行鉴定与血浆的比例完全相同 血浆 IgSelect 纯化 rprotein A 纯化 IgG1 62.6% 62.3% 62.9% IgG2 28.4% 28.2% 34.2% IgG3 5.9% 5.9% 0.5% IgG4 3.2% 3.7% 2.5% 表 4 :IgSelect 与 rprotein A 纯化人 IgG 的亚型对照 咨询热线 : 网址 : 13

14 层析介质应用 六 订货信息 产品 数量 货号 rprotein A Sepharose Fast Flow 5 ml rprotein A Sepharose Fast Flow 25 ml Protein G Sepharose Fast Flow 5 ml Protein G Sepharose Fast Flow 25 ml KappaSelect 25 ml LambdaFabSelect 25 ml HiTrap KappaSelect 5 1 ml Hitrap rproteina FF 5 1 ml Hitrap rproteing HP 5 1 ml MabSelect 25 ml MabSelect Xtra 25 ml MabSelect SuRe 25 ml MabSelect SuRe LX 25 ml HiScreen MabSelect 1 4.7mL HiTrap MabSelect 5 1 ml HiScreen MabSelect SuRe 1 4.7mL HiTrap MabSelect SuRe 5 1 ml HiTrap MabSelect Xtra 5 1 ml HiTrap MabSelect Xtra 5 5 ml HiTrap MabSelect SuRe 5 5 ml HiScreen MabSelect SuRe LX 1 4.7mL IgSelect 25 ml Capto L 5 ml Capto L 25 ml HiTrap Protein L 5 1 ml HiTrap Protein L 1 5 ml HiTrap Protein L 5 5 ml HiTrap IgY Purification HP 5 ml HiTrap IgM 5 ml Capto adhere ImpRes 25 ml Hitrap Capto adhere ImpRes 5 1 ml HiScreen Capto adhere ImpRes ml Capto MMC ImpRes 25 ml HiTrap Capto MMC ImpRes 5 1 ml HiScreen Capto MMC ImpRes ml Capto adhere 25 ml Hitrap Capto adhere 5 1 ml HiScreen Capto adhere ml 七 参考文献 1. Data file AA 2. 苗景赟等, 抗体生产纯化, 中国生物工程杂志,2008/10 3. 使用 Capto L 捕获单链抗体融合蛋白 抗体片段捕获平台手册 抗体纯化 原理及方法 Intermediate wash study for Protein A 7. MabSelect, a new Protein A Media with high Dynamic Binding Capacity Based on Novel, Highly Rigid, Agarose Beads 8. 苗景赟等, 中空纤维在单抗生产中的应用, 生物产业技术, 2009/02 9. Application note: MabSelect SuRe: studies on ligand toxicology, leakage, removal of leached ligand, and sanitization Application note: High-throughput screening of elution ph for monoclonal antibodies on MabSelect SuRe using PreDictor plates Application note: Dynamic binding capacity study on MabSelect SuRe LX for capturing high-titer monoclonal antibodies KappaSelect and LambdaFabSelect Capture of scfv fusion protein using Capto L MabSelect Application note: Polishing of monoclonal antibodies using Capto adhere ImpRes in bind and elute mode Application note: Polishing of monoclonal antibodies using Capto MMC ImpRes in bind and elute mode 咨询热线 : 网址 :

15 GE 生命科学部填料应用部 组氨酸标签蛋白的纯化 简介 组氨酸标签被广泛的使用, 因为它们小, 几乎不干扰靶蛋 白的功能 活性和结构 固定的金属离子亲和层析 (IMAC) 是纯化组氨酸标签蛋白的最常用方法 二价金属离子螯合 到亲和填料上, 还可以与组氨酸等氨基酸以配位键结合, 从而快速的纯化出标签蛋白 由于宿主蛋白也存在组氨酸 和 / 或半胱氨酸氨基酸残基, 其它的非特异蛋白与靶蛋白一 起与金属离子亲和层析柱料发生结合, 造成纯化样品纯度 不高, 在这种情况下, 上样咪唑的浓度提高, 换 Co 2+ 离子 亲和或者加多一步分子筛技术都是很好的解决方法 一 his 标签蛋白的纯化工具 Ni Sepharose FF 和 Ni Sepharose HP 具有高载量, 达到 40 mg/ml 填料 低 Ni 离子脱落, 在低浓 度的还原剂存在下, 脱落 <5% 无需每次重新螯合上 Ni 2+ 选择在样品缓冲液和平衡液中加入 20 mm-40 mm 的咪唑能 大大提高样品的洗脱纯度 1. LMW-SDS Marker Kit6. Start materal 2. Start material 7. Flowthrough 3. Flowthrough 8. Wash 4. Wash 9. Eluate 5. Eluate 图 2: 用预螯合 Co 2+ 的 TALON 预装柱纯化标签蛋白 HisTrap FFcrude/HiTrap TALONcrude 1 ml/5 ml 直接结合未澄清的样品 直接用注射器操作上未澄清的样品, 节省 分钟时间 降低目标蛋白质被降解的机会 提高低丰度蛋白的纯化回收率 每毫升凝胶结合高达 40 mg 组氨酸融合蛋白质 兼容各种还原性试剂如 DTE,DTT,β-ME, 变性剂如尿素, 盐酸胍, 去垢剂等等 图 1: 两步纯化, 得到高纯度的 his 标签蛋白 1: Start material 2: Eluate HisTrap FF crude 3: Eluate Superdex 75 pg Ni sepharose excel 直接从 CHO 细胞上清中纯化蛋白减少缓冲液置换的工序, 节省了时间, 保持高的结合载量 TALON Superflow 比 Ni 亲和结合力弱, 容易洗脱, 带来更高的纯度 结合缓冲液 :50 mm sodium phosphate, 300 mm NaCl, ph 7.4 清洗缓冲液 :50 mm sodium phosphate, 300 mm NaCl 1, 5 mm imidazole, ph 7.4 洗脱缓冲液 :50 mm sodium phosphate, 300 mm NaCl 1, 150 mm imidazole,ph 7.4 咨询热线 : 网址 : 15

16 层析介质应用 IMAC sepharose 和 Chelating sepharose 未螯合金属离子的填料 HisPrepFF 16/10 放大规模纯化 使用需自己螯合 Ni 2+,Co 2+,Cu 2+,Zn 2+ 预装 20 ml Ni Sepharose FF 介质, 能一次制备 800 mg 的标签蛋白, 与 AKTA 层析系统联用, 能轻易的放大纯化规模, 省去了装柱的时间 图 3: 螯合 Zn 2+ 的 IMAC( 左 ) 与 Chelating( 右 ) 对蛋白有不同的选择性, IMAC 选择性更好 His SpinTrap/His SpinTrap TALON 离心管柱 预装了 100 ul 的 HP 介质, 可 以直接上 600 ul 澄清和未澄清 的样品, 结合 750 ug 标签蛋白 用台式离心机进行纯化, 仅需 10 分钟 His GraviTrap/His GraviTrapKitHis Buffer Kit/His GravTrap TALON 手工重力纯化 预装了 Ni SepharoseFF 1 ml 介质, 上样体积不限, 可以纯 化 40 mg 蛋白, 操作时间 min kit 中包含了供 20 次 使用的缓冲液 His MultiTrap FF/His MultiTrap HP/ His MultiTrap TALON 微孔板 用于高通量筛选和多样品的平行 纯化 预装了 Ni Sepharose FF/ Ni sepharose High Performance 的介质, 具有高重复性, 操作简 单方便快捷的特点 二 产品信息 产品 数量 货号 HisTrap HP 1ml HisTrap HP 5ml HisTrap HP 5ml HisTrap FF 1ml HisTrap FF 5ml HisTrapFFCrude 1ml HisTrapFFCrude 5ml His SpinTrap50 100ul His MultiTrap HP 4 96well His MultiTrap HP 4 96well His MultiTrap FF 4 96well His GraviTrap HiTrap IMAC HP 1ml HiTrap IMAC HP 5ml HiTrap IMAC.FF.1ml HiTrap IMAC.FF.5ml HiTrap Chelating.HP.1ml HiTrap Chelating.HP.5ml HiTrap Chelating.HP.5ml HisTrap excel 5 1 ml HiTrap TALONcrude 5 1 ml TALON Superflow 10 ml His SpinTrap TALON µl His GravTrap TALON 10 1 ml His MultiTrap TALON 4 96-well HiLoad 16/60 Superdex / 三 参考文献 1. 亲和层析技术纯化手册 2. 重组蛋白纯化手册 3. Data file AB 4. Instructions AC 16 咨询热线 : 网址 :

17 GE 生命科学部填料应用部 GST 标签蛋白的纯化 简介 谷胱甘肽 -S 转移酶 (GST) 基因融合蛋白生产系统是表达 纯化和检测 E. coli 生产的 GST 标签蛋白的多功能系统 GST 谷胱甘肽转移酶能特异的与谷胱甘肽结合, 表现为酶和底物的作用原理, 从而利用这个原理, 将 GST 做成标签表达出融合蛋白, 与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合, 从而纯化出目标蛋白, 再用特异性的酶将 GST 标签切除从而得到天然蛋白 结合缓冲液 : Mm PBS; mm Tris-HCl; ph ; mm NaCl; 0 5 mm DTT; 0% to 5% glycerol and 0 2 mm glutathione. 洗脱缓冲液 : 50 mm Tris-HCl, 10 mm reduced glutathione, ph 8.0 洗脱方法 : 离心 GST 融合蛋白纯化的特点有 : 纯度高, 纯化条件温和保持蛋白活性, 促进蛋白可溶性表达 一 Vector 系统 质粒的载体系统 pgex-6p-1, pgex-6p-2, pgex-6p-3 pgex-4t-1, pgex-4t-2, pgex-4t-3 pgex-5x-1, pgex-5x-2, pgex-5x-3 pgex-2tk 体外检测表达 带有的酶切位点 Prescission protease Thrombin Factor Xa Thrombin 用于切除标签的酶 内切酶 分子量 去除方法 PreScission Protease ( 带 GST 标签融合蛋白 ): Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro Mr 用 GST 亲和柱 Bovine thrombin: Mr 苯甲脒亲和柱 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser Bovine Factor Xa:Ile-Glu-Gly-Arg Mr 苯甲脒亲和柱 二 表达菌株高通量筛选的工具 MultiTrap FF,GST MultiTrap 4B 筛选工作可以用于高表达菌株的筛选, 也可以用于筛选最佳的样品处理条件或者结合洗脱条件 96 孔板预装 GST MultiTrap FF 样品 : 未澄清的 E. coli BL21 裂解液含 GST-taggedhippocalcin, Mr 纯化方法 : 根据说明书, 样品体积 : 500 μl 系统体积 : μl 1. LMW markers 2. 起始样品 3. 超声, 10 mm PBS, 140 mm NaCl, ph 细胞裂解液 kit, 10 mm PBS, 140 mm NaCl, ph 细胞裂解液 kit, 10 mm PBS, 400 mm NaCl, 2 mm glutathione, 5% glycerol, ph 8 6. 超声破碎, 20 mm PBS, 400 mm NaCl, 5% glycerol, ph 超声破碎, 20 mm PBS, 400 mm NaCl, 2 mm glutathione, ph 8 8. 超声破碎, 50 mm Tris-HCl, 400 mm NaCl, 5% glycerol, ph 超声破碎 50 mm Tris-HCl, ph 超声破碎, 50 mm Tris-HCl, 140 mm NaCl, 2 mm glutathione, 5 mm DTT, 5% glycerol, ph 超声破碎, 100 mm Tris-HCl, 140 mm NaCl, 5 mm DTT, ph 超声破碎 :100 mm Tris-HCl, 270 mm NaCl, 1 mm glutathione, 2.5 mm DTT,2.5% glycerol, ph 7.4 图 1. SDS-PAGE 还原电泳图, 不同泳道的洗脱峰用不同的处理方式来裂解细胞, 从而找到最佳纯度和灰绿色 三 应用于快速纯化标签蛋白的预装柱 GSTrap FF 使用方便的预装柱结合注射器 泵或者色谱系统,GST 标签蛋白的纯化常常可以一步获得 柱子 : GSTrap FF 1 ml 样品 : 8 ml 大肠杆菌可溶表达 GST fusion protein 裂解液 结合缓冲液 :PBS, ph 7.3 洗脱缓冲液 :50 mm Tris-HCl,pH 8.0 加 10 mm reduced glutathione 流速 : 1 ml/min 纯化过程 : 4 CV binding buffer, 8 ml sample, 10 CV binding buffer, 5 CV elution buffer, 5 CV binding buffer (CV = column volume) 洗脱 : ÄKTAexplorer 咨询热线 : 网址 : 17

