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宴充
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1 南京农业大学学报 2015ꎬ38(6): http: / / nauxb.njau.edu.cn Journal of Nanjing Agricultural University doi: / j.issn 任昂 ꎬ 曹鹏飞 ꎬ 吴凤礼 ꎬ 等. 药用模式真菌灵芝小 G 蛋白基因家族的系统性分析 [J]. 南京农业大学学报 ꎬ2015ꎬ38(6): 药用模式真菌灵芝小 G 蛋白基因家族的系统性分析任昂 ꎬ 曹鹏飞 ꎬ 吴凤礼 ꎬ 李梦娇 ꎬ 姜爱良 ꎬ 师亮 ꎬ 赵明文 ( 南京农业大学生命科学学院 / 农业部农业环境微生物重点实验室 ꎬ 江苏南京 ) 摘要 :[ 目的 ] 利用比较基因组学方法 ꎬ 对药用模式真菌灵芝的基因组中的小 G 蛋白基因家族成员进行系统的预测分析和比较 ꎮ [ 方法 ] 利用真菌物种中已经报道的小 G 蛋白 ꎬ 对灵芝全基因组进行 BLAST 分析 ꎬ 筛选出所有灵芝的小 G 蛋白基因 ꎬ 并分析这些同源小 G 蛋白的基本特性 ꎮ 通过小 G 蛋白家族的进化树分析和功能域分析 ꎬ 解析灵芝小 G 蛋白家族成员的进化关系 ꎮ 设计每一个小 G 蛋白同源基因的特异性引物 ꎬ 通过实时荧光定量 PCR 检测小 G 蛋白同源基因的表达 ꎮ [ 结果 ] 在灵芝中发现了 29 个小 G 蛋白家族基因 ꎬ 其中 Ras 亚家族 4 个 ꎬRho 亚家族 4 个 ꎬRab 亚家族 12 个 ꎬArf 亚家族 7 个 ꎬRan 亚家族 1 个 ꎬ 还有 1 个线粒体小 G 蛋白 ꎮ 菌丝体中有 28 个小 G 蛋白基因表达 ꎮ [ 结论 ] 根据真菌中已知的小 G 蛋白系统性地分析了灵芝的小 G 蛋白家族成员 ꎬ 进行灵芝小 G 蛋白的特性分析和基因实时荧光定量 PCR 检测 ꎬ 为下一步研究灵芝小 G 蛋白家族成员的功能奠定基础 ꎮ 关键词 : 灵芝 ꎻ 小 G 蛋白 ꎻ 功能域分析 ꎻ 实时荧光定量 PCR 中图分类号 :Q 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) Systematic characterization of small GTPases gene family in the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum REN AngꎬCAO PengfeiꎬWU FengliꎬLI MengjiaoꎬJIANG AiliangꎬSHI LiangꎬZHAO Mingwen ( College of Life Sciences / Key Laboratory of Microbiological Engineering of Agricultural Environmentꎬ Ministry of AgricultureꎬNanjing Agricultural UniversityꎬNanjing ꎬChina) Abstract:[ Objectives] By using the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum genome databaseꎬthe systematic prediction and characterization of small GTPases gene family were conducted in G lucidum. [ Methods] All small GTPases homologous genes had been identified through the G lucidum genome database blast using the small GTPases of other fungal species. The physical and chemical parameters of all small GTPases were analyzed. The phylogenetic relationship of all small GTPases was also been analyzed. The expression of all small GTPases homologous genes had been detected by real time quantitative PCR. [ Results] Twenty eight small GTPases homologous genes had been found in G lucidum. Four genes belong to the Ras subfamily. Four