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暗形韩
5 years ago
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1 生物梅里埃公司将质谱技术实现于临床细菌检测和鉴定的常规分析

2 目前细菌鉴定方法观察 visual, smell, taste 分子生物学 PCR, nucleotide sequence, MLST, RFLP, RAPD, real-time PCR 免疫学 mono- or polyclonal antibodies 生化反应 metabolic capacities and resistance to antibiotics 2

3 传统微生物检测的局限临床常规最常见的做法 : 从手工到自动化 ? 检测细菌种类有限检测步骤繁琐不能鉴定新发及非典型病原 3 3

% I nt ensi t y 100 90 80 70 60 50 40 30

9, 2 1 1 7 ] 0 3000 5000 7000 9000 11000

4 % I nt ensi t y V o y a g e r S p e c # 1 = > A d v B C ( 3 2, 0. 5, 1. 0 ) = > N F 0. 7 [ B P = , ] Mass ( m/ z) 现代微生物的分类 : 蛋白质组及基因组 protein bacterial cell DNA proteome species definition & determination genome mass fingerprint DNA fingerprint 质量指纹图谱基因指纹图谱 4 4

5 什么是质谱? 质谱的发展经过物理学 ( 电子 ) 化学 ( 元素 ) 及生物学 ( 生物分子 ) 物理学 : 发现电子化学 : 第二次世界大战 ( 从铀 238 中分离铀 235) 生物学 : 分离蛋白质 5

6 什么是质谱? 质谱通过测定离子化生物分子的质荷比 (mass/ charge) 便可得到相关分子的质量 6

7 MALDI-TOF MS: 基本原理 ion detector 飞行时间质量分析器 (TOF) in vacuum < 10-7 Torr 细菌 ( 蛋白 ) 基质 8

8 MALDI-TOF MS: 基本原理激光蛋白 (A) 与基质 (M) + m m m a m m + a m m + m m + a a + m a a 1) 用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜 2) 过程中将质子转移到生物分子 MH + + A M + AH + 样品靶基质附助激光解吸电离离子源 (MALDI) 9

9 MALDI-TOF MS: 基本原理 ion detector

10 MALDI-TOF MS: 基本原理 ion detector + + mass-independent detection of ions at a detector 飞行时间质量分析器 (TOF) + + time resolved output to oscilloscope and computer 11

11 Power Ionising Vacuum Negative 微生物鉴定的革命性突破利用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 检测细菌蛋白检测范围 1-500,000Da 12

12 全国第一套微生物质谱检测系统获得 SFDA 批准 13

13 临床细菌数据库临床微生物库包含细菌真菌及分枝杆菌 (757 种 ) 是否满足日常工作? 是否能针对真菌? 14

14 完全满足临床需要调查 50 家 3 甲医院, 日常工作的细菌种类少于 100 种 (>80%) 种 (>15%) 多于 200 种 (<5%) 15

真菌资料来源 : 北京协和医院检验科 2009-2010 年真菌监测网中国头 5

15 真菌资料来源 : 北京协和医院检验科年真菌监测网中国头 5 位真菌占总体 85%( 如白念珠菌近平滑念珠菌等等 ) VITEK MS vs SEQ (95%) 16

16 Power Ionising Vacuum Negative 诞生过程. 17

17 梅里埃的承诺微生物体外诊断领导者合作, 把质谱应用于微生物 Shimadzu 发明 MALDI-TOF 科研细菌数据库 (+2000 个菌种, 谱 ) 欧洲共同体专利 EU E1 Method of identifying microorganisms using MALDI-TOF-MS Granted December 2007 梅里埃建立临床细菌数据库 (+700 个菌种, 谱 )) 收集临床菌种进行评价, 建立临床应用的细菌数据库已获得欧洲体外诊断 (CE), 中国药监局 (SFDA) 批准 18

18 Power Ionising Vacuum Negative 主要组合准备工作站 VITEK2 仪器数据采集站 Myla TM 细菌数据库 19

19 准备工作站 20

20 数据采集站 21

21 4000 m/z 8000 数据采集站扩展到新的菌种和应用 ( 用户不断增加细菌数据库 ) Pantoea agglomerans Acinetobacter lwoffi Burkholderia cepacia Raoultella ornithinolytica Staphylococcus aureus Escherichia coli 4000 m/z 8000 检测细菌的核糖体蛋白不同图案代表不同菌种 ( 细菌质量指纹图谱 ) 22