18 层析介质应用 Lane 1:LMW Lane 2: 起始细胞质提取液 Lane 3: 洗脱纯化后 GST 蛋白 Elution buffer % Elution buffer 图 2: 用预装柱快速纯化 GST 标签蛋白, 一步纯度达到 95% mg pure GST fusion protein 用凝血酶柱上酶切纯化 SH2-domain GST 融合蛋白 样品 : 100 ml clarified E. coli extract expressing SH2-domain GSTtagged protein (Mr ) 柱子 : GSTrap 5 ml 结合缓冲液 :20 mm phosphate, 150 mm NaCl, ph 7.3 洗脱缓冲液 :50 mm Tris-HCl, 10 mm reduced glutathione, ph 8.0 酶切 : 20 U/ml Thrombin Protease for 14 hours at room temperature 流速 : 10 ml/min 上样和清洗,2.5 ml/min 洗脱洗脱 : ÄKTAexplorer 四 产品信息 产品 数量 货号 GSTrap HP 5 1ml GSTrap HP 5 5ml GSTrapFF 5 1ml GSTrapFF 5 5ml GSTprep FF 16/ GST MultiTrap FF 4 96well GSTrap 4B 5 1ml GSTrap 4B 5 5ml GST MultiTrap4B 4 96well HiLoad 16/60 Superdex / HiTrapBenzamidine FF (high sub) 5 1 ml PreScission Protease 500 units Thrombin 500 units Factor Xa 400 units GST Detection Module 50 reactions Anti-GST Antibody 0.5 ml E. coli BL21 1 vial Collection Plate, 96-well plate 500 μl, V-shaped bottom 5 pack 五 参考文献 1. GST gene fusion system handbook Recombinant Protein Handbook Affinity Chromatography Handbook marker 2 柱前 3 穿透 4 清洗 567 酶切洗脱液 8 洗脱液 图 3: 用 PreScissionprotease 柱上酶切纯化 TLP40 蛋白 18 咨询热线 : 网址 :

19 GE 生命科学部填料应用部 MBP&Strep(II) 标签蛋白的纯化 简介 MBP 标签蛋白 麦芽糖结合蛋白 (MBP) 有 42.5 KD 大小, 不含 Cys, 作为融 合蛋白的标签, 通常放在 N 端在通常在大肠杆菌中进行表 达 MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达, 尤其对于难表达 的真核细胞蛋白, 膜蛋白, 病毒蛋白有很好的促溶表达能力, MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行, 使用麦芽糖进行温和洗脱 保护了 MBP 标签蛋白的活性 标签在纯化后期 需要用酶切去除, 常用的内切酶是 Factor Xa, 麦芽糖酶和 肠激酶 图 2:AKTAxpress 串联两步纯化 MBP2*-paramyosin-δ-Sal 标签蛋白, 还原 SDS-PAGE Strep(II) 标签蛋白 Caveolin: 膜蛋白, 含跨膜区, Acyl trans.: 水生非脊椎动物酶 MAV-1: 鼠腺病毒蛋白 MNV Norovirus 诺如病毒, 胃流感病毒衣壳蛋白 图 1: 不同标签可溶性表达能力的比较,MBP 表现最佳 Strep(II) 标签是只有八个氨基酸 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe- Glu-Lys) 的小标签, 分子量仅有 1000, 通常不需切除 Strep( II ) 标签可以放在 N 端或者 C 端也可以在真核细胞中表达, 他不能结合抗生物素蛋白 (avidin) 为了防止宿主中 的生物素化的蛋白竞争性结合到柱子上, 造成载量偏低, 可以在样品中加入抗生物素蛋白屏蔽掉宿主蛋白的干扰 一 MBP 标签蛋白的纯化 MBPTrap HP 1 ml/5 ml 预装柱是带有糊精特异性配基的琼脂糖高效凝胶, 载量大约 10 mg/ml, 填料颗粒是 34 um 所以能得到非常集中的纯化峰, 同时富集纯化蛋白 洗脱的时候采用 10 mm 的麦芽糖竞争性洗脱 预装柱可以直接用 0.5 M NaOH 进行再生, 并可以多次反复使用 用 AKTAxpress 自动两步纯化 MBP 标签蛋白 两步纯化制备 2.2 mg 蛋白 总的纯化时间 3.4 h 洗脱得到蛋白具有高纯度 1 st step (AC): 柱子 : MBPTrap HP 1 ml 样品 : 7 ml MBP2*-paramyosin-δ-Sal (Mr~70 000) in E. coli lysate 结合液 :20 mm Tris-HCl, 200 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1 mm DTT, ph 7.4 洗脱液 :10 mm maltose in binding buffer 2 nd step (GF): 柱子 : HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 样品 : Eluted pool from MBPTrap HP 1 ml 缓冲液 :10 mm sodium phosphate, 140 mm NaCl, ph 7.4 二 Strep(II) 标签蛋白的纯化 带 Strep-Tactin 配基的 streptrap HP 介质能特异性的结合 Strep(II) 标签蛋白, 结合亲和力是链霉抗生物素蛋白结合亲和力的 100 倍, 因此纯化 strep(ii) 标签蛋白非常理想 纯化 过程在生理条件下进行, 使用脱硫生物素温和程度的洗脱 保护了靶蛋白的活性 大肠杆菌表达的双标签蛋白 (His)6-mCherry-Strep(II) 的纯化, 在不同的规模进行制备 柱子 : A StrepTrap HP 1 ml B StrepTrap HP 5 ml C StrepTactinSepharose HP XK 26/20, 29 ml, 样品 : (His)6-mCherry-Strep(II) (Mr~31 000), in E. colilysate 结合缓冲液 :100 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, ph 8.0 洗脱缓冲液 :2.5 mm desthiobiotin in binding buffer 再生液 : 0.5 M NaOH) 系统 : ÄKTAexplorer 100 咨询热线 : 网址 : 19

20 层析介质应用 样品 : Strep(II)-protein-(His)6,Mr: 流速 : 0.8 ml/min Run 1: HisTrap HP 1 ml Run 2: StrepTrap HP 1 ml Lane: 1. Marker 2. HisTrap HP 柱上穿透液 3. run1 单独从 HisTrap HP 上纯化 4. Flow through, HisTrapHP+StrepTrap HP 5. HisTrapHP+StrepTrap HP 6. run2 单独从 StrepTrap HP 上纯化 7. StrepTrap HP 柱上穿透液 图 4: 双标签蛋白通过两步亲和纯化得到高纯度的蛋白 三 产品信息 产品数量货号 图 3: 不同规模下进行 strep 标签蛋白, 每毫升载量 2 mg 左右, 最大的制备约 50 mg 蛋白 Strep(II) 通常与 His 标签一起构建双标签系统, 通过两步亲和层析得到高纯度的蛋白, 由于 strep 的纯化结合过程不受 高浓度的咪唑影响, 所以常常跟在 Ni 亲和后进行双标签蛋 白的精细纯化, 制备全长的蛋白, 同时得到高纯度的样品 同时保证纯化得到的蛋白是全长的蛋白 两种小标签通常 不需要切除也不会影响蛋白的功能结构 MBPTrap HP 5 1ml MBPTrap HP 5 5ml StrepTrap HP 5 1ml Strep Trap HP 5 5ml HiLoad 16/60 Superdex / HiLoad 26/60 Superdex 75 16/ HiLoad 26/60 Superdex 75 26/ 四 参考文献 1. Quillinet al., Biochemistry, 44, , (2005) 2. Shkrobet al., Biochem. J., 392, , (2005) 3. 重组蛋白标签纯化手册 4. Data File, StrepTrap HP, AA 5. Data File, MBPTrap HP, AA 6. StrepTrap HP, AA 7. 7 MBPTrap HP, AA 8. Purification of Strep(II)-tagged proteins using new prepacked columns, AA 9. Purificarion of MBP-tagged proteins using new prepacked columns, AA 20 咨询热线 : 网址 :

21 GE 生命科学部填料应用部 膜蛋白的纯化 简介 膜蛋白质在基础生理过程 ( 如分子转运, 信号转导, 能量利用以及细胞核组织结构的维护 ) 具有极其重要的作用 基因组序列中大约有 30% 的基因编码的是膜蛋白, 其中 50% 是目前已知药物的靶点 膜蛋白一般由一个或多个跨膜片段构成. 其中跨膜的成分由单链的及成簇的 α 螺旋或 β 折叠结构组成, 相应的膜蛋白质则被称为 α 螺旋膜蛋白或 β 折叠膜蛋白 膜蛋白纯化和分析都有很大的挑战, 首先是膜蛋白很难制备大量, 通常膜的体积只有细胞体积的 0.3%, 通过基因重组过表达来生产膜蛋白通常对细胞具有毒性, 很难实现大规模的生产 常规的膜蛋白都是与细胞膜结合, 要分离制备首先是用去垢剂将其溶解纯化, 然后去除去垢剂人工构建磷脂双分子层, 再进行功能和活性的研究 二 膜蛋白的纯化 目前重组过表达的形式生产膜蛋白是最常用的方法 而大部分膜蛋白都带有亲和的标签,his-tag 是最常用的标签 对于膜蛋白表达的亲和标签 : 连接在 C 端, 如果是 his-tag 用更长的标签 8-10 个 his 在标签和蛋白之间插入酶切位点 1 His MultiTrap 可以用于膜蛋白表达的筛选 Dot-Blot 分析是常用于带标签的膜蛋白克隆株的筛选,FOS- Choline-12 (FC12) 试剂溶解融合膜蛋白后, 用 his-tag 抗体进行免疫反应找出高表达菌株 一 膜蛋白纯化的通用工艺 重组过表达来源天然来源膜组分的分离溶解 His MultiTrap 图 2: 用 96 孔板方式通过 blot 筛选带标签的膜蛋白表达菌株 2 细胞膜的分离: 细胞破碎后通过离心和凝胶过滤技术都可以成功的将细胞膜从细胞碎片中分离出来 柱子 : Sepharose CL-4B and Sepharose CL-6B in tandem. 纯化 体外组装 条件处理 功能研究 结构研究 图 1: 膜蛋白通用纯化工艺 From: Lundahl et al: BBA 855 (1986) 图 3: 用分子筛制备红细胞膜 咨询热线 : 网址 : 21