genes belong to the Rho subfamily. Twelve genes belong to the Rab subfamily. Seven genes belong to the Arf subfamily. One gene belongs to the Ran subfamily. One gene encodes a mitochondrial G protein. Twenty eight genes had gene expression in mycelia. [ Conclusions] All of the small GTPases of G lucidum were systematically characterized and detected by real time quantitative PCR. This work will provide reference for studying on the functions of small GTPases in G lucidum Keywords:Ganoderma lucidumꎻsmall GTPasesꎻfunctional domain analysisꎻreal time quantitative PCR 灵芝 (Ganoderma lucidum) 是一种大型担子菌 ꎬ 因其具有多种药理学活性而得到广泛的关注 [1] ꎮ 灵芝作为药用真菌在我国和东南亚国家有着悠久的应用历史 ꎮ 灵芝酸和灵芝多糖是灵芝的主要药用成分 ꎬ 具有抗氧化抗病毒抗肿瘤降血压和镇痛等活性 [2-3] ꎮ 随着灵芝基因组测序工作的完成以及灵芝转基因过表达技术和基因沉默技术的成功应用 ꎬ 利用分子遗传学实验和生理生化实验共同研究灵芝基础生物学问题成为主要趋势 [4-6] ꎮ 这些研究将有助于通过基因工程手段定向改良灵芝药用品质 ꎬ 加快灵芝功能基因组学的研究进度 ꎬ 推动灵芝成为大型药用担子菌的模式菌 ꎬ 增加其科研和商业价值 [7] ꎮ 小 G 蛋白是真核生物中普遍存在的一类具有 GTP 酶活性的蛋白家族 ꎬ 因其相对分子质量只有 (20 ~ 30) 10 3 ꎬ 相对于 G 蛋白较小 ꎬ 因此称之为小 G 蛋白 [8-9] ꎮ 小 G 蛋白在细胞信号传导过程中具有重要作收稿日期 : 基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2013BAD20B05-04)ꎻ 江苏省科技支撑计划项目 (BE )ꎻ 江苏省博士后科研资助项目 ( B)ꎻ 中国博士后科学基金项目 (2015M570456) 作者简介 : 任昂 ꎬ 讲师 ꎮ 通信作者 : 赵明文 ꎬ 教授 ꎬ 博导 ꎬ 研究方向食药用菌遗传与育种 ꎬE mail:mwzhao@ njau.edu.cnꎮ

2 924 南京农业大学学报第 38 卷用 ꎬ 参与调控真核细胞的生长发育和次生代谢等生理过程 [10-12] ꎮ 在前期研究茉莉酸甲酯诱导灵芝转录组变化的过程中 ꎬ 筛选到一个小 G 蛋白 rho 基因 [13] ꎮ 灵芝 rho 可能参与调控灵芝的次生代谢 ꎮ 为了系统地研究灵芝小 G 蛋白的生物学特性 ꎬ 本论文从灵芝基因组中筛选所有小 G 蛋白的同源基因 ꎬ 并进一步分析灵芝所有小 G 蛋白同源蛋白的生物学特性 ꎬ 为深入研究灵芝小 G 蛋白的功能提供理论基础 ꎮ 1 材料与方法 1.1 菌株和培养条件灵芝 (Ganoderma lucidum) 菌株 HGꎬ 由上海市农业科学院食用菌研究所提供 ꎬ 保存在 PDA 培养基斜面上 ꎮ 灵芝菌丝体接种于 PDB 培养基中 ꎬ 摇床 150 r min 恒温培养 7 dꎮ 1.2 灵芝小 G 蛋白同源基因的筛选利用 NCBI 蛋白数据库中已知的真菌小 G 蛋白 ( Saccharomyces cerevisiae DAA10456 P48559 Q02804 P06780 NP_ NP_ 和 Magnaporthe oryzae EHA49014 EHA57036 XP_ XP_ ) 进行 BLASTp 检索 ( E 值小于 E -05 ) 灵芝基因组数据库 ( http: / / www. herbalgenomics. org / galu) [4] ꎮ 根据小 G 蛋白的保守功能域 ꎬ 将上述检索到的基因编码蛋白进行 SMART( http: / / smart. embl heidelberg.de / ) 和 Pfam [14] ꎬ 再次确认灵芝小 G 蛋白同源蛋白的编码基因 ꎮ [15] 1.3 灵芝小 G 蛋白同源基因编码蛋白的生物信息学分析灵芝小 G 蛋白同源基因及其编码蛋白的基本特性分析将筛选到的灵芝小 G 蛋白同源基因进行 BLASTn 比对灵芝基因组数据库 ꎬ 确定同源基因在灵芝染色体上的分布情况以及基因长度和 cdna 长度 ꎮ 对灵芝小 G 蛋白进行蛋白质氨基酸残基数相对分子质量和等电点的预测 ( http: / / / tools / pi_tool.html)ꎮ 将所有预测的灵芝小 G 蛋白 BLASTp 比对 NCBI 的 Non redundant protein sequences (nr) 数据库 ꎬ 分析灵芝小 G 蛋白的保守功能域 ꎮ 灵芝小 G 蛋白的系统进化树分析利用 CLUSTALW 对灵芝 (G lucidum) 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 构巢曲霉 (Aspergillus nidulans) 新型隐球菌 ( Crytococcus neoformans) 和稻瘟病菌 ( Magnaporthe oryzae) 的小 G 蛋白进行多重比较分析 ꎮ 系统进化树使用 MEGA 6.0 软件采用 Neighbor joining 法进行构建 (1 000 bootstrap repetitions)ꎮ 灵芝小 G 蛋白同源蛋白的亚细胞定位预测利用 SOFTBERRY 网站 (http: / / / ) 的 ProtComp 9.0 软件进行灵芝小 G 蛋白的亚细胞定位预测分析 ꎮ 1.4 灵芝小 G 蛋白同源基因的荧光定量 PCR 检测灵芝 cdna 制备灵芝新鲜菌丝用去离子水冲洗干净后 ꎬ 液氮充分研磨 ꎮ 灵芝总 RNA 使用 RNAiso plus(takaraꎬ 大连 ) 提取 ꎮ 随后使用 RNase free DNaseⅠ 消化处理 ꎬ 防止基因组 DNA 污染 ꎮ 灵芝 cdna 合成使用 cdna mixture(takaraꎬ 大连 )ꎮ 灵芝小 G 蛋白同源基因的荧光定量 PCR 检测参照荧光定量 PCR 的方法 [16] ꎬ 进行 PCR 扩增 ꎮ 荧光定量 PCR 引物见表 1ꎮ PCR 反应体系为 :SYBR GreenⅠMix 10 μlꎬ 上下游引物 (10 μmol L -1 ) 各 0.5 μlꎬcdna 1.5 μlꎬddh 2 O 7.5 μlꎬ 总体积为 20 μlꎮ 荧光定量 PCR 反应条件 :95 10 minꎻ95 15 sꎬ 60 1 minꎬ 循环 40 次 ꎻ95 ꎬ15 sꎬ60 ꎬ15 sꎬ60 升温至 95 ꎬ20 minꎻ95 ꎬ15 sꎬ10 ꎬ1 minꎮ 根据扩增曲线和熔解曲线检测引物的扩增情况 ꎮ 表 1 Table 1 本试验使用的荧光定量 PCR 引物 The primer sets used for real time PCR GlsG01 GlsG02 GlsG03 GlsG04 5 CGGCACCTCAAGAACGA 3 5 TCCAGCCCACAAACCAG 3 5 GTTGCCGTTCTTGGTGA 3 5 CCTCTTGTCCTGCCGTAT 3 5 GTCAACGAGCCGTCCAG 3 5 AGCGGTGTCCCATAAGC 3 5 TAACTACTCGGCGAATGTC 3 5 GGAGAAGCAGATGAGGAAG 3 GlsG16 GlsG17 GlsG18 GlsG19 5 ACGATTGAGCGAGGGTT 3 5 CGGACAGGCTATGAGGG 3 5 GTTCACGACCTACGACTTGG 3 5 CTCCGCCTTGGACTCTG 3 5 TGACGCCCTCCTCCTCG 3 5 CGCTCAGCCACTCAAGAC 3 5 ACCTCAGCAATCATTTACG 3 5 GCAAGTCCAAGTTTCTCG 3

3 第 6 期任昂 ꎬ 等 : 药用模式真菌灵芝小 G 蛋白基因家族的系统性分析 925 续表 1 Table 1 continued GlsG05 GlsG06 GlsG07 GlsG08 GlsG09 GlsG10 GlsG11 GlsG12 GlsG13 GlsG14 GlsG15 5 GGAATATGAACGACTACGGC 3 5 CGGACCTCTTCTATCCACTT 3 5 CACCTACCAAGCAACGA 3 5 GCTACAGAACAGTCACGAAT 3 5 GACCGACTGGTAACGATG 3 5 TGTGGGCTTGCTTGGAT 3 5 CTTGTGCTGCGTTTCGT 3 5 AGTTGGCATTGCGGTAG 3 5 GGTCGTTTAACAACATCCG 3 5 CGCTTCTCATTCCAGTCG 3 5 TCACGACGGGATACAGGG 3 5 GCGGAAGAAGGCAGAGG 3 5 CAGCCTCTTGCTCCGATTC 3 5 GCTTGACCTTCTTTCCCTTGA 3 5 GAGCGGTTTCGTAGCAT 3 5 CTTCTTGAGTTCTGTGGTGAT 3 5 CAAACGCAGATGACCCG 3 5 TCCTCCTTCGCCCACAG 3 5 GGGTGAATTTGAGAAGAAG 3 5 GTATCCCAGACATTGAAGC 3 5 CGCTCTGGAGGCATTAC 3 5 