第期章四平等枯草芽孢杆菌生防菌株 ' 的发酵条件优化 $ 有抑菌物质的发酵滤液 (+) 对油菜菌核病菌的抑菌活性测定 ) 将在油菜菌核病菌菌落边缘制取的直径菌碟放置在 / 平板中央然后在距离该菌碟两对角线处放置, 个牛津杯再取 1 各发酵滤液加入到牛津杯中置于黑暗条件下培养

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子贯羿臧
5 years ago
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1 南京农业大学学报 ' %! "!" # 章四平刘圣明王建新等 - 枯草芽孢杆菌生防菌株 ' 的发酵条件优化 - 南京农业大学学报 ' % 枯草芽孢杆菌生防菌株 3A ( 的发酵条件优化章四平刘圣明王建新周明国南京农业大学植物保护学院农业部病虫监测与治理重点开放实验室江苏南京 $ 摘要通过单因子试验筛选到了适合枯草芽孢杆菌 ' 生防菌株生长及其拮抗物质产生的最佳碳源为玉米粉和麦芽糖最佳氮源为豆粕最佳金属离子是 2 7 用正交试验法确定了该培养基各组分的最佳含量为玉米粉 ) 1 麦芽糖 ) 1 豆粕 ) 1 2 2; ) 1 在确定适合该菌株的培养基组分基础上对其培养条件进行优化试验结果表明初始为 %' 培养温度为 ' 1 摇瓶装液量为 $ 1 接种量为 4 体积分数培养时间为 % 转速为 ' 时为该菌株的最佳培养条件关键词单因子试验枯草芽孢杆菌发酵条件拮抗物质正交试验中图分类号 6, 6,% 文献标志码 / 文章编号 ' 81 / ' / $! % & $ $'! #$!%%!3A"( $ /.6 ) 1 6! ) ) 8/. ; 3 ) ) ( 2(!)!( (!# (!:1 ( ( :( 3( ( ) " 3 )!! (!! "! 3 :( /) #! )/) #! : )$ 2 $! +! (!#( " ( (!) (< " )( # (" # ( (!!#! ' ( () # #( ( )! : )! #(!!! <!!!" ":-+!! (<!"!! # ( ( #!< #( ( " (!!! ()! < (:! "!) "!!! ( < !! #( ( ( (!!" #(!" ) 1 #( ( ) 1 (! ) 1 (:! "!) " ) 1 2 2; :!( ()(!!! -6!?! :!#!#( " ( < (!" "!! (<!"!!" %'!!! (!!!'!? :(!" $ 1 1 =! (# ( (!( 4!!! ( #:#!( % "! ( (!!" ( '!!#! :- % )! #(!!!!!#!!! ( #( " ( )( # ( ()(!!! 本实验室从南京郊区土壤中筛选到了一株对油菜菌核病菌和水稻纹枯病菌等植物病原菌生长具有强烈抑制作用的枯草芽孢杆菌 ' 生防菌株经室内研究表明该生防菌株能够分泌抗菌物质导致真菌菌丝肿胀畸形田间试验结果表明该菌株的 A 5 A 发酵液对油菜菌核病和水稻纹枯病具有很好的防治效果为了实现该生防菌株的产业化本文对该菌株的发酵条件进行了优化研究为该菌株的工业生产并获得高产抗菌物质提供参考依据 () 材料与方法 (*() 材料枯草芽孢杆菌 ' 和油菜菌核病菌由本实验室分离鉴定与保存 / 培养基 & 培养基 / 培养基制作过程见文献基础发酵培养基种子培养基同 & 培养基 (*+) 方法 (*+*() 种子菌液制备 ) 在超净台中从保存 ' 菌株的试管中挑取一环 ' 