22 层析介质应用 3 膜蛋白的溶解: 它是整个膜蛋白制备过程中最关键的步骤 通过溶解过程, 用去污剂将膜蛋白从它们所处的自然环境 ( 脂膜 ) 中提取至水溶性环境 去污剂可以打破脂双层, 并将膜蛋白和脂类包裹进去污剂微胶束中 因此方便蛋白质的分离 Membrane Protein Purification Kit 非标签蛋白的纯化 溶解 n-octyl tetraoxyethylene ether (C8E4) 离子交换 RESOURCE Q 1 ml 分子筛 Superdex 20010/300 GL 1 用 7 种不同去垢剂溶解样品 结晶 图 6: 从大肠中表达的非标签膜蛋白 OmpA 的亚单位的纯化 2 混合充分孵育 3 加入 Ni Mag Sepharose TM 的磁珠或者用分子筛 Superdex 200 进行纯化 三 产品信息 产品 数量 货号 HisTrapTM HP, 5 5 ml Superdex /300GL His MultiTrap FF 4 96well filter plates His MultiTrap HP 4 96well filter plates Membrane Protein Purificaiton Kit 图 4: 膜蛋白纯化试剂盒工作流程 4 放大纯化 : 从 kit 找到的蛋白可以直接用 histrap 1 ml/5 ml 的预装柱放大纯化 1) 亲和 : 柱子 :HisTrap HP 5 ml 2) 分子筛柱子 :Superdex200 10/300 GL 去垢剂 :Dodecyl Maltoside 去垢剂 :Dodecyl Maltoside 4 westernblot 定量和分析分析结果, 找到最好的去垢剂 四 参考文献 1. Detergents: An overviewneugebauer, J.M., Methods Enzymol. 182, (1990) 2. Properties of detergentshelenius, A, et al, Methods Enzymol. 56, (1979) 3. Solubilization of native membrane proteinshjelmeland, L.M., Methods Enzymol. 182, (1990)Marston, F.A.O. & Hartley. D.L., Methods Enzymol. 182, (1990) 4. Removal of detergents from membrane proteinshjelmeland, L.M., Methods Enzymol. 182, (1990) 5. 富有挑战蛋白纯化手册 6. Data File AA 图 5: 两步法纯化 his-tag 标签蛋白 YedZ-GFP 22 咨询热线 : 网址 :

23 GE 生命科学部填料应用部 蛋白复合物的纯化 简介 单独存在的蛋白质并不能执行功能, 而需要通过同其它蛋白相互作用来实现, 蛋白质复合物是潜在的 非常重要的药物靶点 许多蛋白 - 蛋白相互作用能够导致稳定复合物的形成, 这些复合物在分子水平上能够被分离并鉴定 例如, 抗原 抗体复合物以及蛋白酶 蛋白酶抑制剂复合物 蛋白质复合物能够由 10 个甚至 100 个以上不同亚基构成 随着不同亚基的大小和数量上升, 进行分离纯的难度提高 采用层析的方法可将天然存在的多蛋白复合物 ( 非重组 无亲和标签 ) 纯化出来以用于结构及功能研究 一般设计合理的层析流程, 运用不同的层析原理进行分离纯化 用于多蛋白复合物纯化的层析技术以及考虑因素见下表 : 技术分离原理优点 / 缺点 凝胶过滤 亲和层析 离子交换 大小和形状 生物特异性吸附 电荷 + 温和的分离条件, 在宽的 ph 和电荷浓度下进行分离, 可以用添加剂 + 特异性好 - 需要寻找标签或者抗体等特异性的纯化方法, 洗脱的条件有时剧烈, 改变的 ph 和盐浓度会干扰复合体的相互作用 + 高分辨率, 通常有效 - 盐浓度梯度洗脱有时干扰蛋白内部的相互作用 疏水层析 疏水性 表 1: 不同层析技术对蛋白复合物的影响 + 对于其他技术是种补充 A - 高盐条件结合可能会干扰蛋白相互作用 一 天然蛋白复合物用 pull down 方法纯化 1 串联亲和层析纯化方法 (TAP) TAP 的基本原理就是一个诱饵蛋白 ( 一个已知或假想地复合物组分 ) 同时带上蛋白 A 和钙调素结合肽 (CBP) 两个标签, 在这两个标签之间含有烟草花叶病毒酶 (TEV) 酶切位点 利用连续两步亲和层析来分离蛋白质复合物 两步亲和层析目的是提高纯化过程的特异性继而降低假阳性出现的几率 本方法所使用的每一个条件都很温和, 这样是为了保持复合物的完整性并且保证产量的最大化 图 1:IgG Sepharose 和钙调素 Sepharose 亲和介质串联纯化蛋白复合物示意图 2 GST 亲和 pull-down GST pull-down 用带 GST 标签的诱饵蛋白从生物样品中纯化一个或几个蛋白, 具有纯化低丰度蛋白复合物的能力 3 免疫共沉淀 IP 使用复合物中一种组分 ( 已知或假想的 ) 的抗体, 同其抗原也就是多蛋白复合物的一部分结合用亲和介质 protein A 或 protein G 或带这种蛋白的磁珠通过离心或磁场将抗体 蛋白复合物捕获 也可用 NHS 活化的 Sepharose 自己螯合相关抗体或抗原, 进行免疫共沉淀 咨询热线 : 网址 : 23

24 层析介质应用 洗脱分离蛋白复合物,SDS-PAGE 分析, 胰酶消化质谱分析 图 3: 人的剪接体复合物的纯化流程,B) 用凝胶过滤分析纯化剪接体复合物 2 纯化组织相容性复合体 Ⅱ(MHC Ⅱ) 增强体的亚复合物 图 2: 免疫共沉淀制备蛋白复合物 二 重组蛋白复合物的分离对于大量制备蛋白复合物的应用, 一般采用重组的方法进行制备, 这种方法可用于将分别分离得到的组分组装成复合物 1 亲和层析纯化人类剪接体 亚基复合物人类剪接体是一个由 RNA 和蛋白质构成的 145 个亚基复合物, 使用亲和层析作为主要步骤的一种方法纯化获得, 最终的纯化步骤是在分子筛上进行 剪接体用 32p 标记的 pre-mrna 核酸提取物体外组装加入 MS2-MBP 带标签诱饵蛋白与 pre-mrna 结合用 GST HP 介质进行纯化凝胶过滤,sephacryls-500 RFX 复合物是由 3 个蛋白组成 :RFXB RFXAP 和 RFX5 RFX5 蛋白是由 5 个结构域组成, 其中 N 端结构域 (1 90) 负责多聚化 RFX5 以及不同长度的 RFX5 构建体都表达成组氨酸标签的蛋白,RFXAP 可同 RFX5 的 N 端结构域形 成稳定的复合物, 因此它们可以被共纯化出来 通过 IMAC 进行纯化 在变性条件下, 对这两个蛋白的复合物进行第二 步 IMAC 纯化 在穿透液中回收 RFXAP, 并通过分子筛层析 对其进行下一步的复性 浓缩以及纯化 纯化出来的蛋白 以及蛋白片断被用于多聚化研究并为 RFX 复合物与 MHC Ⅱ 启动子之间的相互作用构建出一个 DNA 结合模型 His-TEV-RFX 蛋白 Ni 亲和纯化 histrap 1ml TEV 酶切 离子交换精细纯化 MonoQ 5/50GL Mono S 5/50GL 浓缩 凝胶过滤 superdex 75.superdex 200 图 4: 组织相容性复合体 Ⅱ(MHC Ⅱ) 增强体的亚复合物的纯化流程图 24 咨询热线 : 网址 :

25 GE 生命科学部填料应用部 三 产品信息 产品 数量 货号 AbSpinTrap μl HiTrap Protein A HP 2 1 ml HiTrap Protein G HP 2 1 ml CalmodulinSepharose 4B 10 ml IgGSepharose 6 Fast Flow 10 ml HiTrap Desalting 5 5 ml Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 25 ml GSTrap HP 5 1 ml GSTrap FF 2 1 ml IMAC Sepharose High Performance 25 ml HisTrap FF crude 5 1 ml GSTrap 4B 5 1 ml Superdex 75 10/300 GL 1 24 ml Superdex /300 GL 1 24 ml HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR ml HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR ml HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR ml Mono Q 5/50 GL 1 1 ml Mono S 5/50 GL 1 1 ml 四 参考文献 1. Romier, C. et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts:experimental procedures, database tracking and case studies ActaCryst. D62, (2006). 2. van den Heuvel, R. H. H. et al. Improving the performance of a quadrupole time-of-flightinstrument for macromolecular mass spectrometry. Anal.Chem. 78, (2006). 3. Li, S. et al. A map of the interactome network of themetazoan C. elegans.science 303, (2004). 4. Einarson, M. and Orlinick, J. Identification of protein-protein interactions with glutathione-stransferasefusion proteins, in Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual (Golemis,E. A. and Adams, P. D., eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2002). 5. Puig, O. et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods 24, (2001). 6. Dziembowski, A. and Seraphin, B. Recent developments in the analysis of protein complexes.febslett.556, 1 6 (2004). 7. Forler, D. et. al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.nature Biotech.21, (2003). 咨询热线 : 网址 : 25

26 层析介质应用 包涵体柱上复性 简介 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集, 形成无活性的 固体颗粒, 一般有 50% 以上的重组蛋白, 其余为核糖体元 件 RNA 聚合酶 内毒素 外膜蛋白等, 环状活缺口的质 粒 DNA 以及脂质 多糖等, 大小为 um, 具有很高的 密度 ( 约 1.3 mg/ml), 无定形, 呈非水性, 只溶于变性剂 如尿素 盐酸胍等 一 包涵体的溶解 : 缓冲液 变性剂 包涵体 浓度 温度时间还原剂 三 柱上复性的实例 1 分子筛复性有两种方法: 一种做法是用复性液平衡分子筛柱, 然后将变性的样品直接上柱复性, 但直接上变性样品, 柱子很容易堵死, 不推荐 一种是在上样前, 用变性液与复性液在柱上做个梯度, 用复性液进行洗脱 柱子 : Superdex 75 10/300 GL 样品 : Lysozyme in 8 M urea, 0.2 M DTT 复性液 : 0.1 M Tris-HCl, ph 8.7, 1 mm EDTA, 150 mm NaCl, 3 mm reduced glutathione (GSH)/0.3 mm oxidizedglutathione (GSSG) 柱子平衡液 :6 ml linear gradient from 8 M to 2 M urea in refolding buffer 起始条件 50 mm Tris- HCl, ph M urea mg/ml 室温 60 min 变量范围 没限制 6 8 M urea 6 8 M 盐酸胍 min 12 h 1 10 mm DTT ( 含二硫键 ) 表 1: 包涵体溶解试验的条件 二 包涵体复性方法 变性蛋白 中间体 天然蛋白 成功复性的关键是反应朝主要目标进行, 抑制产生聚集的竞争性路径 一般需要在蛋白浓度, 温度, 反应时间, 添加剂, 二硫键交换剂等参数上进行优化 复性技术优点 缺点 透析简单慢, 需要大量缓冲液 稀释 简单 慢, 蛋白浓度低 (10-50 ug/ml) 凝胶过滤 简单, 一步复性和去除聚集体 处理体积小 金属螯合层析 蛋白聚集 简单快速自动化, 可以一步复性和蛋白纯化 需要 his 标签 离子交换 快速简单自动化 避免使用与离子交换剂 相反电荷添加剂 图 1: 溶菌酶用分子筛进行 urea 梯度复性, 打星号的位置是溶菌酶复性蛋白 蓝线 280 nm, 棕色线电导, 红线是 urea 理论值 2 利用 Ni Sepharose 层析可以实现组氨酸标签蛋白进行简单有效的纯化和柱上复性方法, 可以在将蛋白从柱子上洗脱之前去除杂质并通过改变成非变性缓冲体系使其复性 复性之后的蛋白可根据需要使用其它方法进一步纯化 结合液 : 6 M guanidine hydrochloride, 20 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mm imidazole, 1 mm 2-mercaptoethanol, ph 8.0 溶解液 : 6 M urea, 20 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mm imidazole, 1 mm 2-mercaptoethanol, ph 8.0 洗脱液 : 20 mmtris-hcl, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, 1 mm 2-mercaptoethanol, ph 8.0 复性液 : 20 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mm imidazole, 1 mm 2-mercaptoethanol, ph 8.0 表 2: 不同复性技术的比较 26 咨询热线 : 网址 :

