第 期 仇晶晶等 响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素 8 酰化酶 膏 卡那霉素 初始发酵培养基 蛋白胨 酵母膏 可溶性淀粉 卡那霉素 方法 摇瓶培养将菌种通过平板划线法接种至 固体培养基 培养 挑取单克隆接种至 培养基中培养 后接种至含 发酵培养基的 的锥形瓶中 摇床 E

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1 浙江理工大学学报 第 卷 第 期 年 月 & 文章编号 响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素 酰化酶 仇晶晶 陈 玮 丁 明 张漫莉 赵辅昆 浙江理工大学生命科学学院 杭州 摘 要 利用响应面法优化重组枯草芽孢杆菌 &8 发酵生产青霉素 8 酰化酶的条件 通过 设计法对碳源 氮源 无机盐 温度等 个因素对发酵产青霉素 8 酰化酶的影响进行评价 筛选出发酵温度和酵母膏为影响产酶的显著因素 采用了中心组合设计实验对两种显著影响因素进行了优化 应用响应面分析确定了显著因素的最佳水平 结果表明 当温度为 E 酵母膏为 时 最终的酶活达到 & 比初始发酵条件提高了 倍 在最佳条件利用 的发酵罐对重组枯草芽孢杆菌进行扩大培养 最终酶活可达 & 相对于摇瓶发酵又有大幅度的提高 关键词 青霉素 8 酰化酶 枯草芽孢杆菌 响应面 发酵中图分类号 文献标识码 引 言 青霉素 8 酰化酶 8 简称 8 是一类重要的医药工业用酶 广泛应用于 内酰胺类抗生素生产领域 8 可以催化裂解青霉素 8 和头孢霉素 生产 氨基青霉烷酸 和 氨基头孢烷酸 = 8 还能够催化以上反应的逆反应 即在酸性条件下催化 氨基酸类似物与 内酰胺母核 如 缩合产生新型 内酰胺 抗生素 巨大芽孢杆菌 来源的青霉素 8 酰化酶 8 是工业上广泛应用的一种酶制剂 利用枯草芽孢杆菌表达系统可以高效分泌表达 8 提取工艺简单 是大规模生产 8 的重要途径 已报道的 8 表达量可达 & 响应面分析法 - 可在多因素作用的生化过程中 快速寻找出显著因素 逼近最大响应区间 拟合出数学模型方程 并分析回归方程寻求最优工艺参数 解决多 变量问题 - 是一种实用性强 精度高的统计学 方法 被成功应用于科学研究的许多领域 本文报道了利用响应面分析法优化分泌表达青霉素 8 酰化酶的重组枯草芽孢杆菌发酵产酶条件 并且在最佳工艺条件下利用 发酵罐对其重组菌进行扩大培养 较大幅度地提高了青霉素 8 酰化酶的产量 为进一步将该重组菌株应用于工业生产打下基础 材料与方法 材料 菌株分泌表达巨大芽孢杆菌来源青霉素 8 酰化酶的重组枯草芽孢杆菌 &8 由本实验室构建并保存 试剂蛋白胨 酵母膏 可溶性淀粉 南京化学试剂有限公司 为本实验室自制 其他试剂均为国产分析纯试剂 培养基种子培养基 培养基 蛋白胨 酵母 收稿日期 作者简介 仇晶晶 男 安徽合肥人 硕士研究生 主要从事发酵工艺的研究

2 第 期 仇晶晶等 响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素 8 酰化酶 膏 卡那霉素 初始发酵培养基 蛋白胨 酵母膏 可溶性淀粉 卡那霉素 方法 摇瓶培养将菌种通过平板划线法接种至 固体培养基 培养 挑取单克隆接种至 培养基中培养 后接种至含 发酵培养基的 的锥形瓶中 摇床 E 培养 测定酶活力 发酵罐培养 机械搅拌不锈钢发酵罐 镇江东方生物工程设备 型 中装入 优化后的发酵培养基 灭菌后 按 接种量接入种子液 E 连续培养 通气量为 3 为 青霉素 8 酰化酶的酶活测定方法 法 取 酶稀释液加入 E 预热 的 硝基 苯乙酰胺基苯甲酸 溶液中 E 反应 后加入 乙醇终止反应 测定 光吸收值 以磷酸缓冲液代替酶液作为空白对照 酶活定义 上述条件下 水解产生 的 硝基 氨基 苯甲酸 所需青霉素 8 酰化酶的量为一个酶活单位 8 电泳发酵上清液与 按 C 的比例混合 沸水浴 离心 取 上清液上样至 8 胶 电压进行浓缩 电压进行分离 实验设计根据文献报道和前期预实验结果 采用 两水平法对碳源 氮源 无机盐 温度等 个因素进行考察 确定最佳配方 其实验因素 水平如表 本阶段试验设计 数据分析和模型建立皆由 软件辅助完成 最陡爬坡实验根据 实验得出的一次拟合方 程安排最陡爬坡实验 一次拟合方程中 各变量的系数决定爬坡方向和变化步长 如果系数为负 则该因素水平应为递减 反之为递增 系数越大变化步越长 表 & 3 设计因素水平 因素 水平 蛋白胨 酵母膏 淀粉 空白 空白 空白 初始 3 温度 E 发酵时间 摇床转速 种子时间 接种量 中心组合设计实验 以最陡爬坡实验得到的中心点 进行中心组合设计实验 每个因素取 个水平 以 编码实验 对 试验确定的显著因素安排响应面分析试验 本阶段实验设计 数据分析和模型建立皆由 = 辅助完成 实验验证按照中心组合实验所确定的各因素的最优组合配制发酵培养基 进行摇瓶实验 重复做 次 最终的实验结果取这三次实验的平均值 验证模型的可靠性 结 果 实验设计筛选显著因素 实验方案和结果如表 用 软件对试验数据进行分析 得到各因素对响应值 酶活力 & 的影响效果 如表

