40 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No 公司产品 高渗溶液改良的 HM 溶液 (%):NH 4 Cl0.1, Tris1.2,KCl0.0035,NaCl0.0058,Na 2 SO 4 10H 2 O 0.03,MgCl 2 5H

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2007,27(10):39~43 全基因组重排育种技术提高豆豉 纤溶酶菌产酶量 梁惠仪 ( 华南理工大学生物科学与工程学院省重点实验室广州 ) 郭 勇 摘要枯草芽孢杆菌 DC?12 是从豆豉里面筛选出来的, 具有纤溶酶活性的菌株 采用了全基因组重排技术提高 DC?12 的产酶量, 首先通过对 DC?12 进行紫外诱变和亚硝酸诱变构建重组突变库, 在研究其原生质体制备和再生的基础上, 以其中 4 株诱变菌株作为直接亲本, 采用电融合的方法进行两次多亲本的全基因组重排, 结合双灭活的筛选方法, 共筛选出 2 株酶活大大提高并能稳定遗传的菌株, 使亲本菌株的酶活提高了 4~5 倍, 最高达 2710IU/ml 关键词基因组重排灭活电融合中图分类号 Q813 豆豉纤溶酶是从中国传统的大豆发酵食品 豆豉中发现的新型纤溶酶 这种酶不仅具有较高的纤溶活性, 而且无毒副作用, 不引起内出血, 在体内半衰期长 因此豆豉纤溶酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品, 都具有十分重要的开发价值 本课题组从传统食品豆豉中筛选出来的枯草芽孢杆菌 DC?12, 所产生的纤溶酶能高效地溶解体外血栓, 具有十分重要的开发价值 由于野生型菌株的酶活偏低, 而经过多次循环诱变育种, 菌株容易产生疲劳效应 [1] 基因组改组技术 (genomeshufling) 通过传统诱变与细胞融合技术相结合, 对微生物细胞进行基因组重排, 从而大幅度提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度, 使人们能够快速选育出高效的正向突变菌株 [2,3] 具体方法是首先选择一个原始亲株, 通过经典育种法获得多个具有提高表型的菌株构建突变候选株文库, 作为首轮多亲株融合的直接亲株, 然后进行多亲株融合, 获得第一代融合株, 再从中选择进一步获得表型提高的菌株作为第二轮融合的直接亲本, 以此类推进行多轮的多亲株融合 通过对整个基因组的不同位点的循环重组, 将亲株的多个优良表型通过多轮收稿日期 : 修回日期 : 广州市重点资助项目 (2004Z2-E2042) 电子信箱 :lhycareer@163.com 的随机重组于同一株菌株 基因组改组技术不必要了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息, 却能优化大多数工业产物的代谢途径和表型, 操作直接, 时间短, 非常适合于工业应用 由于重组得到的菌株和基因修饰的有机体是不同的, 可以直接用于保健品和食品工业 [4,5] 本文通过紫外线诱变和亚硝酸诱变构建了产豆豉纤溶酶野生型菌株的突变库, 在优化原生质体融合条件的基础上, 以诱变菌株作为直接亲本, 进行全基因组重排, 以提高纤溶酶的产量和活性 1 材料和方法 1.1 材料 亲本菌株由野生型纤溶酶产生菌 DC?12 通过紫外诱变出来的 U8,U10 和通过亚硝酸诱变出来的 N8,N10, 枯草芽孢杆菌属 菌体生长培养基采用营养肉汤培养基 出发菌和重组菌的发酵培养基 2% 葡萄糖, 2% 大豆蛋白胨,0.2% Na 2 HP0 4,0.1% NaH 2 P0 4, 0.02% CaCl 2,0.05% MgS0 4,pH 牛纤维蛋白原牛凝血酶 溶菌酶溶液用无菌药匙准确称取适量溶菌酶于无机试管内, 加入适量高渗溶液使溶菌酶的浓度达 1.0mg/ml, 常温下振荡溶解, 备用 溶菌酶为 Sigma