菌株在含 / 培养基平板上画线于生长箱中 ' 黑暗培养, 得到活化的 ' 菌株单菌落然后挑取一个活化的 ' 单菌落于种子培养基中 ' ' 条件下培养, 此时菌量约为 ' 2> 1 (*+*+) 发酵液的制备 ) 在发酵过程中得到的各发酵滤液经滤膜过滤次得到的滤液即为含收稿日期 ' 基金项目国家 $ 计划项目 $2&'$% 国家 '% 计划项目 '//,, 公益性行业农业科研专项项目 $ 作者简介章四平硕士研究生通讯作者周明国教授主要从事植物病害化学防治研究 ) ( *!" #

2 第期章四平等枯草芽孢杆菌生防菌株 ' 的发酵条件优化 $ 有抑菌物质的发酵滤液 (*+*) 对油菜菌核病菌的抑菌活性测定 ) 将在油菜菌核病菌菌落边缘制取的直径菌碟放置在 / 平板中央然后在距离该菌碟两对角线处放置, 个牛津杯再取 1 各发酵滤液加入到牛津杯中置于黑暗条件下培养测量抑菌圈直径, (*+*) 活菌数计数 ) 按平板菌落计数法计算活菌数将发酵液稀释至 % 5 然后取 1 均匀涂布到 / 平板上, 后计算活菌数 (*+* ) 培养基组分的筛选 ) 最佳碳源筛选分别以含量为 ) 1 的玉米粉玉米淀粉可溶性淀粉藕粉葡萄糖木糖乳糖麦芽糖白砂糖甘露醇蔗糖种碳源替换 & 培养基中的蔗糖其他成分不变将不同碳源制成的培养基值均调至 1 三角瓶中装液量为 % 1 3 灭菌接种量为每个摇瓶中接种 % 1 培养 % 5' 的抗枯草芽孢杆菌种子液于 ' ' 条件下培养,' 采用稀释平板法计算活菌数并测定发酵滤液对油菜菌核病菌的抑菌活性最佳氮源筛选分别以含量为 ) 1 的黄豆粉麸皮豆粕鱼粉聚蛋白胨牛肉膏酵母粉尿素, ;, 2, 6;, 种氮源替换 & 培养基中的聚蛋白胨牛肉浸膏和酵母粉其他条件同上金属离子的筛选以优化的碳源与氮源制成发酵培养基然后在该培养基中分别添加 ) 1 的 ;, 无水 >!6;, 无水 6;, 2 3 6;, 无水 3)6;, 2 2; 以不添加金属离子的培养基作为对照其他条件同上培养基组分配比优化以优化得到的玉米粉和麦芽糖为碳源以豆粕为氮源金属离子化合物为 2 2; 进行, 因素水平的正交试验采用 1 $, 正交表确定各组分的最佳配比 (*+* ) 最佳培养条件的筛选 ) 培养基初始值用 ( 1 2 和 ( 1 ; 将优化培养基值调节为 % % ' $ 其他条件同培养温度将该菌株分别在 ', 条件下培养其他条件同通气量在 1 三角瓶中分别装入体积为 % $ 1 优化培养基其他条件同培养时间将菌株培养时间调节为, %,' % ', $% 其他条件同接种量将接种量体积分数调节为 4 4,4 %4 '4 其他条件同转速将摇床转速分别调整为 ', % 其他条件同 +) 结果与分析 +*() 培养基的优化 +*(*() 碳源氮源和金属离子对 3A ( 生长及活性的影响 ) 由图 / 可见从菌株生长量来看当图 () 碳源氮源和金属离子对菌株 3A" 发酵的影响 '*()5!!$ ' $ %/ $# & / $ 3A ( $ / - 玉米粉 2( ( - 玉米淀粉 2( # - 藕粉 1( (( #,- 可溶性淀粉 6(! # - 乳糖 1 #(! %- 麦芽糖 3 (! - 甘露醇 3 ( '- 蔗糖 6 # (! $- 葡萄糖. #(! - 木糖 : (! - 白砂糖 6 ) & - 鱼粉 >! - 豆粕 6(:! "!) - 黄豆粉 6(:!!,- 麸皮 & - 聚蛋白胨 ( :! (! %- 牛肉膏 &!!! # - 酵母粉 9!! # '-, ; $-, 2 -, 6;, - 尿素! 2 - ;, ->!6;, - 6;,, ;, %-3)6;, -2 2; '-2

