32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No (pwb980) 对照各取重组菌和空白菌上清 10μl, 分别与 10μl 上样缓冲液混合, 沸水浴 10min, 离心取上清进行 SDS?PAGE(12% 分离胶,5% 浓缩胶 ) 电泳, 检测蛋白表达

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券摘尤
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2007,27(12):31~35 青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达赵洪坤刘兴旺邱强李秀星杜连祥 ( 天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室天津 ) 摘要以获得大量胞外青霉素酶为目的, 将青霉素酶基因克隆至表达载体 pwb980 中, 并转化到双蛋白酶缺陷的 BacilussubtilisDB104 重组菌在 LB 培养基中培养 24h 后,SDS?PAGE 分析发现目的蛋白分子量为 28kDa, 酶活力为 339U/ml; 通过筛选 7 种不同的发酵培养基发现 4 # 培养基更利于青霉素酶的表达, 最大酶活力为 1580U/ml, 较优化前提高了 3.66 倍, 并对该重组菌进行了 7L 罐放大实验, 结果显示在培养 24h 产酶达到高峰, 酶活力为 U/ml 关键词青霉素酶异源表达枯草芽孢杆菌中图分类号 Q556 青霉素酶 (Penicilinase,EC ) 是 β? 内酰胺酶的一种, 因能特异性地水解青霉素的 β? 内酰胺环使青霉素失活, 而具有广泛的工业用途, 如在乳品生产中可以水解牛乳中残留的青霉素, 生产无抗奶 [1,2] ; 在临床检测中, 可作为酶联免疫检测的标记物 [3] ; 在医药行业, 它在抗生素无菌检测药物设计中都得到了应用 [4] ; 另外, 近年来青霉素酶生物传感器也已成为研究热点 [5] Baciluscereus 是产胞外青霉素酶的典型微生物, 但国内外报道这种菌不但产酶量较低, 而且培养基较昂贵, 有些产酶菌还需要添加大量青霉素诱导, 所以生产成本较高为了提高酶活力, 一些国外学者将青霉素酶基因克隆到原核表达体系实现了青霉素酶的高水平表达 [6,7], 在国内未见青霉素酶异源表达的相关报道本研究试图将 BaciluscereusATCC10987 青霉素酶基因连接在强启动子 P43 和信号肽 SacB 之后的 pwb980 载体上, 并实现在 BacilussubtilisDB104 中高效表达 1 材料与方法 1.1 菌种和质粒表达宿主 BacilussubtilisDB104,E.coliDH5α, 表达载体 pwb980, 克隆载体 puc18 均为本实验室保藏收稿日期 : 修回日期 : 通讯作者, 电子信箱 :zhao?hongkun@163.com 1.2 主要试剂 Taq 酶限制性内切酶 dntp T4DNA 连接酶纯化 DNA 片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自 TaKaRa 公司 ;DNA Marker 蛋白质分子量标准卡那霉素和 IPTG 均购自上海生物工程有限公司 ; 引物合成及测序由上海英俊生物工程公司完成 1.3 目的基因的 PCR 扩增 BaciluscereusATCC10987 染色体 DNA 的提取参考文献 [8],PCR 扩增引物 :P1 为 5?CGGAATTCCGGG ATCCTCATAAAAATCAGGCGACG?3 ( 下划线部分别为 EcoRI 和 BamHI 酶切位点 ),P2 为 5?ACGCGTCGACTT ATTTAATATCATCAATTACAAC?3 ( 下划线部分为 SalI 酶切位点 ) 选定退火温度为 49, 按设定好的程序进行 PCR 反应, 并对产物进行回收和纯化纯化后的 PCR 产物与 puc18 载体进行连接, 连接产物电转化 E. colidh5α, 将经验证为阳性的重组子命名为 puc?penp, 送至公司测序 1.4 枯草芽孢杆菌转化枯草芽孢杆菌转化参照 Spizizen 的方法 [9] 1.5 重组菌 DB104(pWB?penp) 的表达挑一环重组菌于 5ml 含卡那霉素 (30μg/ml) 的 LB 培养基中,37 180r/min 震荡培养过夜按 3% 的接种量接种于 50ml 含卡那霉素 (30μg/ml) 的 LB 培养基中,37 培养 24h 取 1ml 菌液于 12000r/min 离心 2min, 收集上清液同样的程序做空白菌 DB104