GACACTCTTTCATTTCCCTAT 3 GlsG20 GlsG21 GlsG22 GlsG23 GlsG24 GlsG25 GlsG26 GlsG27 GlsG28 GlsG29 5 CGACCTACAGAGCAGACA 3 5 GGCTCCACCTTGTTACTT 3 5 TCAACCTGTTTACCACCAA 3 5 CGAGGCAACTGCGTCTGT 3 5 GCTTCCTATGCCCTAAATT 3 5 GGGTTGCCTGGTGATGT 3 5 GCTGCGGTATGAGATTTGG 3 5 CGAGACTGGATGCCTTTGT 3 5 GGAATATGAACGACTACGGC 3 5 CGGACCTCTTCTATCCACTT 3 5 AAGGATGGCGATGAGGA 3 5 CGTGGAACACTTCGTTGA 3 5 TTAGCACCTTCCACCAAC 3 5 AACGCCTCGTCAACATTA 3 5 TCAAGGGCTGGCTACAA 3 5 TGCGACCGAATACTCAAT 3 5 CACAGAGGAGGCGAAGA 3 5 CAGTGAGGATGGTTTGGA 3 5 CGGAAGAACAGGCAGAA 3 5 GTTGAAGCCCAGCGTAG 灵芝小 G 蛋白同源基因的 PCR 产物电泳检测制备 20 g L -1 的琼脂糖凝胶 ( 含溴化乙锭 1 μg ml -1 )ꎬ 将荧光定量 PCR 扩增的产物进行电泳 (120 Vꎬ30 min)ꎬ 在紫外凝胶成像仪上进行拍照并保存 ꎮ 2 结果与分析 2.1 灵芝小 G 蛋白家族成员的预测和基本特性分析根据目前已经报道的真菌小 G 蛋白进行蛋白同源比对 ꎬ 我们在灵芝基因组中一共检索到 29 个小 G 蛋白的同源编码基因 ( 表 2)ꎮ 这些同源蛋白分别命名为 GlsG01 ~ GlsG29ꎮ 灵芝小 G 蛋白的基因全长大部分分布于 800 ~ bpꎬcdna 全长大部分分布于 450 ~ 750 bpꎬ 只有 GlsG12 GlsG21 和 GlsG22 的基因全长和 cdna 全长相对较大 ꎮ 29 个小 G 蛋白编码基因在灵芝 12 条染色体上的分布数量也存在显著差异 ꎮ 染色体 Chr3 Chr1 和 Chr4 上别为存在 7 5 和 4 个小 G 蛋白编码基因 ꎬ 染色体 Chr11 上没有发现小 G 蛋白编码基因 ꎬ 其他染色体上存在 1 ~ 2 个小 G 蛋白编码基因 ꎮ 灵芝小 G 蛋白同源蛋白的理论等电点主要分布在 4.60 ~ 7.60 之间 ꎬ 只有 GlsG02 GlsG12 和 GlsG15 的理论等电点为和 9.34ꎮ 编号 No. Table 2 基因组编号 ID in genome 表 2 灵芝小 G 蛋白家族 29 个成员的编码基因及其蛋白质特性 The encoding genes and protein properties of 29 small GTPases of Ganoderma lucidum 基因长度 / bp Gene length 染色体定位 Chromosome location cdna 长度 / bp cdna length 氨基酸残基数 Number of amino acid residues 理论等电点 Theoretical isoelectric point 蛋白相对分子质量 / 10 3 Relative molecular mass GlsG01 Gl Chr GlsG02 Gl Chr GlsG03 Gl Chr GlsG04 Gl Chr GlsG05 Gl Chr GlsG06 Gl Chr GlsG07 Gl Chr GlsG08 Gl Chr GlsG09 Gl Chr GlsG10 Gl Chr GlsG11 Gl Chr GlsG12 Gl Chr GlsG13 Gl Chr GlsG14 Gl Chr GlsG15 Gl Chr

4 ９２６南京农续表２编号Ｎｏ. 基因组编号ＩＤｉｎｇｅｎｏｍｅ基因长度 / ｂｐＧｅｎｅｌｅｎｇｔｈＧｌｓＧ６ＧｌｓＧ７ＧｌｓＧ８ＧｌｓＧ９ＧｌｓＧ２ＧｌｓＧ２ＧｌｓＧ２２ＧｌｓＧ２３ＧｌｓＧ２４ＧｌｓＧ２５ＧｌｓＧ２６ＧｌｓＧ２７ＧｌｓＧ２８ＧｌｓＧ２９Ｇｌ２５２２Ｇｌ２４８７Ｇｌ２６６７Ｇｌ２６７５Ｇｌ２６７３６Ｇｌ２７８５４Ｇｌ２３６５６Ｇｌ２９９２Ｇｌ２３９４Ｇｌ２５７９Ｇｌ２５８５９Ｇｌ２２８４３Ｇｌ２２８２９Ｇｌ２６５４２９６９９５６８５９９２９９７６４６３６８２７７２４７９４２.