27 GE 生命科学部填料应用部 四 产品信息 产品数量货号 图 2: 柱上复性 his-tag 蛋白 3 阴离子交换介质和阳离子交换介质都成功的运用在蛋白柱上复性纯化上 任然通过正负电荷相互吸引的作用进行 结合, 但结合的时候通常需要更低的离子浓度 柱子 : 样品 : HiTrap Q FF, 1 ml 1 ml BSA mg/ml denatured-reduced (contains 17 disulfide bonds) 起始缓冲液 : 50 mm Tris-HCl, 3 mm EDTA, 8 M urea, ph 8.5 复性缓冲液 r: 50 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, 79 mm urea, 1.1 mm oxidized glutathione (GSSG), 2.2 mm reduced glutathione (GSH), ph 8.5 孵育 0 to 40 h 清洗缓冲液 r: 50 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.5 洗脱缓冲液 r: 0 to 1 M NaCl in 50 mm TrisHCl, ph 8.5 HiTrap Chelating HP 5 1 ml HisTrap FF 5 1 ml HisTrap HP 5 1 ml HisPrep FF 16/10 20 ml Ni Sepharose HP 25 ml Ni Sepharose FF 25 ml Hiload 16/60 Superdex 75 pg Hiload 26/60 Superdex 75 pg Superdex 75 pg 150 ml HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR Sephacryl S-100 HR 150 ml HiTrap Q FF 5 1 ml 五 参考文献 1. Middelberg, A. Preparative protein refolding. Trends Biotech.20, (2002). 2. Esposito, D. and Chatterjee, D. K. Enhancement of soluble protein expression through theuse of fusion tags. Current Opinion Biotech, 17, (2006). 3. Swietnicki, W. Folding aggregated proteins into functionally active forms. Current Opinion Biotech.17, (2006). 4. Gu, Z., et al. Urea gradient size-exclusion chromatography enhanced the yield of lysozymerefolding. J. Chromatogr. A 918, (2001). 5. Rogl, H. et al. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodiesimmobilized by nickel chelating chromatography. FEBS Letters 432, (1998). 6. Langenhof, M. et al. Controlled oxidative protein refolding using an ion-exchange column.j. Chromatogr. A 1069, (2005). 7. Li, M. et al. Dual gradient ion-exchange chromatography improved refolding yield oflysozyme. J. Chromatogr. A 959, (2002). 图 3: 白蛋白阴离子交换柱上复性,F1 含有复性蛋白 8. 包涵体蛋白质的复性研究进展 9. 重组包涵体蛋白质的折叠复性 10. 快速纯化从大肠杆菌以包涵体表达的组氨酸融合蛋白和复性 咨询热线 : 网址 : 27

28 层析介质应用 TCM 的纯化 简介 TCM 是指传统中药 (Traditional Chinese Medicine) 中药的化学成分极其复杂, 有效成分种类很多, 诸如生物碱 甙 黄酮 醌 多酚 内脂 香豆素 萜 有机酸 寡糖 多糖 环肽 甚至蛋白, 又常有数种有效成分并存 合成前体相同 配基链长不等 手性特征变化 含量特低, 以及炮制反应 等问题, 故单一中药活性成分的纯化工艺开拓往往涉及多 种分离技术以及各种技术之间的连接和配合 GE 公司集数十年的纯化经验, 积累大量理论和技术在 Sephadex ( 葡聚糖 ) Sepharose ( 琼脂糖 ) Monobeads Source( 聚苯乙烯 ) Capto( 高流速琼脂糖 ) 等基架上开发有凝胶过滤 离子交换 金属鳌合 亲和层析 正相层析 反相层析等多种类型和多种性质的数百种色谱介质, 供应从 ng 到 Kg 级的高 中 低压色谱设备提供凝胶过滤 离子交换 金属鳌合 亲和层析 反相层析 正相层析 逆流色谱等多种色谱技术体系 一 TCM 纯化平台 生物碱纯化平台 <ph 3 的酸水提取 + 阳离子交换 SP Sepharose HP+ 中 高压硅胶反相生物碱是来源于植物界的含氮有机化合物, 为非常重要的中草药有效成分 在传统的硅胶或氧化铝层析上效果往往不理想 建议用 <ph 3 的酸水提取生物碱, 直接上阳离子交换介质 SP Sepharose HP, 这种介质载量高, 易于直接放大, 对生物碱有特殊的选择性, 可以从酸水粗提物中分离结构近似的十几种生物碱, 一步到达 60-80% 的纯度 ( 图 1), 然后再上中 高压反相层析如 SOURCE15RPC 或 C18 硅胶可将纯度提高到 90% 以上 SOURCE 是 ( 聚苯乙烯 ) 为基架的反相介质, 可耐受 1 M 强酸强碱, 比传统的如 C8 C18 硅胶反相介质使用范围更宽广, 寿命更长 图 1: 五种中药中常见的生物碱包括用于兴奋中枢神经的士的宁 咖啡因 ; 用于镇痛 解毒的阿托品 局部麻醉药普鲁卡因及抗疟疾药奎宁在 SP Sepharose HP 阳离子交换层析柱上得到了很好的分离效果,pKa 值越高越晚洗脱 有机酸纯化平台 >ph 11 的碱水提取 + 阴离子交换 Q Sepharose HP 或 Sephadex LH 20 + 高压硅胶反相有机酸多与钾 钙 钠或生物碱结合成盐, 也以游离的形式存在而发挥生理作用, 例如 : 柠檬酸 酒石酸 苹果酸 抗坏血酸, 与生物碱相反, 有机酸带负电荷, 纯化建议用 >ph 12 的碱水和醇提取有机酸, 直接上阳离子交换介质 Q Sepharose HP, 一步纯度可达 50% 以上, 然后再上 ( 或直接上 )Sephadex LH-20 或反相层析将纯度提高到 90% 以上 图 2: 川芎中纯化咖啡酸和阿魏酸 :>ph 11 碱水提取 ( 纯度 <10%) 阳离子交换 SP Sepharose HP( 纯度 >90%) 28 咨询热线 : 网址 :

29 GE 生命科学部填料应用部 皂甙纯化平台 >ph 11 的碱水提取 + 阴离子交换 Q Sepharose HP + 中 高压硅胶反相 皂甙是不少常用中草药的有效成份之一, 如人参 柴胡 甘草 桔梗等 皂甙类分子由于同时具有强极性的糖基和 弱极性的甾体, 化学性质类似去污剂, 振荡后会产生气泡, 纯化常常遇到困难 不少皂甙含羧基, 可用碱水加醇提取, 直接上阴离子交换 Q Sepharose HP, 它对皂甙类分子有特 殊的选择性和纯化效果 黄酮甙纯化平台 水和醇提取 + 阴离子交换 Q Sepharose HP 去色素 +Sephadex LH 20 + 中 高压硅胶反相 Sephadex LH-20 由葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 交联亲脂性羟丙基而制成, 它的一种特殊的纯化功能是分离甙元相同但 所带糖基数量或种类不同的分子, 糖基数量越多越早被洗 脱 即使糖基数量相同, 结构稍有不同, 也可调节流动相 将之分开 Sephadex LH-20 广泛地应用在黄酮类物质的分 离纯化中, 总括来说黄酮所含羟基数量越多, 与 Sephadex LH-20 结合越强 Q Sepharose FF 是去处植物色素的有效方法 例如葛根素, 用 Q Sepharose FF 可对粗品进行第一步 纯化, 再使用 Sephadex LH-20 进行精细纯化, 就可达到纯 度为 95% 以上的葛根素 黄酮 萘醌纯化平台 水和醇提取 + Sephadex LH 20+ 中 高压硅胶层析 近年掀起热潮的用于治疗心血管疾患及预防老人痴呆症的 银杏, 主要活性成份包括多个黄酮及内酯 槲皮素 山柰 酚及异鼠李素三个黄酮化合物, 具有扩张血管和解除痉挛 作用, 能扩张冠脉血管 增加冠脉流量, 另外还与降低血酯 改善血液流变学 降低 LPO 提高 SOD 活力有关 多酚类纯化平台 水和醇提取 + Sephadex LH 20 + 中 高压硅胶层析 Sephadex LH-20 与黄酮纯化类似, 多酚的纯化也可根据所含羟基 芳香环 双键的数量 位置, 以及与 Sephadex LH-20 介质所形成的氢键的数量 强度的不同进行分离 总括来说多酚所含羟基 芳香环数量和所形成的氢键数量越 多 越强, 结合也越强, 洗脱也较晚 ( 如各种茶多酚 白 藜芦醇的纯化 ) 内脂 萜类纯化平台 Sephadex LH 20 或中 高压硅胶层析 中草药中的内脂 萜类大都较为弱极性分子, 以传统的萃 取 结晶 加上硅胶或氧化铝层析纯化 GE Healthcare Biosciences 生产的 BioProcess 防爆防腐中 高压层析生产系统配和 Fineline 350 或 HPLC 层析柱已成功在国内外应用 于紫杉醇的大规模生产 蛋白质 活性肽 动植物毒素纯化平台 Sepharose 离子交换 ; Superdex/Sephacryl 分子筛层析 ;SOURCE RPC 反相层析 近年不断发现许多常用中药中的蛋白质 糖蛋白都具药理活 性, 如枸杞子糖蛋白 银杏花粉蛋白 芦荟糖蛋白等 天 花粉蛋白 具有溶血作用的蜂毒肽, 兴奋中枢神经的蝎毒肽, 治疗风湿性关节炎的蜂毒明肽, 抗凝血药水蛭素 蛇毒酶 大部分蛋白酶在纯化时需留意保持其空间结构, 避免失活, 所以一般采用温和的离子交换和分子筛层析, 肽分子则可 使用反相层析 图 4: 用反相 source 15RPC 精细分离河豚毒素, 除去异构体 橙皮素 山奈酚 槲皮素 图 3:Sephadex LH-20 分离银杏中结构非常相近的多个黄酮 咨询热线 : 网址 : 29

30 层析介质应用 多糖纯化平台 水 醇提取 + 穿透式 Sepharose 离子交换脱蛋白 + Superdex 200/Sephacryl 分子筛层析 中药中如灵芝多糖 香菇多糖 黄芪多糖 人参多糖 具 有增强免疫力 抗肿瘤作用 一种中药中往往含多种多糖, 结构 性质 功效不一 如黄芪水提取液经 DEAE 弱阴离子 交换层析及 Sephadex G100 分子筛层析纯化, 可获 AH-1, AH-2 及 AG-2 等多个单一组份多糖 大黄水提液经乙醇提取及 Sephadex G-200 分子筛层析获得 DHP-1,DHP-2 两个单 一组份多糖 新一代的 Superdex 200 分子筛层析介质选择 性与 Sephadex 相同, 而流速 分辩率 化学稳定性大大增加, 比往 Sephadex G 系列能分离出多数倍的多糖组分, 时间更 由以往的一天缩短到一小时 三 产品信息 产品 数量 货号 HiLoad 16/60 Superdex HiTrap SP HP 5 1 ml HiTrap SP HP 5 5 ml HiTrap Q HP 5 1 ml HiTrap Q HP 5 5 ml Q Sepharose HP 75 ml SP Sepharose 75 ml Sephadex LH g RESOURCE 15 RPC HiLoad 16/60 Superdex HiLoad 26/60 Superdex HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR 四 相关文献 1. 解红艳, 现代生命科学技术在传统中医药研究中的整体解决方案 2. 国家药典委员会主编, 中华人民共和国药典 2000 版第一部, 化学工业出版社,2000,116~114 图 5: 新一代的 Superdex 200 分子筛介质比往 Sephadex G 能分离出多数倍的多糖组分, 流速也快了数倍 3. 李凤前, 陆彬, 粉防己碱制剂研究进展, 中草药,1999,30(6) 4. 陈德昌主编, 中药化学对照品工作手册, 中国医学科技出版社, 2000,143~ 王慕邹主编, 常用中草药高效液相层析分析, 科学出版社, 1999,129~ Sephadex LH-20 制备凝胶层析分离 李凤前, 陆彬, 粉防己碱制剂研究进展, 中草药,1999,30(6) 二 TCM 的色素去除 TCM 的粗提物中常常含有大量的色素, 一方面在层析过程中, 采用紫外对目标物进行检测和追踪时, 色素会掩盖掉目标物的信号, 增加了纯化的困难程度 ; 另一方面, 随着中药要求的不断提高, 在生产过程中, 色素也成为质量控制的一个因素 阴离子交换 Q Sepharose FF 是去处植物色素的有效方法, 比如, 提取葛根素时, 大量的色素也被提取出来, 利用 Q Sepharose FF 可对粗品进行第一步纯化, 不仅大大提高了葛根素的纯度, 而且除去了绝大多数色素, 再使用 Sephadex LH-20 进行精细纯化, 就可达到纯度为 95% 以上的葛根素 另外,Q Sepharose FF 在一些注射用中药产品的生产过程中, 作为最后一步, 能够有效的去除各成分中的色素 30 咨询热线 : 网址 :