2 40 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No 公司产品 高渗溶液改良的 HM 溶液 (%):NH 4 Cl0.1, Tris1.2,KCl0.0035,NaCl0.0058,Na 2 SO 4 10H 2 O 0.03,MgCl 2 5H 2 O0.426, 葡萄糖 0.2, 蔗糖 , ph 再生培养基 (DM 3 ) 下层 1mol/L 琥珀酸钠 500ml,5% 水解酪蛋白 100ml,10% 酵母膏 50ml,3.5% KH 2 PO 4 和 1.5% K 2 HPO 4 100ml,20% 葡萄糖 25ml, 1mol/LMgSO 4 20ml,2% 牛血清蛋白 5ml,4% 琼脂 200ml,pH7.0, Pa,20min 灭菌 上层,0.6% 琼脂糖, 其余同上 双层纤维蛋白平板的配置移取约 10ml2% 琼脂溶液于平板中, 冷却凝固后形成第一层 将 25ml 纤维蛋白原溶液与 40ml1.0% 的无菌琼脂糖溶液 (0.4 g 琼脂糖溶解于 40ml 巴比妥钠?HCl 缓冲液 ) 中, 于 50 充分混合, 迅速加入 0.5ml20IU/ml 人凝血酶, 混匀后向每个琼脂平板移取 15ml, 形成双层纤维蛋白平板 该配制方法能够确保每个平板的厚度均一, 从而减少实验误差 [6,7] 主要实验设备冷冻离心机 (5180R, Eppendorf), 电转仪 (BIO?RAD) 1.2 方法 纤溶酶活性的测定测定时, 取 10μl100IU/ml 的尿激酶作对照, 计算出样品酶活 : 样品溶栓圈垂直直径乘积 100 样品酶活 (IU/ml)= 尿激酶溶栓圈垂直直径乘积 尿激酶标准曲线 : 将尿激酶标准品溶于 ph7.8 巴比妥钠缓冲液中, 配制成 10IU/ml 20IU/ml 30IU/ml 40IU/ml 50IU/ml 60IU/ml 70IU/ml 80IU/ml 90IU/ ml 100IU/ml, 分别取 10μl 样品点于纤维蛋白平板上, 置于 37 恒温培养 18h, 测量其溶栓圈直径 以溶栓圈直径乘积 (cm 2 ) 为横坐标, 尿激酶浓度 (IU/ml) 为纵坐标, 作出尿激酶标准曲线 ( 图 1) 测得样品的溶栓圈垂直直径乘积后, 可通过标准曲线计算其溶栓活性 得出计算纤溶活性的回归方程 : y=1.0343x ,r 2 = 本试验用酶活 (IU/ml) 表示纤溶酶产量, 即每分钟催化 1μmol 的底物转化为产物所需的酶量定义为 1 个酶活力单位 原生质体制备和再生方法 [8] (1) 将亲本菌株分别接种到 LB 完全固体培养基上, 活化 24h, 再接种到 LB 液体培养基中,37,180r/min, 培养 20h, 然后按 图 1 尿激酶活性浓度标准曲线 Fig.1 StandardcurveofUK concentrationofactivity 4% 的接种量接入到装有 40mlLB 液体培养基的 100ml 三角瓶中,37,180r/min, 继续活化培养 6~12h, 至 OD 约为 0.8 (2) 培养结束后立即取下摇床,5000r/ min 下离心 8min, 弃去上清液, 用生理盐水洗涤 2 次后, 再用 HM 液洗涤 1 次, 最后用 HM 液悬浮, 制成 2~ 个 /ml 的菌悬液, 取一定量的菌体做适当稀释涂完全平板计总菌数 ( 活菌计数 ) 此数为 A (3) 其余 HM 液悬浮的菌悬液转移至小三角瓶 (100ml) 中, 再加入溶菌酶, 置 37 于水浴中保温酶解一定时间, 并低速振荡 (4) 酶解完毕后取立即离心, 弃去上清液, 用 HM 液洗涤 1 次, 最后悬浮于等体积的 HM 液中 (5) 取上述原生质体液各 0.5ml, 分别用无菌水和 HM 液进行系列稀释, 用最后三个稀释浓度涂布平板, 无菌水稀释液涂 LB 平板,HM 液稀释液涂 DM3 平板, 每皿涂 0.1ml, 每浓度涂 3 皿,30 下培养 24~36h, 计算菌落数, 无菌水稀释为未被酶解的细菌数, 此数为 B,HM 液稀释为再生原生质体数和未被酶解的细菌数, 此数为 C (6) 原生质体形成率和再生率的计算 原生质体形成率 (%)=(A?B)/A 原生质体再生率 (%)=(C?B)/(A?B) A: 处理前菌落数,B: 未被酶解的菌落数,C: 再生原生质体数和未被酶解细菌数 亲本菌株的灭活处理和电融合 (1) 原生质体灭活处理将所制备的原生质体分两组 (A,B), 分别用热和紫外灭活, 然后在不同的条件下做多亲株基因组随机重组电融合 (2) 电融合条件选用方波脉冲, 先低压排队, 再高压击破 筛选 (1) 初筛 : 把后培养的菌液进行梯度稀释, 取适量适宜梯度的菌液涂布于 LB 一纤维蛋白平板, 于 37 恒温箱中倒置培养 18h 根据菌落的不同形态将其挑取出来并接入 LB 一纤维蛋平板上,37 恒温