2 32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No (pwb980) 对照各取重组菌和空白菌上清 10μl, 分别与 10μl 上样缓冲液混合, 沸水浴 10min, 离心取上清进行 SDS?PAGE(12% 分离胶,5% 浓缩胶 ) 电泳, 检测蛋白表达情况, 发酵液上清可直接用于酶活力的测定 1.6 青霉素酶活力测定测定方法参考文献 [10], 酶活力定义 : 在 37 ph7.0 条件下, 每分钟水解 1μmol 青霉素 G 所需要的酶量, 用 U 表示 1.7 培养基 1 # :LB 培养基 [11] ;2 # :LB 培养基 +1% 淀粉 ;3 # :M9 培养基 [11] ;4 # : 葡萄糖 4%, 玉米浆 2%, 硫酸铵 0.5%, 磷酸氢二钠 0.4%, 磷酸二氢钾 0.05%,pH7.0;5 # : 细菌完全培养基 [12] ;6 # : 细菌基础培养基 [12] ;7 # : 蛋白胨 1.5%, 酵母浸粉 2.5%, 淀粉 1% 2 结果 2.1 目的基因的获得及测序 PCR 产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析, 在约 800bp 左右出现 1 条特异性条带, 大小与预期值相符 ( 图 1) 按方法 1.3 构建了克隆载体 puc?penp, 对 puc?penp 上的 PCR 片段进行测序, 结果显示目的基因全长为 789bp, 与青霉素酶基因 ( 注册号 AE ) 大小一致, 但有 1 处差异 (773 处 T A, 相应的氨基酸 Ile Glu) 该突变位点不在青霉素酶分子的活性中心 S 70 XXK 73 (X 代表任意氨基酸 ) K 234 T(orS)G 236 S 130 DN 132 上 [13], 故理论上目的蛋白应具有青霉素酶活性切得到了一个与目的基因大小相同的小片段和一个与 pwb980 大小相同的大片段 ; 并且以该重组质粒为模板进行 PCR, 在约 800bp 处扩增出特异性条带, 以上结果证明 penp 成功地插入到 pwb980, 将重组表达质粒命名为 pwb?penp 图 2 重组质粒 pwb-penp 酶切和 PCR 鉴定 M:1kbDNAmarker;1:pWB-penp/BamHI+SalⅠ; 2:pWB-penp/PCR Fig.2 Identificationofrecombinantexpresionvector 2.3 重组菌 DB104(pWB?penp) 的表达及酶活力分析将重组菌和空白菌发酵液上清进行 SDS?PAGE 分析 ( 图 3), 重组菌上清在约 28kDa 处出现一特异性条带, 与预期青霉素酶成熟肽分子量大小相符, 而空白菌在 28kDa 处无条带, 说明青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达, 另外重组菌上清中杂蛋白很少, 说明枯草芽孢杆菌自身分泌的本底蛋白较少, 这有利于青霉素酶的分离纯化图 1 PCR 扩增结果 M:1kbDNAmarker;1:PCR 产物 Fig.1 ProductofthePCR 2.2 pwb?penp 表达载体的构建与鉴定利用限制内切酶 BamHⅠ 和 SalⅠ 双酶切克隆载体 puc?penp, 然后将切胶回收的小片段与同样经过 BamH Ⅰ 和 SalⅠ 双酶切的 pwb980 进行连接, 连接产物转化到 B.subtilisDB104, 在卡那霉素平板上筛选转化子, 阳性转化子双酶切和 PCR 验证见图 2 从图 2 中可知, 双图 3 表达蛋白的 SDS?PAGE 分析 M:Proteinmarker;1: 空白菌 DB104(pWB) 发酵上清 ; 2:DB104(pWB?penp) 发酵上清 Fig.3 SDS?PAGEanalysisofproteinexpresion 取 10μl 上清液测定酶活力 ( 按方法 1.6), 结果发现重组菌酶活力达到 339U/ml, 而空白菌无酶活力, 以