31 GE 生命科学部填料应用部 低分子肝素的纯化 简介 中国是世界最大肝素粗品出口国,2010 年占据全球市场份 额约 60%, 出口总量约 114 吨 目前临床应用的小分子肝 素产品生产工艺掌握在国外制药企业中, 而从肝素粗品制 三 达替肝素与那曲肝素的质量要求 备得到临床用药, 产品升值 10 倍以上 肝素粗品经 NaNO 2 降解以后, 低分子肝素分子量分布在 0-13KD 之间. 目前欧 盟和美国药典对于低分子肝素的分子量分布和平均分子量 有严格的限制 国内目前有采用膜分离和分子筛的方法来 控制低分子肝素的分子量分布, 但收率一般只有 20% 以下, 具生产能力有限 开发高生产能力, 高收率的低分子肝素 生产工艺, 可以有效提高国内肝素企业的出口竞争力 GE 公司在纯化方面拥有丰富的经验, 采用新一代的 Capto 基架的阴离子交换填料成功开发出纯化达替肝素和那曲肝素的新方法, 分子量分布范围符合欧洲药典的要求, 并且回收率在 60% 以上, 与传统方法相比具有操作方便快速易于放大的特点, 具有极强的使用价值 其他的低分子肝素也可参考该工艺进行纯化 一 低分子肝素的种类 达替肝素 帕肝素 依诺肝素 那曲肝素 表 1. 小分子肝素的质量要求 四 关键影响因子的 DOE 实验 采用 DOE 实验设计对 Capto 系列阴离子层析介质对低分子肝素纯化进行优化, 结果显示样品中和平衡缓冲液中的 ph, 冲洗液中的 NaCl 浓度, 洗脱液中的 NaCl 浓度以及上样量的多少都对以上工艺目标有显著的影响, 并且存在一定的交互作用 以下列举了部分影响因子对不同工艺目标的响应 二 低分子肝素的纯化流程 大分子肝素 亚硫酸钠或者双氧水降解 阴离子交换 图 2: 是每毫升填料上样 15 mg 达替肝素时 ph 和冲洗液中 NaCl 浓度对分子量小于 3000 这一工艺目标的响应曲面图 图 1: 低分子肝素的纯化流程图 乙醇沉淀 咨询热线 : 网址 : 31

32 层析介质应用 五 采用 Capto DEAE 纯化达替肝素 图 3: 在 ph 7.5 时上样量和冲洗液中的 NaCl 浓度对分子量小于 8K 的响应曲面图 上样量和 NaCl 对分子量小于 8K 的响应 图 5: 典型的 Capto DEAE 纯化图谱 如果需要了解更加详细的信息, 请联系当地的技术支持, 或拨打 免费技术支持电话 六 产品信息 图 4: 是在每毫升填料上样量 15 mg 达替肝素时样品中的 ph 以及冲洗液中的 NaCl 浓度对回收率的响应曲面图达替肝素纯化工艺的确定 产品 数量 货号 Capto DEAE 2 5 ml Capto Q 2 5 ml HiTrapCapto DEAE 5 1 ml HiTrapCapto DEAE 5 5 ml HiTrapCapto Q 5 1 ml HiTrapCapto Q 5 5 ml HiScreenCapto DEAE1X 4.7 ml 咨询热线 : 网址 :

33 GE 生命科学部填料应用部 疫苗的纯化 简介 凡具有抗原性接种于机体可产生特异的自动免疫力, 可抵御感染病的发生或流行, 总称为疫苗, 以细菌制备的制剂称为 菌苗, 病毒及立克次氏体制备的制剂称为 疫苗, 以细菌代谢产物 毒素制备的制剂称为 类毒素 酵母表达的乙肝疫苗纯化工艺 : 细胞破碎 微滤 / 超滤 一 疫苗纯化平台 甲肝疫苗 (HAV): 美国专利 (US Patent Number :Process for purifyinghepatitis A virus) 报道, 使用层析方法可以纯化甲肝疫苗 病毒液 硅胶吸附 ButylSepharose 4B/Capto Butyl 硫氰酸盐处理无菌过滤 Sepharose CL-4B(Sepharose 4 FF) 去除小分子杂质 Al(OH)3 吸附 DEAE SepharoseCL-6B (DEAE Sepharose FF) 分装制剂 图 3: 酵母表达的乙肝疫苗流程图 甲肝疫苗图 1: 甲肝疫苗纯化流程图 乙肝疫苗 (HBV): 中国是乙型肝炎的高流行区, 国家对乙肝疫苗的研发及生产很重视 1998 年停止生产血源型乙肝疫苗后, 基因工程乙肝疫苗已经成为唯一的乙肝疫苗 现有乙肝疫苗分为 CHO 及酵母两种表达系统, 均要采用层析技术纯化 CHO 细胞表达的乙肝疫苗纯化工艺 : CHO 细胞培养收液 Butyl-S-Sepharose FF 层析 DEAE Sepharose FF 两种表达系统的乙肝疫苗使用了不同的疏水层析介质, 是 纯化的关键 戊肝疫苗 (HEV): 由昆虫杆状病毒表达的戊型肝炎病毒结构区 ORF2 蛋白 的戊肝疫苗在美国 Novax 公司已经进入 III 期临床 (US Patent6,054,567) 表达的重组蛋白采用 Q Sepharose FF,SOURCE 15Q 离子交换层析及 Superdex 200 p.g. 凝胶过滤层析得到纯化的戊肝疫苗 狂犬病疫苗 (Rabies Vaccine): 由于病毒培养液体积太大, 不可能使用超离心方法, 目前 国内均使用超滤浓缩配合凝胶过滤 Sepharose 4 FF 的方式纯 化 RabiesVaccine 样品上样量控制在柱床体积 10% 以下时, 病毒的分离效果好, 蛋白去除均在 99% 以上, 使用超过百 次后, 层析的重现性依然良好 Sepharose 4 FF HbsAg Vaccine 图 2:CHO 表达的乙肝疫苗纯化流程图 咨询热线 : 网址 : 33

34 层析介质应用 流行性感冒疫苗 (Influenza Vaccine): 全病毒疫苗, 有用单纯超离心以及层析法纯化的 层析法采用 Sepharose 4 FF 凝胶, 速度快, 周期短, 分离效果好, 重复性高, 适合大规模的制备 但全病毒疫苗的接种副反应较重, 不利于大范围尤其是儿童和体弱者使用 在国际上, 以裂解疫苗和亚单位疫苗为主 2003 年 6 月 17 日,FDA 批准了第一个流感疫苗鼻腔喷剂 (MedImmune 公司 ), 更适合广大人群的使用 US Patent 描述了在重组流感病毒感染的昆虫细胞中表达多价血凝素疫苗及其层析纯化的方法 : 感染的昆虫细胞 表 1: 分子筛技术与 Capto Core700 纯化结果对比 Egg base 流感疫苗 破碎及处理 DEAE Sepharose FF Lentil LectinSepharose 4B Recombinant HA 图 4: 重组流感疫苗的纯化流程图 新一代病毒纯化介质 Capto Core 700 是粒径 85 um 的高流速琼脂糖微球, 具有 5 um 的惰性外壳, 不带配基, 在微球里面带有对蛋白等杂质有很强吸附能力的辛氨基 分子量大于 700 k 的物质都不能进入到微球内, 从流穿走, 小分子被捕捉除去 Capto Core 对病毒不吸附, 从而保护一些敏感的病毒的活性 具有分子筛和离子交换流穿模式的综合优点, 能高效的纯化病毒, 可以有效的去除卵清蛋白 宿主蛋白和 DNA 片段 图 5:HA 回收率超过 90%, 卵清蛋白去除低于检出线 Cell base 流感疫苗 图 6: 两步纯化将流感病毒中宿主蛋白,DNA 有效去除,HA 的回收率达到 90% 以上 髓灰质炎疫苗 (Polio Vaccine): 脊髓灰质炎疫苗是最早将层析技术用于生产的病毒性疫苗, 1979 年就有文献报道 有感染活性的 polivirus (A_from) pi 为 7.0,DNA 的 pi 是 在中性缓冲溶液中, 病毒净 电荷为零, 而 DNA 带有极强的负电荷易吸附到阴离子交换 介质上, 通过高盐 DNA 才被洗脱下来 因此用阴离子交换 技术纯化病毒, 细胞基质 DNA 及大部分杂蛋白均已清除, 得到纯化的 polivirus 疫苗 34 咨询热线 : 网址 :

35 GE 生命科学部填料应用部 流行性乙型脑炎疫苗 (JEV): 乙脑病毒的分子量在 400 万以上, 与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大, 采用凝胶过滤层析可以纯化出符合要求的乙脑病毒疫苗, 根据阴离子交换层析对 DNA 去除具有很好的效果, 因此跟在分子筛后面进一步去除残留的宿主 DNA VLP 的分子量往往高于 2000KDa,Sephacryl S-500 High Resolution (HR) 的凝胶过滤适合 VLP 组分的分离和分析, Sephacryl S-500 High Resolution 分离的分子量范围在 和 之间 获取病毒分子筛 S-500 Capto Q 图 7: 乙脑的纯化流程 森林脑炎疫苗 (FEV): 森林脑炎病毒是一种以蝉类为主要传染源的自然疫源性疾病, 病死率高达 20%-30% 急性期症状消失后, 常遗留麻痹性后遗症 目前生产的疫苗属粗制疫苗, 其抗原含量低, 杂蛋白多 ; 且存在亚细胞成分等致敏性物质, 致使疫苗注射剂量大, 副反应增多或加重 为彻底解决这一问题, 研制森林脑炎纯化疫苗是唯一可行的出路 浓缩的森林脑炎疫苗通过 Sepharose 4 FF 层析, 结果显示纯化疫苗去除了绝大部分牛血清蛋白和杂蛋白以及易致敏的地鼠肾细胞的亚细胞成分, 使其应用更安全, 可靠, 是现有疫苗理想的换代产品 类病毒颗粒 (Virus like particles): 使用灭活或减毒的病毒作为疫苗, 具有一定的感染几率 ; 另一种预防策略是注射缺失核酸组份但仍含有病毒蛋白的病毒片段, 也许还有脂双分子层 这些结构被称为类病毒颗粒或 VLP VLP 能够诱导强烈的免疫反应, 但它们无法复制 因此, 通过使用 VLP 就没有感染的风险 此外,VLP 不需要高度免疫原性的佐剂 这使得 VLP 非常有希望作为应用在生物制药上 VLP 可以通过基因重组技术生产 已经有两种基于 VLP 的疫苗已经得到 FDA 的批准 收获 Capto Q 二 订货信息 产品数量货号 SepharoseCL- 4B 1 L Sepharose 4 Fast Flow 1 L DEAE SepharoseCL- 6B 1 L DEAE Sepharose Fast Flow 500 ml Butyl Sepharose 4B 500 ml Butyl-S-Sepharose FF 200 ml Superdex 200 p.g 150 ml SOURCE 15Q 50 ml Q Sepharose Fast Flow 300 ml LentilLectinSepharose 4B 25 ml SepharoseCL - 6B 1 L Sephacryl S-500 HR 750 ml HiTrapCapto Core ml HiScreenCapto Core ml 三 参考文献 1. Belew, M. et al. Purification of recombinant hepatitia B Surface antigenproduced by transformed Chinese hamster ovary (CHO) cell line grown inculture Bioseparation 1, (1991). 2. Purification of influenza A/H1N1 using Capto Core AA 3. Jendrek, S. and Ekstrom, D. et al. Development of a production and purification method for type 5 adenovirus. BioProcessing Journal 4, 42-47(2005). 4. Blanche, F. et al. An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenoviral particles. Gene Ther. 7, (2000). 5. Purification human influenza virus vaccine - towards a generic strategy. Downstream 37, (2004) Code No 缓冲液置换和使用超滤 / 渗滤浓缩 病毒灭活 图 8: 类病毒颗粒的纯化流程 Sephacryl S-500 凝胶过滤 咨询热线 : 网址 : 35