２２染色体定位Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｌｏｃａｔｉｏｎ业大灵芝小Ｇ蛋白家族成员的进化关系学第３８卷报Ｔａｂｌｅ２ｃｏｎｔｉｎｕｅｄｃｄｎａ长度 / ｂｐｃｄｎａｌｅｎｇｔｈＣｈｒ５Ｃｈｒ４ＣｈｒＣｈｒＣｈｒＣｈｒ２Ｃｈｒ７Ｃｈｒ３Ｃｈｒ２Ｃｈｒ５Ｃｈｒ８ＣｈｒＣｈｒＣｈｒ学６４５５９５４６４８３５６４３７７２２７５６６６９６３６５６２６３９６２４氨基酸残基数Ｎｕｍｂｅｒｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ２４９６８６８７３７８５７３２５２２２２２６２６２２２７理论等电点蛋白相对分子质量 / ３ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＲｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔ５.８３５.５４６.７５５.９６.６４.６８５.４６４.８８６.８９６.４５５.８４.５９５.８３６.８４２４.５２２.３２.５７.８２.８４４.９６６.９２６.９２４.２２３. ２４. ２２.８２３.３２３.４将２９个灵芝小Ｇ蛋白的同源蛋白与其他真菌中已报道的小Ｇ蛋白构建系统进化树ꎬ结果如图所示ꎮ ２９个灵芝小Ｇ蛋白家族成员中有２８个分别属于Ｒａｓ(４个) Ｒｈｏ(４个) Ｒａｂ(２个) Ａｒｆ( ７个) 和Ｒａｎ( 个)５个亚家族ꎬ还有个ＧｌｓＧ２２不在已知的５个亚家族内ꎮ 根据进化树可以看出ꎬ在每一个亚家族内很多分支的引导值较高ꎮ 这表明:真菌的小Ｇ蛋白家族成员结构较为保守ꎬ可能来自共同的祖先ꎮ 图Ｆｉｇ真菌小Ｇ蛋白的系统发生树分析ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｕｔａｔｉｖｅｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅｓｉｎｆｕｎｇｉＳｃ:酿酒酵母ꎻＭｏ:稻瘟病菌ꎻＡｎ:构巢曲霉ꎻＧｌ:灵芝ꎻＣｎ:新型隐球菌ꎮ 蛋白的号放在蛋白名称的后面ꎮ Ｓｃ:Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅꎻｍｏ:ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅꎻａｎ:ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓꎻｇｌ:ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍꎻｃｎ:ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ. ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎＩＤｓａｒｅｆｏｌｌｏｗｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅｓ.

5 第６期２.３９２７任昂ꎬ等:药用模式真菌灵芝小Ｇ蛋白基因家族的系统性分析灵芝小Ｇ蛋白家族成员的功能域分析针对灵芝的小Ｇ蛋白家族２９个成员进行蛋白结构域分析ꎬ结果见图２ꎮ 所有灵芝小Ｇ蛋白都具有Ｇｂｏｘ结构和ＳｗｉｔｃｈⅠ( Ⅱ) 结构域ꎮ 灵芝小Ｇ蛋白ＧｌｓＧ４ＧｌｓＧ６ＧｌｓＧ２ＧｌｓＧ９都含有４个Ｇｂｏｘꎬ ＧｌｓＧ２含有３个Ｇｂｏｘꎬｇｌｓｇ２２含有８个Ｇｂｏｘꎬ其他小Ｇ蛋白均含有５个Ｇｂｏｘꎮ 除了ＧｌｓＧ４ＧｌｓＧ６和ＧｌｓＧ２外ꎬ其他小Ｇ蛋白都含有ＧＴＰ / Ｍｇ２结合位点ꎮ ＧｌｓＧＧｌｓＧ６ＧｌｓＧ７ＧｌｓＧ８ＧｌｓＧ９ＧｌｓＧＧｌｓＧ２ＧｌｓＧ３ＧｌｓＧ２３ＧｌｓＧ２７和ＧｌｓＧ２８这个小Ｇ蛋白含有Ｒａｂ家族元件ꎮ 这与进化树分析结果一致ꎬ这些小Ｇ蛋白都属于Ｒａｂ亚家族ꎮ 图２Ｆｉｇ２灵芝小Ｇ蛋白家族成员的功能域分析ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｓｏｆｐｕｔａｔｉｖｅｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅｓｉｎＧｌｕｃｉｄｕｍ红色盒子代表ＧＴＰ / Ｍｇ２结合位点ꎻ黄色盒子代表Ｇｂｏｘꎻ蓝色盒子代表ＳｗｉｔｃｈⅠ( Ⅱ) 区ꎻ紫色盒子代表Ｒａｂ家族元件( ＲａｂＦ) ꎮ ＲｅｄｂｏｘｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＧＴＰ / Ｍｇ２ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅꎻｙｅｌｌｏｗｂｏｘｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＧｂｏｘꎻｂｌｕｅｂｏｘｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＳｗｉｔｃｈ Ⅰ( Ⅱ) ｒｅｇｉｏｎꎻｐｕｒｐｌｅｂｏｘｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＲａｂｆａｍｉｌｙｍｏｔｉｆ( ＲａｂＦ). ２.