3 2007,27(12) 赵洪坤等 : 青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达 33 上结果说明青霉素酶基因在 BacilussubtilisDB104 中得到了活性表达 2.4 最适培养基的选择尽管青霉素酶基因在 BacilussubtilisDB104 中得到了表达, 但表达量没有在大肠杆菌中表达量高, 这可能是由于 LB 培养基不适合 BacilussubtilisDB104 表达青霉素酶基因, 于是按 3% 接种量分别接种于以下 7 种培养基,37 培养 36h, 测定酶活力 ( 表 1) 表 1 不同培养基对产酶的影响 Table1 Efectofdiferentmediaon productionofpenicilinase 培养基时间 (h) 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 # 7 # 图 4 在摇瓶条件下重组菌 DB104 (pwb?penp) 的发酵曲线 Fig.4 FermentationcurveofDB104 (pwb?penp)inshakingflasks 图 5 所示从表 1 可知,4 #,7 # 培养基在 36h 酶活力分别达到了 U/ml 和 U/ml 一般来说, 目的蛋白在工程菌中的高表达主要是通过强启动子和基因的高拷贝数实现的 ;4 # 培养基中的葡萄糖作为枯草芽孢杆菌容易利用的碳源, 促进了工程菌生长, 提高了菌体浓度进而增加了外源基因的拷贝数总量, 提高了酶活力 ; 而该培养基中的玉米浆不但为菌体生长提供了有机氮源, 其丰富的生长因子也可能对菌体的生长和产酶有促进作用另外,4 # 与 7 # 培养基相比不但酶活力略高而且其成分也比 7 # 培养基低廉, 所以选择 4 # 培养基作为发酵培养基较为合适 2.5 摇瓶条件下的发酵过程曲线按 3% 的接种量将种子接到装有 100ml4 # 培养基的 500ml 三角瓶中,37,180r/min 连续振荡培养 38h, 每间隔一定时间取样测定酶活力,OD 600, 结果见图 4 从图 4 可以看出, 大约在接种 2h 后进入对数生长期, 随着菌体的生长, 酶活也在提高 ;24h 进入稳定期, 在稳定期也出现了较大的酶活增长, 在 32h 达到产酶高峰, 最大酶活力为 1580U/ml 2.6 7L 发酵罐分批实验在摇瓶实验基础上, 进行了 7L 罐的放大实验实验参数 : 装液量为 5L, 接种量为 3%, 培养温度为 37, 起始转速为 250r/min, 起始通气量为 1 0.5, 发酵过程中保持溶解氧在 20% ~30% 对发酵过程中的残糖, ph, 生物量, 粗酶液酶活进行了测定, 所绘发酵曲线如图 5 重组菌 DB104(pWB?penp) 在 7L 发酵罐中的分批发酵曲线 Fig.5 BatchfermentationcurveofDB104 (pwb?penp)in7literreactor 从图 5 可知, 菌体在发酵罐中有 6h 的延滞期 ;6h 后进入对数生长期, 在该阶段青霉素酶积累速度最快, 葡萄糖消耗也最多,pH 稳定在 6.0 左右 ;20h 后进入稳定期, 稳定期只维持了较短的 4h, 而且产酶趋势也没有在摇瓶发酵那么陡, 发酵 24h 达到产酶高峰, 酶活力为 U/ml, 比摇瓶发酵提前了 8h;24h 后残糖降到最低, 菌体自溶产生的碱性物质导致 ph 值略微回升, 但酶活力并没有明显的下降, 说明青霉素酶在该培养基中能稳定存在从以上结果可知, 由于发酵过程中发酵罐与摇瓶发酵条件的差异导致了发酵液中菌体浓度高峰和产酶高峰的提前在发酵罐中由于溶氧更好, 葡萄糖被大

4 34 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No 量用于菌体生长, 所以菌体生长更快, 菌密度更高 ; 与此同时, 由于葡萄糖的消耗过多导致了发酵后期产酶后劲不足, 所以最高酶活力有所下降为了保证产酶稳定, 可以控制在发酵 28h 下罐 3 讨论本研究成功地将青霉素酶基因克隆到组成型表达载体 pwb980 中, 在 BacilussubtilisDB104 中获得到了分泌表达, 但重组菌在 LB 培养基中最大表达量 (493U/ ml, 见表 1 中 1 # ) 没有比在大肠杆菌中表达量 ( 另文发表,480U/ml) 提高太多考虑到培养基是工程菌表达的主要影响因素之一, 于是挑选了七种细菌常用培养基来筛选最适产酶培养基, 结果发现 4 # 和 7 # 培养基更有利于工程菌的表达, 这可能是由于 4 # 培养基中的玉米桨和 7 # 培养基的酵母膏不但为菌体生长提供了氮源和生长因子, 而且还提供了大量 BacilussubtilisDB104 所必须的组氨酸 ( 该宿主菌是 his? ) 从摇瓶产酶曲线和 7L 罐发酵曲线可看出产酶不仅在对数生长期发生, 在稳定期也大量合成, 这是由 [14] P43 重叠启动子的性质决定的 Wang 等研究发现 P43 启动子序列上存在两种启动子, 它们共享相同的转录起点, 但这两种启动子的 