36 层析介质应用 寡核苷酸的纯化 简介 寡合苷酸广泛的用于基础研究或者诊断试剂, 同时也应用 于基因治疗上 虽然寡核苷酸的治疗还在起步阶段, 但是 已经有直接的证据显示反义核苷酸药物存在巨大的潜力 反义核酸 (antisense oilgonucleotide) 是基因治疗的一种 方法, 其原理是利用碱基配对规则, 对相关基因调控 反 义核酸可利用 AKTA 规模 DNA 合成仪进行合成,AKTA Oligo pilot 10/100 的合成规模为 1-50 umol /50 umol-4 mmol 寡核苷酸的纯化采用一步阴离子交换层析 Source 15 /30Q 进 行, 对比于传统的反向层析, 具有更高的载量, 收率和纯度, 并且易于放大生产 BUFFERA: 50mMammoniumbicarbonate BUFFERB: 90% 甲醇,50mMammoniumbicarbonate 流速 : 300cm/h 一 寡核苷酸的纯化平台 样品 : DNA 20-mer, ATA CCA ATT AAA CAA AAT TT 上样量 : 0.1 mg/ml medium 柱子 : RESOURCE Q 1 ml Buffer A: 10 mm NaOH, ph 12 Buffer B: 10 mm NaOH, ph 12, with 1.5 M NaCl 流速 : 300 cm/h 梯度 : M in 30 column volumes 检测波长 : UV absorption at 254 nm, 5 mm cell 纯化时间 : 25 min 图 2: 三苯甲基化 37 个碱基的 RNA 用 source RPC 进行纯化 二 产品信息 产品 数量 货号 Source 15 Q 50 ml Source 30 Q 50 ml RESOURCE Q 1 ml RESOURCE Q 6 ml RESOURCE 15 RPC 1 ml 三 参考文献 图 1: 去三苯甲基化的 20 个碱基 DNA 用 RESOURCE Q 1 ml 纯化 1. Pilot scale purification ofsynthetic DNAoligonucleotides Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2003:1 (2003) Pharmacol Rev 52: , Gene Therapy, (1999) 6: Gene Therapy, (2005) 12, S5 S Molecular Therapy, (2002) Vol 6, No BioTechniques 34: (May 2003). 8. Oligonucleotide purification by ion exchange chromatography. GE Healthcare Application notes. 36 咨询热线 : 网址 :

37 GE 生命科学部填料应用部 质粒 DNA 的纯化 简介 质粒 DNA(pDNA), 又称基因疫苗, 或者核酸疫苗, 是指将编码某种抗原的外源基因与质粒载体重组, 构建出真核表达载体, 通过肌肉注射等途径直接导入动物细胞, 能利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白, 并诱导宿主细胞产生对该抗原的体液和细胞免疫应用, 以达到预防和治疗疾病的目的 DNA 疫苗比病毒类疫苗安全, 但是因为药物使用量大, 一般 100 ug-1 mg, 因此对药物的质量是要求很很高 第一步 : 高盐下,RNA 会积聚, 与质粒 DNA 的分子量上的 差别更加显著, 利用分子筛进行组份分离 同时去除残余的 染色体 DNA, 这步是分子筛的组分分离, 上样量达到 30% CV, 而且流速较快 Sample: Clarified alkaline lysate Sample load: 0.3 CV Column: HiPrep 26/10 Sepharose 6 FF, 53 ml Buffer: Buffer A: 2.1 M (NH4)2SO4, 10 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph 7.5 一 超螺旋 DNA 的制备步骤如下 用于基因治疗, 质粒 DNA 必须为超螺旋结构并且不含细菌染色体 DNA,RNA, 蛋白质和内毒素 另外, 纯化所用介质和工艺应便于顺利并节省成本地转化成大规模生产 由于绝大多数质粒 DNA 生产所选用的宿主菌是大肠杆菌, 纯化的实际问题就是去除其它核酸, 内毒素和痕量污染物 图 2: 用 sepharose 6 FF 将 RNA 与 DNA 分离 第二步 :PlasmidSelect Xtra 亲和介质, 利用了嗜硫亲和与 疏水作用原理, 能特异性将开环的质粒 (ocdna) 和超螺旋的 质粒 (scdna) 分开, 并且载量可以达到 2 mg/ml 介质 从而 超螺旋 DNA 的纯度提高到 95% 以上 Sample: Plasmid DNA after group separation Sample load: 2 mg/ml gel Column: HiTrap PlasmidSelect Xtra, 5 ml Binding buffer: Buffer B: 2.0 M (NH4)2SO4, 10 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph 7.5 Elution buffer: Buffer C: 0.3 M NaCl, 1.7 M (NH4)2SO4,10 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph 7.5 图 1: 超螺旋 DNA 的纯化流程图 图 3: 用 plasmidselect Xtra 将开环的 DNA 与 CCDNA 分开 咨询热线 : 网址 : 37

38 层析介质应用 第三步 : 超螺旋 DNA 的精细纯化,source 30Q 去除残余的 RNA 和内毒素, 同时浓缩样品 Sample: Supercoiled plasmid DNA from PlasmidSelect Xtra (diluted 1 part sample to 2 parts H2O) Sample load: 1 mg/ml Column: HiTrap SOURCE 30Q, 5 ml Binding buffer: Buffer D: 0.4 M NaCl, 10 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph 7.5 Elution buffer: Buffer E: 1.0 M NaCl, 10 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph 7.5 三 产品信息 产品 数量 货号 PlasmidSelect Xtra Starter Kit 1 pack PlasmidSelect Xtra Screening Kit 1 pack PlasmidSelect Xtra 25 ml SOURCE 30Q 50 ml Sepharose 6 Fast Flow 1L Mini Q 4.6/50 PE 四 相关文献 1. Sambrook, J. and Russel, D. W. Molecular cloning. A laboratory manual.,coldspring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001). 图 4:SOURCE 30Q 精细纯化 pdna HPLC 检测质粒纯度, 使用 Mini Q 用于质粒 DNA 的纯度检测 2. Carnes A. E., et. al. Inducible E. coli fermentation for increased plasmid DNA production. Biotechnol. Appl. Biochem. Immediate Publication, doi: /ba (2006). 3. Application Note: PlasmidSelect Xtra for downstream processing of supercoiled plasmid DNA Application Note: Fast determination of plasmid DNA quantity and quality in complex solutions Data File: Sepharose 6 Fast Flow Data File: SOURCE 30Q Selection Handbook: Hollow fiber cartridges and systems for membrane separations Data File AA Plasmid purification media 表 1:pDNA 的质控标准和检测结果 1 Marker 2 细胞裂解液 3 第一步纯化后收集 DNA 4,5 第二步纯化后开环 DNA 与超螺旋 DNA 图 5: 溴化啶染色 0.8% 浓度琼脂糖凝胶指示不同纯化步骤之后所获得的组分的纯度 38 咨询热线 : 网址 :

39 GE 生命科学部填料应用部 病毒载体的纯化 简介 基因治疗是指用正常或野生的基因矫正或置换致病基因的治疗方法 基因治疗需要利用载体将起治疗作用的基因导入靶细胞使其与宿主染色体整合为一体或在宿主细胞中表达, 从而起到治疗的作用 基因治疗载体中常用的病毒载体有逆转录病毒载体, 腺病毒载体 AdV, 腺相关病毒载体 AAV, 慢病毒载体和单纯疱疹病毒载体等 一 腺病毒 AdV 纯化 腺病毒是一个 20 面体的无包膜双链 DNA 病毒, 直径 nm, 含有 14 种蛋白, 它用于基因治疗是基于它的几个优良特征 : 在培养液中很容易生产 ; 能感染各种细胞型 ; 腺病 毒基因整合进宿主细胞染色体的危险小 ; 容易对其进行基 因水平操作和制备突变体或删除病毒 ; 病毒粒子非常稳定 不易被破坏 图 2:Q Sepharose XL virus licensed 离子交换介质纯化腺病毒的层析图 Q Sepharose XL 是在琼脂糖骨架表面增加了葡聚糖链的柔软的手臂, 增加了大分子特别是病毒的接触有效面积, 能快 速纯化病毒, 同时能放大生产 二 腺相关病毒 AAV 纯化 腺病毒相关病毒是很小的单链 DNA 病毒, 属细小病毒科 有六种人血清型, 全都是非致病性的病毒, 这些病毒能够用 于基因治疗的优势是目的基因能够持续在宿主细胞内表达, 减少了需重复使用的试剂量 GE 最新开发了一种用于纯化腺相关病毒的亲和介质 AVB Sepharos High Performance, 能快速一步纯化腺相关病毒的许多亚类 具体信息可以通过 hotline: 进行咨询 图 1: 腺病毒 Ad5 的下游纯化工艺 咨询热线 : 网址 : 39

40 层析介质应用 三 反转录病毒纯化反转录病毒颗粒为球形, 直径约为 100 nm, 含有两条单链的 RNA, 长度在 8-11 kd 之间, 氯化铯超速离心的密度为 g/cm 3 之间 目前纯化反转录病毒颗粒的方法有 : 中空纤维滤膜 (100 KD) 超滤 图 5: 反转录病毒的纯化 分子筛层析 Sepharose 4 Fast Flow 四 慢病毒纯化 图 3: 层析纯化腺病毒相关病毒, 血清型 2 和血清型 5 工艺流程 慢病毒载体是来源于人类免疫缺陷病毒 -1 (HIV-1) 的一种病毒载体, 对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力 目前重组慢病毒被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中 重组慢病毒载体的包装难度较大, 因此其滴度较难提高 常用的方法有超速离心沉淀法和 PEG-8000 浓缩法, 获得的病毒滴度不高 利用阴离子交换层析的方法, 可提高病毒的滴度, (7) 并且显著提高转染效率 细胞培养病毒液澄清 Q HP 脱盐 图 6: 慢病毒纯化工艺 图 4:SP Sepharose HP 纯化 AAV-2 病毒 图 7: 利用强阴离子层析柱 HiTrap Q,HP 纯化重组慢病毒病毒 40 咨询热线 : 网址 :

41 GE 生命科学部填料应用部 五 订货信息 产品 数量 货号 Source 15 Q 50 ml Q Sepharose XL 300 ml SP Sepharose HP 75 ml Sepharose 4 FF 1 L HiTrap Q, HP 5 5 ml AVB SepharoseHP 75 ml HiTrap AVB 预装柱 5 1 ml HiTrap AVB 预装柱 1 5 ml HitrapDesalting 5 5 ml 六 参考文献 1. Affinity Chromatography Handbook Affinity Columns and Media, Selection Guide Herzer, S. Process design and scale-up of viral vector gene therapyproducts: New purification challenges. Cell & Gene Therapy 1, (2004). 4. Jendrek, S. and Ekstrom, D. et al. Development of a production and purification method for type 5 adenovirus. BioProcessing Journal 4, 42-47(2005). 5. Blanche, F. et al. An improved anion-exchange HPLC method for thedetection and purification of adenoviral particles. Gene Ther. 7, (2000) Brument, N. et al.a versatile and scalable two-step ionexchangechromatography process for purification of recombinant adenoassociatedvirus serotypes-2 and -5. Molecular Therapy (2002). 7. Herzer, S. et al. Key issues in the process development of purificationprocedures for viral vector and plasmid biopharmaceuticals. BioProcessingJournal 4, (2005). 8. Pharmacol Rev 52: , Gene Therapy, (2005) 12, S5 S Molecular Therapy, (2002) Vol 6, No.5. 咨询热线 : 网址 : 41