４灵芝小Ｇ蛋白家族成员的亚细胞定位预测利用ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ网站提供的真菌蛋白亚细胞定位分析功能对灵芝中２９个小Ｇ蛋白同源基因进行了亚细胞定位分析ꎬ结果如表３所示ꎮ 灵芝小Ｇ蛋白亚细胞定位分布最主要的３个区域是高尔基体细胞质和质膜ꎮ 除此之外ꎬＧｌｓＧ４位于细胞核ꎬＧｌｓＧ２２位于线粒体ꎬＧｌｓＧ７和ＧｌｓＧ位于液泡ꎮ 表３Ｔａｂｌｅ３灵芝小Ｇ蛋白家族２９个成员的亚细胞定位Ｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ２９ｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅｓｏｆＧｌｕｃｉｄｕｍｕｓｉｎｇｓｏｆｔｂｅｒｒｙａｎａｌｙｓｉｓ亚细胞定位Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ细胞核Ｎｕｃｌｅａｒ质膜Ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ胞外分泌Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ细胞质ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＧｌｓＧ７.５７.８２. ７.４ＧｌｓＧ３２.４３３.３ＧｌｓＧ５２.７ＧｌｓＧ２ＧｌｓＧ４ＧｌｓＧ６ＧｌｓＧ７ＧｌｓＧ８ＧｌｓＧ９５.４２.５３.４７５.７３７.３３.７２５. ２３.２２６.５.８.５６.３.２２４. ４..２２７. 线粒体内质网( 膜) ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ( ｍｅｍｂｒａｎｅ) ２.４...３过氧化物酶体Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ溶酶体Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ８.７.９.８. 高尔基体液泡ＧｏｌｇｉＶａｃｕｏｌａｒ４.７.７４.２.２４５.３４６.４５.７.６.２. ２４.９４６.７２４.５８.２９８.８.４

928 南京农业大学学报第 38 卷续表 3 Table 3 continued 亚细胞定位 Subcellular localization 细胞核 Nuclear 质膜 Plasma membrane 胞外分泌 Extracellular 细胞质 Cytoplasmic 线粒体 Mitochondrial 内质网 ( 膜 ) Endoplasmic reticulum (membrane)

6 928 南京农业大学学报第 38 卷续表 3 Table 3 continued 亚细胞定位 Subcellular localization 细胞核 Nuclear 质膜 Plasma membrane 胞外分泌 Extracellular 细胞质 Cytoplasmic 线粒体 Mitochondrial 内质网 ( 膜 ) Endoplasmic reticulum (membrane) 过氧化物酶体 Peroxisomal 溶酶体 Lysosomal 高尔基体 Golgi 液泡 Vacuolar GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG GlsG 灵芝小 G 蛋白家族成员的实时荧光定量 PCR 检测针对灵芝 29 个小 G 蛋白同源设计特异性实时荧光定量 PCR 引物 ꎬ 利用灵芝 cdna 进行实时荧光定量 PCR 检测 ꎮ 实时荧光定量 PCR 的扩增曲线结果表明 : 除了 GlsG12 没有扩增出 PCR 产物外 ꎬ 其他小 G 蛋白同源基因都能够扩增到特异性产物 ꎮ 熔解曲线结果也表明 : 除了 GlsG12 没有检测到信号峰外 ꎬ 其他基因的扩增产物都是单一峰型 ꎬ 表明实时荧光定量 PCR 扩增产物单一 ꎮ 图 3 显示了实时荧光定量 PCR 产物的电泳检测结果 ꎮ 结果表明 :GlsG12 没有检测到 PCR 扩增产物 ꎬ 这一结果和实时荧光定量 PCR 的扩增曲线结果一致 ꎮ GlsG01 ~ GlsG29 均是单一条带 ꎬ 产物大小与预期大小一致 ꎮ 这些结果表明 ꎬGlsG12 基因可能在灵芝菌丝体中不表达 ꎬ 其他的灵芝小 G 蛋白同源基因在灵芝菌丝体中都有表达 ꎮ Fig 3 图 3 灵芝小 G 蛋白同源基因的实时荧光定量 PCR 产物检测 Detection of the real time quantitative PCR production of small GTPases encoding genes in G lucidum M:DNA 分子质量标准 ꎻ 泳道 1 ~ 29 分别对应灵芝小 G 蛋白 GlsG01 ~ GlsG29 的 PCR 产物 ꎮ M:DNA markerꎻline 1-29 represent the production of PCR from GlsG01-GlsG29. 