3 % 南京农业大学学报第卷麦芽糖作为碳源时菌株生长量最大达到,% A $ 2> 1 其他碳源的菌株生长量大小依次为甘露醇乳糖蔗糖葡萄糖玉米粉木糖白砂糖玉米淀粉藕粉可溶性淀粉从发酵滤液抑菌活性来看玉米粉为碳源时菌株发酵滤液活性最强抑菌圈直径达到 '$ 其他碳源的抑菌活性大小依次为麦芽糖蔗糖白砂糖甘露醇乳糖葡萄糖可溶性淀粉木糖藕粉玉米淀粉综合生长量及发酵滤液活性考虑麦芽糖应为最佳碳源此时菌株不但生长量大而且发酵滤液活性很强玉米粉为碳源时菌株生长量虽不大但菌株的发酵滤液活性最强而且生产成本低廉因此选择麦芽糖和玉米粉作为复合碳源图 & 表明以豆粕为氮源时活菌数最多达到 A $ 2> 1 其他氮源生长量大小依次为酵母粉牛肉膏黄豆粉聚蛋白胨麸皮鱼粉尿素, ;, 2, 6;, 以豆粕为氮源时发酵滤液抑菌活性也最强发酵滤液对油菜菌核病菌的抑菌圈直径达到其他各氮源形成的抑菌圈直径大小依次为牛肉膏酵母粉鱼粉聚蛋白胨黄豆粉麸皮, ; 尿素, 2, 6;, 综合菌株生长量发酵滤液抑菌活性及生产成本考虑豆粕为最佳氮源由图 2 可见 3) 能促进菌株生长使菌株的生长量显著增加 7 对该菌株的生长影响不明显 7 对菌株的生长有微弱的抑制作用 >! 7 7 则对菌株的生长有强烈的抑制作用使菌株的生长量有明显的减少 3) 能够显著提高菌株发酵滤液的抑菌活性 7 对菌株发酵滤液的活性影响不大 7 >! 则明显抑制了菌株发酵滤液的抑菌活性由于在生产上 2 7 成本低于 3) 7 所以在菌株发酵培养基中选择添加 2 7 +*(*+) 正交试验法优化筛选培养基各组分的配比 ) 由表和表可见不同水平的玉米粉对发酵液中活菌数有一定的影响培养基中玉米粉的含量越低发酵液中活菌数越多反之越少极差为 '' 玉米粉含量对发酵滤液的抑菌活性也有一定的影响高含量玉米粉的抑菌活性最差而低中含量玉米粉的抑菌活性基本没有差异但都高于高含量玉米粉的发酵滤液的抑菌活性不同水平麦芽糖对发酵滤液中活菌数有较大的影响麦芽糖含量越高活菌数越高但对发酵滤液的抑菌活性基本没有影响极差为 ' 在温室和田间试验中高浓度的活菌有利于 ' 在作物上的定殖增强防治效果培养基中豆粕含量对发酵液中活菌数和发酵滤液的抑菌活性都有显著影响豆粕含量越高活菌数越大极差试验号 ((!!! 表 () 培养基各组分配比优化的正交试验统计结果 $ # ()8 & ' $# 1 / $# $!$# # 1 1 / % / 玉米粉麦芽糖豆粕 2 2; 活菌数抑菌圈直径!! ( ( (! ) 1 ) 1 ) 1 A ' 2> 1 ) 1 2( ( 3 (! 6(:! "!) 0 :( #! > ' > ' /& / &2, $ & ' / % % %,%, %, 2 ', 2 ' > $.,% 注不同大写字母表示在水平差异显著!! #!!! ) # "!! #!!! - 表 +) 培养基各组分配比优化的正交试验评价结果 $ # +)8 & ' $# 1 / $# $#$ # 1 1 / % / 玉米粉麦芽糖豆粕 2( ( 3 (! 6(:! "!) 2 2; 活菌数 A ' 2> 1,,,, % 0 :( #! $ $$ ' 极差 '' ' ', 抑菌圈直径 %, %,,$!! ( ( (! % % %,,$ % %% 极差 % ' 注分别代表玉米粉麦芽糖豆粕和 2 2; 的种水平与其他因素组合时发酵滤液中的活菌数或发酵滤液产生的抑菌圈直径 +!? :(! #! ( "!"!! ( ( (!:!! (! "!! ( #( ( (! (:! "!) " 2 2;!!#! :#(!" < (! #( -