42 层析介质应用 流脑多糖的纯化 简介 流脑球菌的荚膜多糖是引起免疫反应的主要抗原物质 现 行的 C W Y 群流脑疫苗均是提取菌体的荚膜多糖作 为抗原制备的, 在提取多糖的同时需要尽可能多地去除菌 体的蛋白, 以减少疫苗的负反应, 现行的疫苗制造工艺均 采用十六烷基三甲基溴化铵沉淀多糖, 加入乙醇沉淀去除 核酸以及回收多糖, 得到粗制多糖 粗制多糖溶解后加入 苯酚使蛋白变性析出, 根据粗制多糖中含有的蛋白的情况, 此步骤通常需要重复一至三次 苯酚具有很强的毒性给生 产操作者的健康带来威胁, 对环境具有严重危害, 其残留 也影响制品的质量, 并且苯酚抽提的方法也不适合大规模 工业化生产操作 GE 公司开发用层析的方法分离多糖与蛋白, 避免使用苯酚, 得到精糖的蛋白含量小于 1%, 核酸等杂质合格, 多糖回收率大于 65%, 这一工艺的开发造福社会同时为用户带来安全高效的纯化方案 一 多糖纯化工艺介绍 将粗糖通过 Capto adhere 和 Capto DEAE 两种层析介质串联, 流传模式进行分离纯化的 Capto 骨架的填料具有很好的刚性能和载量对于多糖这样大分子的物质任然有很好的通量 Adhere 是复合模式的配基与弱阴离子交换的 DEAE 通过色谱图 206 nm 和 A280 nm 吸收可以看出通过层析纯化可以将多糖与蛋白完全分开, 达到多糖与蛋白核酸的分离作用, 对多糖起到纯化效果 图 2: 层析纯化流脑多糖的层析图 IEX 脱盐多糖总收乙酰基浓度多糖浓度 DNA 蛋白的收的收类型率 % (mmol/g) (ug/ml) % 含量率 % 率 % A (2.0) BDL C (1.5) BDL Y 72 80* 58* 0.82(0.3) BDL W (0.3) BDL 表 1: 流脑多糖层析后主要指标检测结果 BDL: 低于检测线 粗糖 A,C,W,Y 溶解加入 SDC Capto adhere 与 Capto DEAE 流穿模式 G-25 脱盐 二 产品信息 产品 数量 货号 Capto DEAE 25 ml Capto adhere 25 ml HiTrap Desalting 5 5 ml HiPrep 26/10 Desalting 1 53 ml 制剂 图 1: 粗糖纯化的流程 三 参考文献 1. Handbook: Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing: Principles and Methods; 2. Instructions AA Multimodal media; 3. Data file Capto adhere 咨询热线 : 网址 :

43 GE 生命科学部填料应用部 层析法纯化血浆蛋白 简介 血液制品主要指以健康人血液为原料采用生物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂 目前, 国内常用的制备方法有 Cohn 氏低温乙醇沉淀法, 离心法及压滤法, 层析法等 其中, 应用最多的是 40 年代发展起来的 Cohn 法以及改良法 随着国内生产能力的相对过剩, 市场竞争日趋激烈的现状, 各厂家急需改进生产工艺增加收率, 改进产品质量, 提高综合利用水平, 开发新产品从而降低生产成本在市场竞争中立于不败之地 在国际上, 随着血浆产品多元化的发展, 对产品纯度质量的要求越来越高 目前, 国外大多数血浆纯化厂家均有利用层析技术生产不同产品 从生产经济学角度来看, 规模产量速度和重复性是生产工艺生存适应的基本组合 GE Healthcare life science 积累几十年层析技术研发的经验, 专门为从中试生产到数千升以上规模的大生产车间提供稳定的高效率层析分离纯化设备和介质 一 血浆蛋白的纯化平台血浆的综合利用 (9 个产品 ) IgM 和 IgA, 达到 90% 以上的回收率, 载量 400g/l 总收率达到 60% 以上, 质量达到欧美标准 图 2:FII+III 沉淀层析法制备 IVIG FII+III 沉淀溶解 辛酸盐沉淀 板框过滤 强阴离子 Capto Q 大孔阴离子 Macrocap Q 超滤制剂 IVIG 凝血因子八 (FVIII) A 型血友病病人需要通过定期输入血浆来源八因或重组人八因子进行治疗 Capto Q XP 是大孔的强阴离子交换填料, 具有亲水性的骨架, 有助于保持八因子的活性, 改善了 MarcroCap Q 的不耐压的缺点, 具有很好的机械强度, 非常适合工业化生产 新鲜冰冻血浆 低温连续离心 Al(OH)3 处理 S/D 处理 图 1. GE 的血浆综合利用平台 静脉注射丙种球蛋白 (IVIG) 冷沉淀组分 I+II+III 沉淀溶解后使用辛酸病毒灭活, 板框深滤, 通过两步串联离子交换柱吸附杂蛋白 第一步通过 Capto Q 达到 95% 以上的回收率, 同时载量达到 400g/l, 第二步用超大孔的阴离子交换 MarcoCap Q 凝胶, 用于吸附残留的 图 3: 层析法制备凝血八因子 Capto Q XP FVIII-vWF 咨询热线 : 网址 : 43

44 层析介质应用 传统工艺 GE 工艺 冷沉淀上清 终产品的活性 15 IU/mg protein >50 IU/mg protein 回收率 (IU /L 血浆 ) FVIII:vWF 比例不确定可以控制 操作环境离心, 苛刻温和的结合与洗脱条件 病毒去除需要专门的步骤与 SD 结合灭活病毒 表 1:FVIII 新旧工艺对比 重组人凝血因子八 (rhfviii) VIIISelect 亲和层析显著简化了重组八因子的生产工艺, 可 以高载量实现八因子的快速高纯度捕获, 达到 IU/ml 载量, 将亲和层析和离子交换 / 分子筛等技术相结合, 进一 步提高产品纯度, 有效去除 HCP,DNA 等杂质 CHO 细胞表达 Capto Heparin(HeparinSepharose FF) 超滤 / 微滤 60 C 10 小时去除热变性蛋白 Capto Q 病毒灭活超滤 / 微滤 切向流澄清 图 5:ATIII 层析纯化工艺 ATIII VIIISelect 亲和阴离子交换 (Capto Q) 凝胶过滤疏水层析 (butyl sepharose) 图 4: 重组 FVIII 的工艺流程 PCC 凝血酶原复合物 PCC 凝血酶原复合物原有的工艺是两步 DEAE Sephadex A-50, 现将第二步改换成高流速 Capto DEAE 填料, 便于装填工业规模层析柱, 可自动化操作, 提高生产效率回收率, 并实现过程的尽量可控 冷沉淀上清 DEAE Sephadex A-50 抗凝血酶 III (ATIII) ATIII 被用于治疗先天性或后天性 ATIII 缺乏症患者 目前普遍采用肝素亲和的方法进行纯化,Capto Heparin 是 GE 专 为工业生产设计的最新的高动态载量的肝素亲和胶, 不仅 能一步得到高纯度的 ATIII, 同时保持高的载量, 并且能耐受 0.1 M NaOH 的清洗, 大大提高介质的寿命 图 6:PCC 层析纯化工艺 凝血九因子 FIX S/D 处理 Capto DEAE 缺乏 FIX 的乙型血友病病人需长期输注凝血酶原复合物作治疗, 但是该复合物中的一些致血栓性物质可能引起广泛性静脉血栓 因此, 不含其他凝血因子如 FII FVII 和 FX 的高纯度 FIX 成品需求尤为迫切 层析技术使生产高纯度 FIX 的浓缩产品变为可行, 新介质 Capto Heparin 填料的应用可以加快纯化的速度及下游处理能力 44 咨询热线 : 网址 :

45 GE 生命科学部填料应用部 冷沉淀上清 F IV1-4 DEAE Sephadex A-50 PEG 沉淀蛋白 S/D 处理 S/D 灭活 DEAE Sepharose FF Capto DEAE(DEAE FF) Capto Heparin Capto S 高纯 FIX(>100 IU/mg) а1-at 图 7:FIX 层析纯化工艺 а2- 巨球蛋白 (а2-macroglobulin) а2 - 巨球蛋白有与多种酶结合并抑制其酶活性的作用, 能增 强骨髓产生白细胞的能力 а2 巨球蛋白制剂多用于防治放 射性损伤, 对放射治疗引起的溃疡病人有促进伤口愈合功 能 图 8:а2 巨球蛋白工艺流程 Cohn IV 沉淀 PEG 沉淀 Sephacryl S-300 S/D 处理 Sephacryl S-300 а2- 巨球蛋白 а1- 抗胰蛋白酶 (а1-antitrypsin) а1 - 抗胰蛋白酶是机体内的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂, 它的 主要作用是能抑制和清除弹性蛋白 酶而这种弹性蛋白酶 可以破坏结缔组织的弹性蛋白, 特别是在肺组织实质内 а1- AT 制剂主要用于 а1-at 抗胰蛋白酶缺乏合并肺气肿和脂膜溃疡病人的治疗 AAT 的纯化流程如下 图 9:а1-AT 的工艺流程 白蛋白 自安发玛西亚生物技术公司从 1977 年成功开发出全层析技 术生产白蛋白八因子及免疫球蛋白的工艺以来此方法已经 在世界范围的许多国家和地区得到运用 在马其顿王国 504 批 20 年的层析法白蛋白的生产和临床应用证明层析技术的 可靠性及安全性 此层析技术同时更广泛的应用到各血液 制品生产厂家与 Cohn 法结合在 IVIG 白蛋白生产去除热源等 方面大量使用 全层析法白蛋白具体工艺如下 : 新鲜冰冻血浆 Sephadex G-25 脱盐 优球蛋白沉淀 DEAE Sepharose FF CM Sepharose FF C 热处理 Sephacryl S C 10 小时 白蛋白 图 10: 白蛋白的工艺流程 咨询热线 : 网址 : 45

46 层析介质应用 纤维蛋白原 Fibrinogen 纤维蛋白原是一种多功能血浆球蛋白, 在肝脏合成, 其主 要功能是作为凝血因子 I 直接参与体能凝血过程 工艺流 程包括组分一溶解,S/D 灭活病毒, 用层析 MacroCap Q 纯 化, 上样 BufferA:20 mm PB,20 mm Gly, ph , 洗脱 BufferB:buffer A+2 M NaCl 经浓缩后可以冻干纤维蛋白原得到产品 组分 I 沉淀 溶解沉淀 S/D 病毒灭活 F IV1-4 PEG 沉淀蛋白 S/D 灭活 Capto DEAE Capto phenyl C1 inhibitor 图 13:C1 Inhibitor 工艺流程 图 11: 纤维蛋白原纯化的工艺流程 纤维结合蛋白 Fibronectin Fn 是存在于细胞表面和血浆中的高分子糖蛋白 Fn 在治疗疱疹性角膜炎所致的角膜溃疡, 疱疹及外伤性角膜糜烂, 糖 尿病患者晶状体摘除后角膜上皮损伤等角膜病有显著疗效 采用 Gelatin Sepharose,Heparin Sepharose 亲和层析法可 以从血浆或冷沉淀中提取纯化 Fn 当然还需要加入病毒灭活 步骤 离子交换层析 (MacroCap Q) 超滤 & 制剂 冻干 血浆或冷沉淀 Gelatin Sepharose Heparin Sepharose FF 二 订货信息 产品 数量 货号 Capto Q 100 ml MacroCap Q 500 ml Capto Heparin 200 ml Heparin Sepharose 6 FF 250 ml DEAE Sepharose FF 500 ml DEAE Sephadex A g Sephacryl S-200 HR 750 ml Sepharose Fast Flow 1 L SP Sepharose FF 300 ml Sephacryl300 HR 750 ml Gelatin Sepharose 1 L VIIISelect 500 ml Q Sepharose Fast Flow 300 ml CM Sepharose FF 500 ml Capto S 100 ml Butyl Sepharose 4 FF 200 ml Sephadex G-25 Medium 100 g 纤维结合蛋白 (Fn) 图 12: 纤维结合蛋白纯化的工艺流程 C1 Inhibitor C1 是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一, 在调节补体系统 凝血系统 激肽系统 纤溶系统活性方面有非常重要的作用 血浆中 30-50% 的 C1 存在于 Frac IV, 可与 AAT 同时综合利 用 临床应用领域,C1 是治疗遗传性血管神经性水肿 (HAE) 或获得性血管神经性水肿 (AAE) 的特效药 三 参考文献 1. Justin T. McCue*, Keith Selvitelli, Joshua Walker. Application of a novel affinity adsorbent for the capture and purification of 2. recombinant Factor VIII compounds. Journal of Chromatography A, 1216 (2009) US patent Anna-Lisa Smeds, Sollentuna. Process for purification of factor VIII. 46 咨询热线 : 网址 :