3 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 表 & 3 实验设计与结果 实验 酶活 & 号 表 实验设计结果分析 项效应系数系数标准误差 值 从表 中可以看到 均小于 说明 这两个因素是显著影响因素 其表明该模型拟合较好 最陡爬坡实验最陡爬坡实验 是一种沿着响应面有最大或最小增量的方向逐步的移动 以便寻找到各因素变化的最优的区域的方法 选取 实验设计所确定的主要影响因素酵母膏和发酵温度 按照实验值变化的梯度方向为爬坡方向 各个因素变化步长依据因素效应值大小和正负确定 在本实验中 其它的非显著因素都按照效应的正负取值 正效应取高水平 负效应取低水平 实验过程和结果如表 表 最陡爬坡实验过程和结果 实验序号酵母膏 温度 E 酶活 & 初始 步长

4 第期 仇晶晶等响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素 V 酰化酶 通过表F可以看出青霉素 V 酰化酶的酶活在 e3时有明显的上升在 e3 能达到最高值 随后在eF3酶活下降这说明培养基的最佳组合 在e3和eF3之间&所以选取 e3 作为后 面实验的中心点& > 中心组合设计实验 依据 T I 实验设计和最陡爬坡 实验所确定的显著影响因素以及最佳的取值范围 进行中心组合设计实验实验中两个因素所取的范 围见表中心组合设计实验设计和结果见表& 表&中心组合设计实验因素与水平 水平 > FF X 酵母膏 3 C> > FF 温度i > F > 表中心组合设计实验设计和结果 C 表回归方程的方差分析结果 来源 自由度 h J] J] M R 回归 > CC> CC> FC> C > 线性 > > > C> > C 平方 C> C> > F> > F > F > F > > C C > FC > FC > F 失拟 > F > F > > C > C 纯误差 F > C > C > C 合计 F> CF 交互 作用 残差 误差 表 C 所示模拟方程中常量项 值为 C 说明该模型是显著的 的 值 C 说明这 两个因素之间有明显的相互作用&dC 表 实验序号 X 3 i 酶活 8IX 明该模型可以用来解释 C j 的实验结果& 表 > FFF 显示该模拟方程失拟项的 值大于 C 这说明 C> 该拟合的回归方程失拟不显著能够很好地拟合该 > FFF 实验因此该模型拟合度较高& 经过回归拟合得到 > 以下的回归方程 C> F C > > C> FF F> F > F C F@C FF@C C 两个因素间交互作用对酶活响应的影响曲面如 图所示该响应曲面图等高线如图所示& 为酵母膏 为温度 注酶活的单位为 8IX 通过软件 I \ 对表 的结果进行分析 分析的结果见表C表& 表中心组合设计实验分析结果 项 系数 系数标准误差 - 因素 CC C C F CC C C C C C C C 如图 F C FF C C > C 求得的 d@c d> 即对应酵母膏为 d> 代表温度 注其中 代表酵母膏 图酵母膏和温度的响应面图 X温 度 为 Fi 时预 测 酶 活 最 高 值 为 > 3 8IX&