4 第期章四平等枯草芽孢杆菌生防菌株 ' 的发酵条件优化 % 为 ' 且中高含量发酵滤液中活菌数的差异很大低含量豆粕抑菌活性最低中高含量豆粕的抑菌活性都强于低含量的抑菌活性但中高含量的发酵滤液间的抑菌圈直径差异不大仅为 2 2; 含量对发酵滤液中活菌数的影响最大极差达, 培养基中 2 2; 含量越高活菌数越大其发酵滤液的抑菌活性也随着 2 2; 含量的升高而增大综合这, 个因素不同水平对发酵的影响以及考虑生产成本认为最适合该菌株生产的培养基各组分含量为 ) 1 玉米粉 ) 1 麦芽糖 ) 1 豆粕和 ) 1 2 2; +*+) 菌株发酵培养条件的优化 +*+*() 培养基初始 1 值 ) 图 / 表明在培养基值为 5% 时菌株生长量呈明显上升趋势在值为 % 时最有利于菌株生长活菌数达到 % A $ 2> 1 此条件下抑菌圈直径达到 % 此后随着值增大菌株生长量则明显下降菌株发酵滤液活性先随着值的增大而增强当值达到时发酵滤液活性最强抑菌圈直径达到 % 此时活菌数为 A $ 2> 1 其后值再增大活性反而下降因此在发酵时将培养基的值控制在 % 5 左右图 +) 培养条件对菌株 3A ( 发酵的影响 '*+)5!!#! % / $ 3A"( $ +*+*+) 培养温度 ) 试验结果图 & 表明当培养温度为 ' 时菌株生长量为 % A $ 2> 1 发酵滤液抑菌圈直径为 $ 都达到最大值高于或低于此温度都不利于菌株生长和发酵滤液活性因此在发酵时培养温度选择 ' 为最佳 +*+*) 装液量 ) 从图 2 可见在 1 三角瓶中随着装液量的增加菌株生长量呈明显下降趋势发酵滤液活性也与三角瓶装液量有关当装液量为 $ 1 时菌株发酵滤液抑菌活性最强抑菌圈直径达 ' 装液量多于或少于这个量时抑菌活性都明显下降说明菌株抑菌物质的产生对溶氧量有特定的要求装液量过多或过少都不利于菌株发酵时抑菌物质的产生而此时菌株的生长量与最大生长量装液量为 1 也相差不大因此发酵时在 1 三角瓶中装液量为 $ 1 效果最理想 +*+*) 培养时间 ) 图表明菌株在培养 5% 内生长量呈明显上升趋势 % 时达最大值然后随着培养时间的延长 % 5% 生长量呈明显下降趋势在培养 % 5 内生长量又开始增加随后在培养 5 内生长量又再次下降此结果恰好符合细菌生长周期规律发酵滤液抑菌活性测定结果表明在 5,' 随着培养时间的延长抑菌圈呈逐渐增大的趋势这是由于培养时间的延长菌株产生的抑菌物质不断积累在培养,' 5 内抑菌圈大小没有明显的变化但抑菌圈直径又都小于培养,' 的抑菌圈直径这可能是由于培养时间过长菌株在代谢产生抑菌物质的同时还代谢出其他物质抑制了抑菌物质的活性因此菌株以培养 % 较为适宜 +*+* ) 种子液接种量 ) 种子液接种量的多少与菌株生长周期有关一般来说种子液接种量越大延