47 GE 生命科学部填料应用部 PEG 修饰蛋白的纯化 简介 用 PEG 蛋白药物可以解决许多蛋白药物面临的半衰期过短的问题 PEG 化改善了蛋白的药理学性质, 大多数情况下使得它们在临床上更有效 这一技术在过去 20 年中发展很快, 使得 PEG 化成为修饰蛋白质和多肽药物的一个方法 经过采用化学方法聚乙二醇修饰蛋白及多肽药物后, 使得原来的纯品蛋白变成了含有 oligo-,mono-,non-peg 蛋白的混合物, 我们还需要将均一的 PEG - 蛋白纯化出来 1 多点修饰 2 单修修饰 3 没有修饰 MacroCap SP 和 MacroCap Q 设计分离 PEG 化蛋白和其他大分子 它们的基架是由丙烯基葡聚糖交联氮氮亚甲基丙烯酰 胺构成, 具有较大的孔径, 平均粒径为 50 微米 它们可以 在高的载量的条件下分离 mono-peg,oligo-peg 和 non-peg 蛋白 在保持较高载量的同时能一步将修饰后各种杂质去 除 高分辨率的凝胶过滤填料 Superdex 75 Superdex 200 常用于精细纯化和鉴定 PEG 化蛋白 一 PEG 化蛋白纯化的通用工艺 发酵细胞收集捕获 精细纯化中度纯化病毒清除 纯蛋白 PEG 化学修饰 PEG 蛋白的纯化 图 1:PEG 化蛋白通用纯化工艺 PEG-Cytochrome C 的纯化 MacroCap SP 对于 monopeg 细胞色素 c 的动态载量达到 3.8 mg/ml, 通过凝胶过滤 superdex 200 5/150 GL 的分析, monopeg 化蛋白的回收率达到 99%, 纯度达到 93% 柱子 : Tricorn 5/100 装填 MacroCap SP 样品 : Cytochrome C modified with Mr PEG 上样 : 6 mg total protein per ml medium Buffer A: 0.02 M sodium phosphate, ph 6.8 Buffer B: Buffer A M sodium chloride 图 2:A) 用 MacroCap SP 分离 PEG 修饰的细胞色素 C;B) 用 superdex 200 分析多修饰, 单修饰和为修饰的蛋白 PEG-BSA 的纯化 用 MacroCap Q 一步纯化 PEG-BSA, 将它与 non-peg-bsa 和 反应副产物进行分离, 纯度达到 95%, 回收率达到 85%, 载量 1 mg/ml 柱子 : Tricorn 5/100 装填 MacroCap Q 样品 : 用 Mr PEG 修饰 BSA 上样量 : 1 mg total protein per ml medium Buffer A: 20 mm phosphate buffer, ph 7.0 Buffer B: Buffer A mm NaCl, ph 7.0 咨询热线 : 网址 : 47

48 层析介质应用 柱子 : Tricorn 5/100 packed with 2 ml of MacroCap SP 样品 : PEG40 avidin protein mixture,15 mg of protein/ml medium Buffer A: 0.05 M sodium acetate, ph 5 Buffer B: 0.05 M sodium acetate, 0.6 M sodium chloride, ph 5 流速 : 0.2 ml/min 梯度 : 25 80% buffer B over 12 CV; 100% buffer B over 3 CV 图 4: 用 MacroCap SP 纯化 monopeg - 抗生物素蛋白 A) 在 14 ms/cm 时, mono-peg 抗生物素蛋白回收率达到 99%, 但纯度只有 89% B) 而在 20 ms/cm 时上样,mono-PEG 抗生物素蛋白纯度达到 99%, 但回收率只有 77% PEG-rhG-CSF 纯化 : 图 3:A) 用 MacroCapQ 分离 PEG-BSA;B) 用 superdex200 检测 PEG 化蛋白, 非 PEG 化蛋白和 PEG 衍生产物 Mono-PEG-avidin 蛋白的纯化条件优化 : Mono-PEG 蛋白显示对离子交换介质更强的结合能力, 因此调整上样时的电导使 oligo-peg 蛋白不能结合到柱子上而穿 透 PEG 修饰后的混合物, 未修饰产物 多修饰产物和单修饰产物在表面单核效应上存在差异, 利用这一特点可以用例子 交换层析将其各成分分离开 方法一 柱子 : Tricorn 5/100 packed with 2 ml of Source 30S 样品 : PEG-rhG-CSF,10 mg of protein/ml medium Buffer A: 0.02 M sodium acetate, ph 4.0 Buffer B: 0.02 M sodium acetate, 0.5 M sodium chloride, ph 4.0 梯度 : 20% B,6 CV 柱子 : Tricorn 5/100 packed with 2 ml of MacroCap SP 样品 : PEG40 avidin protein mixture,15 mg of protein/ml medium Buffer A: 0.05 M sodium acetate, ph 5 Buffer B: 0.05 M sodium acetate ph 5, 0.6 M sodium chloride 流速 : 0.2 ml/min 梯度 : 15 80% buffer B over 15 CV; 100% buffer B over 3 CV 图 5: 单修饰的 PEG-rhG-CSF 在 20% 梯度洗脱下被洗脱下来 48 咨询热线 : 网址 :

49 GE 生命科学部填料应用部 三 产品信息 产品 数量 货号 HiLoad 16/60 Superdex / HiLoad 26/60 Superdex75 16/ MacroCap SP 25 ml MacroCap Q 25 ml HiTrap MacroCap SP 5 5 ml Tricorn 10/100 column XK 16/20 column 图 6:20% 梯度洗脱的单修饰 PEG-rhG-CSF 经 SDS-PAGE 电泳显示该峰为单条带, 收率达到 50% 以上 方法二 柱子 : XK50/30 of Macrocap SP, 380 ml 样品 : PEG-rhG-CSF,300 ml of protein/ml medium Buffer A: 0.03 sodium acetate, ph Buffer B: 0.03 sodium acetate, ph 梯度 : 100% A-100% B,20 CV 一步离子交换层析使 PEG-rhG-CSF 的纯度达到提高大于 99.5%, 比活性大于 IU/mg 二 如何筛选 MacroCap SP 纯化条件 PEG 在水中不带电荷, 是相同分子量球蛋白的体积的六倍以上 PEG 趋向在蛋白表面定位, 因此对蛋白的电荷有屏蔽作用, 对离子交换填料的吸附变弱 吸附采用的缓冲液盐浓度是 5 mm 而不是 50 mm, 离 心的吸附强弱顺序是天然蛋白 > 单点 PEGylated > 多点 PEGylated 蛋白 在赖氨酸位点进行 PEG 化的, 会使蛋白的等电点减少 1 ph 因此在用低盐结合以外还需要更低的 ph( 大约低于常规条件 1-2 ph) 进行吸附 Tricorn 10 Coarse Filter kit Tricorn Packing Equipment 10/ 四 参考文献 1. Instruction AB MacroCap SP. 2. 聚乙二醇化药物及其研究中的产品应用 3. Purification of PEGylated Proteins and other Large Molecules. 4. Data File MacroCap SP. 5. Fee, C. J. and Van Alstine, J. M. PEG-proteins: Reaction engineering and separation issues. Chem. Eng. Sci. 61, (2006). 6. Application Note AA. 7. Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing: Principles and Methods James Seely et al., Biopharm Int l, March, 2005, pp Harris and Zalipsky, ACS Symp. Series Vol. 680, Fee and Van Alstine, Chem. Eng. Sci. 61 (06), 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子的制备及分离纯化方法 ; 12. 聚乙二醇单修饰的重组人集落刺激因子赖氨酸缺陷体 起始流速 100 cm/h 保留时间 6 min 进行调整到最佳状态, 用线性梯度盐浓度从 5 到 500 mm 进行全面洗脱 咨询热线 : 网址 : 49

50 层析介质应用 细胞色素 C 的纯化 简介 细胞色素 C(Cytochrome C,Cyt C), 又称细胞色素丙, 细 胞色素 C 是一种以铁卟啉为辅基的呼吸酶 是细胞呼吸激活 剂, 属于络合蛋白质 由多肽与血色素络合而成 血色素是 铁的衍生物, 具氧化还原的可逆性, 从而导致细胞色素 α 能 在生理氧化反应过程中表现出电子传导, 即 Fe2+ Fe3+ 的效能 细胞色素 C 在医药上用于各种组织缺氧的急救或 辅助治疗, 如一氧化碳中毒 催眠药中毒 新生儿窒息 中 毒性心肌损害, 对抗癌药物所引起的白血球的降低, 四肢 循环障碍, 神经麻痹症, 肝病, 肾炎也有改善作用 从 2006 到 2010 年, 市场对细胞色素 C 的需求量连续 5 年保持两位 数的增长, 而供应量也进行了相应的增加, 达到每年 20% 左右的增幅, 各个厂家的利润也相应增长 制造高品质的 产品无疑可以在众多厂家竞争中立于不败之地 GE 公司在蛋白纯化方面有数十年的经验, 把层析这种高分辨率的方法与现代生化药物提高质量的要求结合起来, 开 发出细胞色素 C 的纯化方法, 具有高回收率高纯度, 易于 放大, 易于自动化控制等特点, 为生化药厂的技术革新带 来完整的解决方案 系统 : AKTApurifier 10 柱子 : Tricorn 5/100 样品 : 马心提取物 纯度 : 66%, 回收率 92% 图 2: 第一步交换层析图谱 层析系统 : AKTApurifier 10 柱子 : Tricorn 5/200 样品 : 阳离子洗脱峰 纯度 : 100%, 回收率 94% 细胞色素 C 的性质 分子量 :12400 D 等电点 : , 非常亲水 传统工艺 马或者猪心的提取物 GE 的工艺 马或者猪心的提取物 沸石吸附 硫酸铵 /TCA 沉淀 Amberlite 吸附 离子交换 疏水层析 图 3: 第二步疏水层析图谱 脱盐 图 1: 新老工艺对比图 脱盐 50 咨询热线 : 网址 :

51 GE 生命科学部填料应用部 层析系统 : AKTApurifier10 柱子 : Hiprep desalting 样品 : 疏水穿透峰 三步纯化总结表 ( 放大到 200g/ 批 ) 技术 时间 纯度 载量 回收率 1 阳离子交换 6 h 55-70% 13 mg/ml % 2 疏水层析 3 h >95% 25 mg/ml % 3 脱盐 1 h >95% / % / 总计 10 h >95% / 80% 表 1: 三步纯化表 结论 图 4: 第二步疏水层析图谱 细胞色素 C 的三步纯化方法取代了传统的多步手动操作, 盐沉树脂吸附方法 新工艺全过程仅用 10h, 总回收率达到 80%, 纯度达到 95% 以上, 可自动化监控操作, 可以线性放大, 是细胞色素 C 的新一代生产工艺 M marker 1 粗品 2 第一步流穿 3 第一步收集峰 4 第二步柱前 5 第二步流穿 6 脱盐收集峰 图 5: 电泳图谱 咨询热线 : 网址 : 51