22 稳健性 Impact of Incubation Time 16 h Major mass signals are still recorded after 120 h incubation 24 h Relative Intensity 48 h 72 h SARAMIS identification successful for all incubation times 120 h No influence of incubation time over a wide span m/z Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 grown on Columbia agar 23

23 Impact of Growth Media 稳健性 Mueller-Hinton Major mass signals are recorded in all samples Relative Intensity MacConkey SARAMIS identification successful for all growth media Columbia m/z Mass spectra of Enterobacter aerogenes DSM grown on three different standard media for 24 h No influence of growth medium on identification 24

24 检测参数来自于多项条件评估后的优化 Candida albicans DSM Proteus mirabilis DSM 4479 T Enterobact er aerogenes DSM T Proteus vulgaris DSM T Enterococcus faecalis DSM Pseudomonas aeruginosa DSM Escherichia coli DSM 1576 Shigella sonnei DSM 5570 Klebsiella oxytoca DSM 5175 Staphylococcus aureus DSM Klebsiella pneumoniae DSM T Streptococcus agalactiae DSM 2134 T Parameter Variables Cell number (approx.) 10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 Matrix (relative to SOP) 0.2x 0.6x 1.0x 1.4x 2.0x Position on template all 4 x 48 (slides) were tested Laser pulses Sample storage at 20 C 0d 1d 3d 7d Incubations time 16h 24h 48h 72h 120h Incubation temperature 20 C 30 C 37 C 42 C 37 C + 3 d 4 C Cultivation aerob microaerophil anaerob Media three different media per strain identification with >90% confidence for all strains identification with >90% confidence for some strains 25

25 质量控制

26 标准化工作流程 27

27 1 分钟完成 1 菌株鉴定结束以小时出鉴定结果的历史工作步骤时间 ( 分钟 ) n = 5 n = 24 n = 96 标本标本标本准备标本准备基质干燥读数及分析总共

28 工作流程只要有梦想, 凡事可成真! 29

29 商品化耗材可追溯靶板基质 - 立刻使用条码跟踪病人记录质量控制 (A1, B1, C1) 避免交叉污染 ( 临床应用 ) 30

30 质量控制 (A1, B1, C1) For E. coli K12 strains a number of exact average protein masses are known that are used as calibrants Protein [M+H] average 50S L36 RpmJ 4365,4 30S S22 RpsV 5096,8 50S L34 RpmH 5381,4 50S L33 RpmG 6241,4 50S L33 (methylated) RpmG 6255,4 50S L32 RpmF 6316,2 50S L30 RpmD 6411,6 unknown Protein YcaR 6856,1 50S L35 RpmI 7158,8 50S L29 RpmC 7274,5 50S L31 RpmE 7872,1 sex factor (experimental)* S L22 RplV 12227, m/z 31

31 Power Ionising Vacuum Negative 灵活的流程优化工作流程 : 4 位技师同步准备缩短制备时间检测同量大 192 标本 / 次 32

32 与 VITEK 2 药敏无缝连接实现快速临床报告功能全球唯一家公司提供细菌质谱鉴定连接细菌药敏 33

33 功能评估

34 功能评估 JCM, Aug 2012 测试了 767 常规临床分离株代表 50 个属,124 种菌种比较 VITEK2 表型系统, 如果鉴定是不符合, 参考分子生物学技术 VITEK MS 系统提供 96.2% 正确鉴定 [ 种水平 (86.7%). 属水平 (8.2%)] 35

35 满足临床应用更简单操作更灵活 ( 所有的微生物鉴定 ) 更准确 ( 临床 + 科研 ) 更快 (10 分钟 ) 更高通量 ( 检测 100 标本只需 1 小时 ) 更低运行成本 36

36 未来的. 只要有梦想, 凡事可成真! 37

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pdf AOAC Performance Tested Methods X-Gal) 926VRB FDA-BAMAOACI Method Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological OMA y=1.04x-0.13 (yx FDABAM)(r 2 )=0.98 85 y=0.95x+0.15r