5 % 南京农业大学学报第卷滞期越短反之则长接种量过小会造成培养周期的延长浪费时间但接种量过大会造成营养成分过度的被消耗掉造成菌体提前死亡同时也不利于抑菌物质的积累由图可以看出当种子液接种量为 4 体积分数时菌株生长量和发酵滤液抑菌圈同时达到最大分别为 $ A $ 2> 1 和 ' 因此在发酵时选择种子液的接种量为 4 +*+* ) 转速 ) 试验结果图 > 表明转速从增加至 ' 时菌株的生长量及抑菌圈直径都显著增加当转速继续增加时菌株生长量明显下降而抑菌圈直径也稍微变小这说明转速影响着菌株 ' 的生长周期当转速为时培养,' ' 还处在对数期当转速为, 时 ' 培养,' 就进入了生长衰退期导致活菌数下降因此 ' 最适宜的转速为 ' ) 结论与讨论通过单因素试验和正交试验相结合初步得到了适合摇瓶条件下菌株 ' 发酵的培养基配方为 ) 1 玉米粉 ) 1 麦芽糖 ) 1 豆粕 ) 1 2 2; 最适培养条件为初始值为 %' 培养温度为 ' 1 摇瓶装液量为 $ 1 接种量为 4 培养时间为 % 转速为 ' 此条件下 ' 的活菌数及抑菌圈直径分别高达 %$ A $ 2> 1 和比在 & 培养基中 ' ' 条件下培养,' 时活菌数 '% A ' 2> 1 抑菌圈直径有了显著的提高研究结果表明在绝大多数速效碳源条件下该菌株生长良好而在供试的几种缓效碳源中只有玉米粉能使其正常生长玉米淀粉藕粉可溶性淀粉作碳源时该菌株生长量很小其培养液稀释至 5 % 后涂平板培养时没有菌落出现说明该菌株利用除玉米粉外的几种缓效碳源的能力很差优化氮源时发现该菌株在供试的几种无机氮源作为唯一氮源时其培养液稀释至 5 % 后涂平板时也检测不到单菌落说明该菌株利用无机氮源的能力很差甚至不能利用无机氮源金属离子对发酵的结果表明 >! 7 7 对菌株的生长有强烈的抑制作用 7 7 对菌株的生长没有影响 3 7 3) 能促进菌株生长使菌株的生长量显著增加比较相同碳源氮源或金属离子条件下菌株的生长量与其发酵滤液的活性发现菌株的生长量与其发酵滤液的活性并不呈正相关在优化培养条件时发现该菌株最适宜培养基值为 % 5%' 说明该菌株喜欢在偏酸性的环境中生长温度在 5, 时菌株的生长量显著下降说明该菌株不耐高温在本研究获得的优化培养基组分和培养条件下 ' 菌株的生长量及抑菌代谢产物都得到了显著提高而且温室和田间试验表明了此发酵滤液防治油菜菌核病的效果显著增强本试验只是在摇床条件下对发酵培养基的组成及其培养条件进行了优化今后尚需在发酵罐中进行验证在实际生产中对发酵条件的控制方面也尚需进一步研究参考文献 9 ) ( ) ) 8 )&( 8 )! -/# : "! # #:(!!#! ' ) #!! ) " 2! ((! -& ( () # 2( ( $ % % 章四平匡静王建新等 - 生防菌株 ' 的鉴定及其对几种植物病原真菌的拮抗作用研究 - 中国农学通报 $ 方中达 - 植病研究方法 3- 版 - 北京中国农业出版社 $$$ '$ $, 陈志谊徐志刚陆凡等 - 拮抗细菌 &$% 培养液对水稻纹枯病菌的抗生活性及其抗菌物质的研究 - 江苏农业学报 %,' 宋卡魏王星云张荣意 - 培养条件对枯草芽孢杆菌 &%' 芽孢产量的影响 - 中国生物防治 $ % 王云霞钱国良胡白石等 - 产酶溶杆菌 ; 菌株摇瓶发酵条件研究 - 中国生物防治 ', % 责任编辑夏爱红

福建农业学报发酵最佳转速的确定确定发酵周期培养基配方试验最优培养条件下碳源筛选最优培养条件下氮源筛选结果与分析均匀设计最佳

福建农业学报发酵最佳转速的确定确定发酵周期培养基配方试验最优培养条件下碳源筛选最优培养条件下氮源筛选结果与分析均匀设计最佳福建农业学报赵健高晓丹邱荣洲翁启勇材料与方法种子罐的制备发酵条件单因素试验发酵最佳值的确定发酵最佳温度的确定福建农业学报发酵最佳转速的确定确定发酵周期培养基配方试验最优培养条件下碳源筛选最优培养条件下氮源筛选结果与分析均匀设计最佳赵健等应用均匀设计优化生防细菌发酵培养基组分及条件研究最佳温度碳源最佳转速氮源福建农业学报均匀设计讨论赵