5 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 菌体密度变化较小 处于停滞期 菌体生长迅速 青霉素 8 酰化酶也得到了大量的表达 当发酵达到 时 菌体密度和青霉素 8 酰化酶的表达量均达到了最高值 酶活的最高值达到 & 随后随着时间的变化 酶活和菌体密度的变化很微小 基本处于了静止期 酶活表达量较摇瓶最佳产酶量又增加了 图 酵母膏和温度的等高线 验证实验为了验证该模型的准确性 笔者按照上述所给出的最优培养基组合进行 次试验取平均值 测得酶活值为 & 表明优化预测值与实际实验值拟合度可以 达到了 说明该模型的正确性 酶活为优化前的酶活 & 的 倍 比活力为 & 重组青霉素酰化酶的 8 青霉素 8 酰化酶是一种异二聚体蛋白质 包含了一个小的 亚基 和一个较大的 亚基 利用 8 验证目的蛋白 结果如图 所示 目的蛋白条带附合理论值 并且 电泳图中仅含有少量的杂蛋白 表明分泌表达的青霉素 8 酰化酶达到较高的纯度 大大地简化了后续的纯化工作 结 论 图 发酵时间与 8 酶活 菌体湿度的关系 本实验应用响应面法来优化枯草芽孢杆菌产青霉素 8 酰化酶的发酵条件 通过 实验从 种因素中筛选出了主要的影响因素 温度和酵母膏 随后通过最陡爬坡实验和中心组合实验对这两种主要影响因素进行了优化 最终确定的发酵条件为 蛋白胨 酵母膏 可溶性 淀粉 发酵温度为 E 摇床转速 接种量 种子时间 和初始的发酵 3 为 在该条件下 发酵 后 摇瓶中发酵液的最终酶活可以达到 & 较优化前提 泳道 低分子量标准蛋白 泳道 8 图 发酵上清液的 8 发酵罐扩大培养发酵罐扩大培养相对于摇瓶发酵可以提供更充足的通气量 同时也提高了温度 3 等参数的可控性 可以进一步提高菌体生物量和酶的表达量 在响应面分析法优化获得的培养条件基础上进行 发酵罐扩大培养实验 结果如图 所示 发酵过程前 高了 倍 随后又在 的发酵罐中装入 的优化好的发酵培养基进行了扩大培养 当发酵的时间为 左右时最终发酵液中的酶活可以达到 & 相对于摇瓶情况下又提高了将近 倍 在发酵罐培养条件下 发酵上清液中青霉素 8 酰化酶的酶活得到极大的提高 可能是因为在发酵罐中发酵温度 培养基 3 值和培养基中溶氧量能够得到很好的控制 一直维持在细菌最优生长条件 使得

6 第期 仇晶晶等响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素 V 酰化酶 C 枯草芽孢杆菌菌体能够大量的表达目的蛋白&本实 培养基优化中的应用 &>微生物学报C 验基本确定了重组枯草芽孢杆菌在小型发酵罐中高 F > 胡磊许杨>T 杨冀艳 Z W I 设计和响应 面法优化荷叶总黄酮的提取工艺 &>食品科学 效表达青霉素 V 酰化酶的发酵工艺为进一步工业 化放大奠定了基础& 参考文献 > CX G S L 3 X 3 >KI` I h U ] ET> K ] ` ] -\ I \ &> J`` ] M \ 3 ] W 3 =Z>J =Z Q -a ` ] \ ] 3 I ] 3 & >U I ` > J ] X = Z H E M X Z I _ S? > I -` V M \ 3CF > ^3 SM ]J -Ua` 3I >^ 3 I M>北京人民邮电出版社CF F> I \ &>U ] M \ 3 I F C> Z \LW Z T Z _ >? ` F [ >Z> 3 [ &>U V I `>SSMFF ]M \ 3C CFF> I F施晓筊王永红张嗣良等>?K TJW 法测定亲霉素 V 酰化酶酶活力的分析和改进 &>中国医药工业杂志 > 代志凯张 翠阮 征>试验设计和优化及其在发酵 X SW &QS X>R` I - I ] > > = X 3 I \ ` ] \ \ I ] 3 &>&W ` C F> 罗璇钟晓凌王金华等>红酵母产类胡萝卜素提 取工艺的优化研究 & >生物技术 C C F > L V\ pyr &>T ] - ` I ] 3 ` V &>T FCC > XG F R 8 \ 8 M F 3 K G IGE E KR= L=? -X 3 8 S Q3 E I ] 3]] ] ` I I ] ` 3 T V ` ] \ I\ 3 = XX =3 X>K 3 T Z W I I ]]] I I` ] a I 3 3 I3 >L ` I H ] ` ] 3] ` > 8 IXH I` Fi] a > 3 X> I - ` I ] > I I ] > K ] I H ` I ] H X I a`] I 3] ] I` ]I TVJ - I ] 8IXH 3 3 h H Z> C? T V 3 = XX =3 X I ` 责任编辑许惠儿

武洪庆 田 黎 张久明 温占波 用 方法对黄杆菌属产红色素菌株 的培养基进行了优化 首先用部分重复因子实验对培养基组分蛋白胨 酵母粉 葡萄糖及 浓度对菌株产红色素的影 响进行评价 找出主要影响因子为葡萄糖和 浓度 两者均为正影响 其他组分对色素含量的 影响不显著 第二步用最陡爬坡路径逼近最大响应区域 最后用中心组合设计及响应面分析确定主 要影响因子的最佳浓度 菌株在优化培养基中培养较初始培养基色素含量提高

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