3 讨论小 G 蛋白家族在真核细胞中广泛存在 ꎬ 并且家族成员众多 ꎬ 参与调控细胞多种生理功能 [8-9ꎬ11] ꎮ 相对于动植物中小 G 蛋白的研究 ꎬ 真菌中报道的相对较少 [12] ꎮ 目前真菌小 G 蛋白报道最多的物种是酿酒酵母 ꎮ 根据 NCBI 蛋白数据库中的信息 ꎬ 酿酒酵母中至少存在 35 个已知的小 G 蛋白 ꎮ 本研究首次系统地筛选了灵芝中的小 G 蛋白 ꎮ 灵芝中该家族共有 29 个成员 ꎬ 其中 28 个属于已知的 5 个亚家族中 ꎮ 根据同源比对结果和亚细胞定位分析可以得出 ꎬGlsG22 是灵芝唯一一个定位于线粒体的小 G 蛋白 ꎮ 灵芝小 G 蛋白的进化关系和蛋白结构功能域表明 ꎬ 灵芝小 G 蛋白家族和其他真菌小 G 蛋白一致 ꎬ 具有较高的保守性 ꎮ

7 第 6 期任昂 ꎬ 等 : 药用模式真菌灵芝小 G 蛋白基因家族的系统性分析 929 随着小 G 蛋白功能研究的深入 ꎬ 小 G 蛋白信号通路成为细胞信号转导研究的热点问题 ꎮ 小 G 蛋白 Arf1 通过 GTP / GDP 分子开关功能调控线粒体的形态和功能 [11] ꎮ 在灰霉病菌中 ꎬ 小 G 蛋白 rho3 调控了细胞生长分生孢子形成以及菌株毒力 [12] [13] ꎮ 在研究茉莉酸甲酯调控灵芝酸生物合成的工作中 ꎬRen 等通过比较转录组差异筛选到一个小 G 蛋白编码基因 rhoꎬ 并推测小 G 蛋白信号通路可能参与了灵芝酸生物合成的调控 ꎮ 本文系统地筛选了灵芝小 G 蛋白家族的 29 个成员 ꎬ 为下一步系统性研究小 G 蛋白信号通路调控灵芝酸的生物合成提供的保障 ꎮ 大型担子真菌在菌丝生长发育木质素降解子实体形成和次生代谢等生理功能上具有很多特性 [7ꎬ16] ꎮ 灵芝作为大型担子真菌的模式菌株 ꎬ 系统地研究其各类家族基因的特性和功能使得解析大型担子真菌的特殊调控机制成为可能 ꎮ 灵芝小 G 蛋白家族成员不仅数量多 ꎬ 达 29 个 ꎬ 并且亚细胞定位预测显示这些小 G 蛋白分布在高尔基体胞质细胞膜细胞核和线粒体等位置 ꎮ 这些结果都暗示 : 小 G 蛋白家族成员的功能较为复杂 ꎬ 因此 ꎬ 我们将针对小 G 蛋白家族在灵芝生理功能上的调控作用开展系统性研究 ꎮ 参考文献 Reference: [1] Hajjaj HꎬMace CꎬRoberts Mꎬet al. Effect of 26 oxygenosterols from Ganoderma lucidum and their activity as cholesterol synthesis inhibitors[ J]. Appl Environ Microbiolꎬ2005ꎬ71(7): [2] Joseph SꎬSabulal BꎬGeorge Vꎬet al. Antitumor and anti inflammatory activities of polysaccharides isolated from Ganoderma lucidum[ J]. Acta Pharmꎬ2011ꎬ61(3): [3] Xu ZꎬChen XꎬZhong Zꎬet al. Ganoderma lucidum polysaccharides:immunomodulation and potential anti tumor activities[ J]. Am J Chin Medꎬ 2011ꎬ39(1):15-27 [4] Chen SꎬXu JꎬLiu Cꎬet al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum[ J]. Nature Communꎬ2012. doi: / ncomms1923 [ 5] Mu DꎬShi LꎬRen Aꎬet al. The development and application of a multiple gene co silencing system using endogenous URA3 as a reporter gene in Ganoderma lucidum[ J]. PLoS ONEꎬ2012ꎬ7(8):e43737 [6] Shi LꎬFang XꎬLi Mꎬet al. Development of a simple and efficient transformation system for the basidiomycetous medicinal fungus Ganoderma lucidum[ J]. World J Microbiol Biotechnolꎬ2012ꎬ28(1): [7] Mu DꎬLi CꎬZhang Xꎬet al. Functions of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family in Ganoderma lucidum:an essential role in ganoderic acid biosynthesis regulationꎬhyphal branchingꎬfruiting body developmentꎬand oxidative stress resistance[ J]. Environ Microbiolꎬ 2014ꎬ16(6): [8] Vernoud VꎬHorton A CꎬYang Zꎬet al. Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis[ J]. Plant Physiolꎬ2003ꎬ131( 3): [9] 石佰丽 ꎬ 吕梦燕 ꎬ 赵秋雁. 小 GTPase 蛋白家族的研究进展 [J]. 安徽农业科学 ꎬ2012ꎬ40(5): ꎬ2573 [Shi B LꎬLü M YꎬZhao Q Y. Research progress of the small GTPase family[ J]. Journal of Anhui Agricultural Sciencesꎬ2012ꎬ40(5): ꎬ2573( in Chinese with English abstract)] [ 10] Lickfeld MꎬSchmitz H P. A network involving Rho type GTPasesꎬa paxillin and a formin homologue regulates spore length and spore wall integrity in the filamentous fungus Ashbya gossypii[j]. Mol Microbiolꎬ2012ꎬ85(3): [ 11] Ackema K BꎬHench JꎬBöckler Sꎬet al. The small GTPase Arf1 modulates mitochondrial morphology and function[ J]. EMBO Jꎬ2014ꎬ33(22): [12] An BꎬLi BꎬQin Gꎬet al. Function of small GTPase Rho3 in regulating growthꎬconidiation and virulence of Botrytis cinerea[j]. Fungal Genet Biolꎬ 2015ꎬ75:46-55 [13] Ren AꎬLi M JꎬShi Lꎬet al. Profiling and quantifying differential gene transcription provide insights into ganoderic acid biosynthesis in Ganoderma lucidum in response to methyl jasmonate[j]. PLoS ONEꎬ2013ꎬ8(6):e65027 [14] Finn R DꎬBateman AꎬClements Jꎬet al. The Pfam protein families database[ J]. Nucleic Acids Researchꎬ2014ꎬ42:D222-D230 [15] 李伟 ꎬ 王龙超 ꎬ 曹金花 ꎬ 等. 大豆基因组 CLC 同源基因家族的生物信息学分析 [ J]. 南京农业大学学报 ꎬ2014ꎬ 37 ( 3): doi: / j.issn [Li WꎬWang L CꎬCao J Hꎬet al. Bioinformatics analysis of CLC homologous genes family in soybean genome[j]. Journal of Nanjing Agricultural Universityꎬ2014ꎬ37(3):35-43(in Chinese with English abstract)] [16] Ren AꎬLi X BꎬMiao Z Gꎬet al. Transcript and metabolite alterations increase ganoderic acid content in Ganoderma lucidum using acetic acid as an inducer[ J]. Biotechnol Lettꎬ2014ꎬ36(12): 责任编辑 : 刘怡辰

标题

吉林农业大学学报２０１６３８１８７９１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｈｔｔｐｘｕｅｂａｏｊｌａｕｅｄｕｃｎＥｍａｉｌｊｌｎｄｘｂｖｉｐｓｉｎａｃｏｍ神经生长因子ｍｒｎａ在鹅等级前卵泡中的表达刘璐璐隋玉健朱海洋武惠岩杨辉孙永峰吉林农业大学动物科学技术学院长春１３０１１８