3 2007,27(10) 梁惠仪等 : 全基因组重排育种技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量 41 培养 12h 后观察溶解圈大小, 把溶解圈较大的菌落接入 LB 斜面培养后中备用 (2) 复筛把要复筛的菌株各接一环于 8ml 种子培养基中,37 150r/min 培养 16h 后, 按 4% 的接种量接种于装有 50ml 发酵培养基的 250ml 三角瓶中,37 150r/min 培养 4 天, 然后各取 10ml 发酵液于 4000r/min 离心 8min, 取上清 分别取上清液和尿激酶溶液 ((100IU/ml) 各 10μl, 点在同一琼脂? 纤维蛋白平板的不同位置上, 加盖, 置于 37 恒温培养箱中, 每隔 2h 观察纤维蛋白溶解情况 17h 后进行照相 测量溶解圈的垂直直径, 算出溶解圈垂直直径的乘积 (3) 筛选标准测定复筛菌落发酵上清液的纤溶酶活性, 与出发菌株相比, 相对酶活小于 90% 的定义为负突变菌株 ; 相对酶活大于 110% 的定义为正突变菌株 : 而相对酶活在 90% 至 110% 之间为非变异株或实验误差 遗传稳定性实验复筛得到的突变株接种于琼脂营养斜面作传代试验, 每 10 天传代一次, 共传 5 代 每传代一次在相同培养条件下进行摇瓶发酵, 测量发酵上清液的纤溶活性, 分析传代次数对生产性能的影响 2 结果和讨论 2.1 原生质体的制备和再生在通过对野生型纤溶酶产生菌 DC?12 分别进行紫外诱变出来和亚硝酸诱变的基础上, 筛选出 4 株酶活有一定提高并能稳定传代的诱变株 U8,U10 和 N8,N10 作为产豆豉纤溶酶全基因组重排的亲本菌株 在对亲本菌株重排之前, 对出发菌株 DC?12 原生质体制备和再生条件优化做了一系列条件的优化, 原生质体最佳的形成和再生条件是以改良 HM 高渗溶液作稳渗系统, 菌龄为 12h, 在 ph 值为 7.5, 酶浓度为 2.0mg/ml, 35 酶解 60min, 所得原生质体形成率为 95.8% 以 NaCl 为渗透压稳定剂的 DM 3 再生培养基中再生率为 23% 由于采用的亲本菌株, 直接诱变自 DC?12, 因此仍然采用此套制备条件 2.2 融合子的检出 双亲灭活法由于亲本菌株没有明显的遗传学特征, 采用双亲灭活可以摆脱遗传标记的束缚, 简化操作过程 热灭活和紫外线灭活后, 两个菌种的原生质体受到不同原因的破坏, 存活率为 0 由于热灭活造成的损伤相似而不能通过融合得到互补, 因此原生质体的种内融合无法在再生平板上复活 ; 紫外线作用于 DNA, 其作用靶位 较多且分散, 不同的损伤位点之间可以互补, 因此原生质体的种内融合有可能在再生平板上复活生长 ; 经过热灭活的和紫外线灭活的也可能通过融合弥补受到的损伤形成有活性的融合体 [9] 通过对 DC?12 原生质体进行热灭活和紫外灭活的条件进行了多次探索, 结果如下 : 表 1 紫外照射时间对原生质体灭活效果的影响 Table1 UV inactivationconditionoftheparentprotoplast 时间 (min) 灭活率 (%) 由表 1 可见, 选择 15min 作为原生质体的紫外线灭活的时间, 而且在实验中发现, 紫外灭活存在不稳定因素, 随着时间的延长, 灭活率反而下降, 可能与菌体的分散程度有关, 有些菌体聚集成团, 使紫外线作用不均 a) 表 2a 温度和时间对原生质体灭活效果的影响 Table2a Heat inactivationconditionof theparentprotoplast 时间 (min) 灭活率 (%) a) 表中灭活温度为 80 b) 表 2b 温度和时间对原生质体灭活效果的影响 Table2b Heat inactivationconditionof theparentprotoplast 时间 (min) 灭活率 (%) b) 表中灭活温度为 85 由表 2 可见, 可采取 80,60min 或 85,20min 作为原生质体热灭活的条件, 从下面的融合结果看, 80,60min 更有利于融合子的再生, 故选择 80, 60min 作为原生质体热灭活条件 2.3 亲本的全基因组重排 亲本的选择与灭活条件的确定 表 3 亲本的选择和灭活条件 Table3 Selectionofparentalstrainsand thein activedconditions 灭活条件热灭活 (80,60min) 紫外灭活 (15min) 菌株 N8 N10 U8 U18 酶活 (IU/ml)