RNA 聚合酶亚基不同, 在对数生长期结合的是 σ 55, 而在稳定期早期结合的是 σ 37 在摇瓶条件下稳定期早期酶仍像对数期那样的速率合成, 而在发酵罐条件下酶的合成速率远低于对数期, 这可能是由于发酵罐的溶氧条件好于摇瓶, 葡萄糖被大量用于菌体繁殖和呼吸 ( 发酵罐中最高 OD 值为 13.56, 摇瓶中最高 OD 值为 9.48), 致使稳定期菌体代谢和呼吸缺少必须的碳源, 影响了携带有 σ 37 的 RNA 聚合酶与启动子有效的结合及转录, 降低了酶的合成另外从放大实验中发现, 葡萄糖是产酶的限制因子, 所以进行适当补糖将有可能提高酶的产量利用 BacilussubtilisDB104 表达的青霉素酶与大肠杆菌表达的青霉素酶相比有以下几个优势 :(1) 无需诱导并直接分泌到胞外, 省去了破壁工序 ;(2)4 # 培养基较大肠杆菌产酶培养基 (LB) 廉价许多 ;(3) 摇瓶和 7L 罐发酵的最大酶活力分别为 1580U/ml 和 U/ml, 已经达到了国外领先水平 (Susan, 约 900U/ml~ 1500U/ml), 更远远超过了在大肠杆菌中表达水平 ; (4) 分泌出的杂蛋白较少, 利于分离提取另外本实验室已经成功地使用大肠杆菌表达的青霉素酶分解了牛奶中残留的青霉素, 验证了利用青霉素酶生产无抗奶的技术可行性, 而青霉素酶基因在 BacilussubtilisDB104 中的成功表达实现了降低青霉素酶生产成本, 简化生产工艺的目的, 为青霉素酶在乳品行业的广泛应用奠定了坚实的基础参考文献 [1]Korycka.Useofmicrobialbeta?lactamasetodestroypenicilin addedtomilk.jdairysci,1985,68(8):1910~1916 [2]LeeM Z,RichardsonT.Preparationandcharacterizationof immobilizedbeta?lactamasefordestructionofpenicilininmilk. JDairySci,1987,70(10):2032~2039 [3] 邓安平, 杨红, 杨秀岑. 青霉素酶及其在免疫分析中的应用. 华西药学杂志,1996,11(4):241~242 DengA P,Yang H,Yang X C.WestChina Journalof PharmaceuticalSciences,1996,11(4):241~242 [4]SmythTP,O DonnelM E,O ConnorM J,etal.Beta? lactamase? dependent prodrugs: recent developments. Tetrahedron,2000,56,5699~5707 [5]QinY J,Joaquim M S.Cabralpenicilinenzymebiosensors basedonphmembraneelectrodes.biocatalbiotransform,2002, 20(1):1 [6]JefreyJ,EunkiK,JohnN.EfectoftemperatureonEscherichia colioverproducingbeta?bactamaseorhumanepidermalgrowth factor.appliedandenvironmentalmicrobiology,1990,56(1): 104~111 [7]SusanJ,Thornwel,AlisonK,etal.Aneficientexpresionand secretionsystembasedonbacilussubtilisphageφ105andits usefortheproductionofb.cereusbeta?bactamaseⅠ.gene, 1993,133:47~53 [8] 王黎明, 尚玉磊, 王勇军, 等. 蜡样芽孢杆菌 M22 锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达. 农业生物技术学报,2005,13(3):360~364 WangLM,ShangY L,WangY J,etal.ChinaJournalof AgriculturalBiotechnology,2005,13(3):360~364 [9]SpizizenJ.TransformationofbiochemicalydeficientstrainofB. subtilisbydeoxyribonucleate.proceedingofnationalacademyof ScienceUSA,1958,44:1072 [10]SamuniA.Adirectspectrophotometricasayanddetermination ofmichaelisconstantsforthebeta?lactamasereaction.anal Biochem,1975,63(1):17~26 [11]SambrookJ,RuselD W.MolecularCloning:A Laboratory Manual.3 rd edbejing:sciencepres, [12] 杜连祥. 