4 42 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No 电击条件的确定在研究相关文献的基础上, 经过多次的探索, 确最佳的融合条件如表 4 所示 : 表 4 电融合条件的确定 Table4 Conditionsofelectricalfusion 脉冲间隔步骤电压 (V) 脉冲宽度 (ms) 脉冲个数时间 (ms) 第一步 ( 排序 ) 第二步 ( 击破 ) 电融和法操作简便, 较好地保持了原生质体的活性, 且在实验中发现与传统的化学融合法相比, 电融合所获得的融合率高, 有利于多亲本的全基因组重排 全基因组重排初筛结果将热灭活组亲本原生质体和紫外灭活组原生质体进行基因组重排, 共得到 89 株融合株, 从中初筛出水解圈较大的 10 株在进行复筛, 其中挑选出酶活在 700~1100IU/ml 的 6 株, 结果如下 : 表 5 首次基因组重排 (SⅠ) 的复筛结果 Table5 Selectionofthefivst roundgenomeshufling 菌株名称 SⅠ?2 SⅠ?12 SⅠ?18 SⅠ?37 SⅠ?56 SⅠ?77 酶活 (IU/ml) 在此基础上, 在进行第二次基因组重排 由于首次重排亲本菌株皆来源于 DC?12 的诱变株, 而诱变作用的盲目性无法避免负突变基因的出现, 所以选择一些诱变次数少 甚至是野生型的菌株作为亲本有利于消除负突变基因对重排效果的影响 [10] 因此, 在进行第二次重排时, 以首次重排初筛出来的 6 株高产菌和 DC?12 作为重排亲本, 共得到 46 株融合株, 其中 20 株的水解圈较 SⅠ?2 大并将其进行复筛, 其中 5 株酶活在 1600IU/ml 以上, 酶活最高达到 2600IU/ml, 较亲本菌株提高了 4~5 倍, 复筛结果如下 : 表 6 第二次基因组重排 (SⅡ) 的复筛结果 Table6 Selectionofthesecond roundgenomeshufling 菌株名称 SⅡ?6 SⅡ?13 SⅡ?22 SⅡ?23 SⅡ?36 SⅡ?41 酶活 (IU/ml) 遗传稳定性实验 为了得到遗传性能稳定良好的菌株, 挑选了第二次基因组重排后酶活的较高的 3 株 (SⅡ?22,SⅡ?23,S Ⅱ?36) 进行五代的遗产稳定性实验, 取 3 次实验的平均值, 结果如表 7 表 7 SⅡ?22,SⅡ?23,SⅡ?36 的遗传稳定性实验 Table7 GeneticstabilityofSⅡ 22,SⅡ 23,SⅡ 36 传代次数 SⅡ? SⅡ? SⅡ? 这三种突变株的遗传稳定性分析实验结果表明, 基因重排菌株 SⅡ?36 的高产纤溶酶特性在传代过程中 逐渐减弱, 而基因重排菌株 SⅡ?22 和 SⅡ?23 具有良好 的遗传稳定性, 经连续 5 代传代, 纤溶酶产量仍然很稳 定, 证明了全基因组重排技术所获的重排菌株较好地 保持了亲本的稳定性 3 结论 本文通过对产豆豉纤溶酶野生型菌株进行紫外线诱变和亚硝酸诱变构建了的亲本突变库, 在优化原生质体融合条件的基础上, 以诱变菌株作为直接亲本, 进行首次全基因组重排, 获得 6 株高产菌, 并在此基础上, 以该 6 株高产菌和 DC?12 作为亲本进行第二次全基因组重排, 获得 2 株酶活进一步提高并能稳定遗传的高产菌, 在使亲本菌株酶活提高了 4~5 倍, 其中 SⅡ?22 酶活最高, 达到 2710IU/ml 以上实验结果, 初步展现了全基因组重排育种技术在选育高产菌中的应用 全基因组重排育种技术由于具有不受亲缘关系的影响 遗传信息传递量大 不需了解双亲详细的遗传背景 可有目的地选择亲株以选育理想的融合株 便于操作等优点, 为遗传育种提供了一种有效手段 随着现代分子生物学和生物技术的发展, 这项技术正在被不断丰富和完善, 并起到越来越重要的作用 参考文献 [1] 施巧琴, 吴松刚. 工业微生物育种学. 北京 : 科学出版社, ShiQQ,WuSG.IndustrialMirobialBreedingScience.Beijing: SciencePublishingCompany, [2]StemmerW PC.Molecularbreedingofgenes,pathwaysand genomesbydna shufling.journalofmolecularcatalysisb: Enzymatic,2003,20:3~12 [3]PowelKA,RamerSW,delCardayreSB.Directedevolution andbiocatalysis.angewcheminted,2001,40:3948~3959

5 2007,27(10) 梁惠仪等 : 全基因组重排育种技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量 43 [4]ZhangYX,PeryK,VincietVA,etal.Genomeshuflingleads torapidphenotypicimprovementinbacteria.leterstoature, 2002,415:644~646 [5]PetriR,ClaudiaSD.Dealingwithcomplexityevolutionary engineering and genome shufling. Curent Opinion in Biotechnology,2004(15):298~304 [6]AstrupT,MulertzS.Thefibrinplatemethodforestimating fibrinolyticactivity.archbiochembiophys,1952,40:346~351 [7] 石漫莹. 豆豉纤溶酶发酵条件优化及分离纯化研究. 广州 : 华南理工大学,2004 ShiM Y.Fermentation optimization and purification of Fibrinolyticenzyme?producingstainsfrom Douchi.Guangzhou: DisertationSubmitedtoSouthChinaUniversityofTechnology, 2004 [8] 周海霞, 阚振荣, 张双凤, 等. 产 α?aldc 的枯草芽孢杆菌原生质体融合条件. 河北大学学报,2004,24(3):289~292 ZhouhX,KanZR,ZhangSF,etal.TransactionofHebei University,2004,24(3):289~292 [9] 孙剑秋, 周东坡, 平文祥. 灭活微生物原生质体融合的研究进展. 中国医学生物技术应用杂志,2002,2:29~32 ShunJQ,ZhouDP,PingW X.TheChineseAcademicMedical MagazineofOrganisms,2002,2:29~32 [10] 谢志鹏. 发酵法生产米多霉素的菌种选育 培养条件优化和动力学研究. 浙江 : 浙江大学,2005 XieZP.Studyonthestrainimprovement,culturecondition optimization and fermentation kinetics for mildiomycin producing.disertationsubmitedtozhejianguniversityforthe degreeofdoctor,2005 WholeGenomeShuflingtoEnhanceActivityofFibrinolytic Enzyme?producingStrains LIANGHui?yi GUOYong (Department.ofBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnologyandEngineering,Guangzhou ,China) Abstract DC?12isaBacilusstrainwithstrongfibrinolyticactivitywasscreenedfrom Douchi.A novel breedingtechnology wholegenomeshuflingwasappliedtoenhancetheproductionoffibrinolyticenzyme. Firstofal,acandidatemutantlibrarywasconstructedbytreatingDC?12withultravioletraysandhNO 2, respectively.basedonstudyingtheoptimumconditionsforprotoplastpreparationandregenerationofdc?12,multi?parentalwholegenomeshuflingwith4strainswasconcededbyprotoplastselectricalfusion,thencombineswith thescreeningmethodofdouble?inactiveprotoplast,twostrainswithhigheryieldoffibrinolyticenzymewere obtainedefectively,whichcandescendstablyafterfivegenerations,andtheirenzymeproductionreached2710 IU/ml,whichwasincreasedby4~5foldcomparedwiththemutants,respectively. Keywords Genomeshufling Inactivate Protoplastselectricalfusion

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