工业微生物实验学技术. 天津 : 天津科学技术出版社,1992,274 DuLX.Experimentalskilofindustrialmicrobiology.Tianjin: ScienceandTechnologyofTianjinPres,

5 2007,27(12) 赵洪坤等 : 青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达 35 [13]GhuysenJM.Molecularstructuresofpenicilinbindingproteins andbeta?lactamases.trendsmicrobiol,1994,2:372 [14]WangPZ,DoiR H.Overlappingpromoterstranscribedby BacilussubtilisandRNApolymeraseholoenzymesduringgrowth andstationaryphases.biolchem,1984,259(3):8619~8625 High?LevelExpresionofPenicilinaseGeneinBacilusSubtilis ZHAOHong?kun LIUXing?wang QIUQiang LIXiu?xing DULian?xiang (TianjinKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,ColegeofBiotechnology,Tianjin UniversityofScience&Technology,Tianjin ,China) Abstract Toobtainanumberofextracelularpenicilinase,thegene(penp)encodingpenicilinseofBacilus cereusatcc10987wasclonedintoexpresionvectorinbacilussubtilis,transformedintobacilussubtilisdb104 deficientintwoproteases.whenrecombinantbacteriawasculturedinlbmediumfor24hours,theresultofsds?pageshowedthatthemolecularweightoftheproteinwas28kdaandthepenicilinaseactivityreached339u/ ml.byscreeningsevendiferentfermentationmedia,theresultshowedthat4 # medium isfavorabletoproducing penicilinasebytherecombinantcelsthantheothers,withtheyieldoftheenzymebeing1580u/ml.whenthe recombinantcelswasculturedin7literfermentorfor24h,thepenicilinaseactivityreached1255.8u/ml. Keywords Penicilinase Heterologousexpresion Bacilussubtilis

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No (pwb980) 对照 各取重组菌和空白菌上清 10μl, 分别与 10μl 上样缓冲液混合, 沸水浴 10min, 离心取上清进行 SDS?PAGE(12% 分离胶,5% 浓缩胶 ) 电泳, 检测蛋白表达

32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No (pwb980) 对照各取重组菌和空白菌上清 10μl, 分别与 10μl 上样缓冲液混合, 沸水浴 10min, 离心取上清进行 SDS?PAGE(12% 分离胶,5% 浓缩胶 ) 电泳, 检测蛋白表达