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1 第 33 卷第 4 期徐州工程学院学报 ( 自然科学版 ) 2018 年 12 月 Vol.33No.4 Journalof XuzhouInstitute of Technology (NaturalSciences Edition) Dec 2018 ARTP 诱变选育亚油酸异构酶高产菌株及其发酵条件优化 张珂, 魏明, 崔晓峰, 薛正莲 ( 安徽工程大学生物与化学工程学院, 安徽芜湖 ) 摘要 : 对嗜酸乳杆菌进行 ARTP 多轮诱变处理, 筛选出 1 株亚油酸异构酶高产菌株, 研究了碳源 氮源 碳氮比 培养时间 培养温度 初始 ph 对其产酶的影响, 并通过响应面实验对产酶条件进行了优化. 结果表明, 最佳碳源为 2% 的葡萄糖, 最佳氮源为 2% 的牛肉膏, 当碳氮比为 1 1.5, 培养时间为 36h, 培养温度为 36.4, 初始 ph 为 5.6 时, 诱变菌株酶活达到 U/mL, 是原始菌株的 2.84 倍. 关键词 : 嗜酸乳杆菌 ;ARTP; 亚油酸异构酶 ; 条件优化中图分类号 :Q936 文献标志码 :A 文章编号 :1674G358X(2018)04G0055G05 共轭亚油酸 (CLA) 是亚油酸在空间位置和几何构型上的一系列同分异构体的总称 [1], 具有抗肿瘤 抗 [2G4] [5G6] 氧化 防治糖尿病等功能, 在新型药品 营养添加剂以及功能性食品等领域有重要的应用价值. 生物法 [7] 合成 CLA 特异性高, 条件温和, 但转化率较低. 因此, 对亚油酸异构酶高产菌株的诱变选育及其发酵条件 的优化一直是人们工作的重点. [8] [9] 迄今, 紫外辐照 亚硝基胍诱变等方法分别被用于油酸异构酶高产菌株的诱变选育, 不同程度提升 了 CLA 的产量. 常压室温等离子体诱变 (ARTP) 技术是一种新型的微生物基因组快速诱变技术, 具有诱变 环境简单, 诱变温度低, 操作便捷等优点. 而对突变株发酵条件的优化一直是人们研究提高 CLA 产量的基 础. 本研究以 ARTP 技术对油酸异构酶产生菌进行多轮诱变选育, 并通过单因素及多因素响应面实验对高 产突变株的产酶条件进行优化, 以获得最佳发酵条件, 为生物法生产 CLA 提供理论基础. 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 嗜酸乳杆菌 (L.acidophilus)CICC6075, 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心 ; 共轭亚油酸标准品 溶菌酶,Sigma 公司 ; 亚油酸 ( 纯度 >95%) 正己烷 吐温 G80 葡萄糖等常规试剂均为分析纯, 购于国药集团 化学试剂有限公司. ph 计 分析天平, 梅特勒 G 托利多国际股份有限公司 ;ARTP 育种, 无锡思清源生物科技有限公司 ; 紫外可见分光光度计, 上海光谱仪器有限公司 ; 超声波细胞粉碎仪, 宁波新芝生物科技股份有限公司 ; 全自动高压 灭菌器, 日本 Hirayama 公司 ; 高速冷冻离心机, 湖南湘仪离心机仪器有限公司. 1.2 实验方法 ARTP 诱变方法 1) 菌悬液制备 : 取 1mL 活化菌液于 1.5mL 的离心管中,5000r/min 离心 5min 后去除上清液, 加入 1 ml 的无菌生理盐水震动摇匀, 制成菌悬液备用. 2)ARTP 诱变流程 : 供电 220V,50Hz, 电压波动范围 5%, 气体流量选用 10SLM, 功率 200 W.ARTP 进行诱变处理的处理时间分别为 s. 3) 致死率计算 : 梯度稀释涂布于 MRS 固体培养基上, 培养 48h 后进行菌落计数, 按照公式 : 致死率 = ( 对照组 - 诱变菌落数 )/ 对照菌落数 100%, 计算致死率. 收稿日期 :2018G05G03 基金项目 : 安徽省自然科学基金项目 ( MC65); 国家级大学生创新创业训练计划项目 ( ) 作者简介 : 张珂 (1994-), 男, 硕士研究生, 主要从事食品资源开发与利用. 55

2 徐州工程学院学报 ( 自然科学版 ) 2018 年第 4 期 4) 筛选 : 在 MRS 固体培养基中添加临界浓度的亚油酸 (0.5%), 将经 ARTP 诱变后的菌液均匀涂布在 [10] 平板上, 培养一定时间后, 挑取平板上生长较好的菌落进行增殖培养并测定酶活. 5) 遗传稳定性实验 : 突变株进行 7 次传代培养, 测定每一代菌株的酶活, 观察其稳定性 酶活测定方法 1) 粗酶液制备 培养好的菌液 r/min, 离心 20 min, 弃上清液, 加入适当的的磷酸盐缓冲液 (ph6.0) 清洗 两次,4 8000r/min, 离心 10min, 弃上清液, 得含酶菌体. 将所得含酶菌体加入石英砂研磨后加入 5 ml 的磷酸盐缓冲液均质 10min, 即得菌体重悬液. 菌体重悬液加入 1% 溶菌酶冰水浴中进行间歇破碎 15 min( 破碎 3s, 间歇 3s, 超声功率 250 W), 将破碎菌液于 r/min, 离心 20min 后, 收集上清液, 即为粗酶液. 2) 共轭亚油酸检测 采用分光光度法以正己烷为参比在 233nm 处测定样品的吸收值. 以共轭亚油酸质量 (X) 为横坐标, 吸 光值 (Y) 为纵坐标绘制出标准曲线, 其回归方程为 Y=0.0082X ,R 2 = 根据标准曲线, 计 算出样品中共轭亚油酸的含量. 3) 共轭亚油酸酶活力的测定 在 50mL 三角瓶中加入 5mL 的粗酶液 100mg 的亚油酸和少许 TweenG80, 于 37 下缓慢振摇 1h, 加入 10mL 正己烷萃取共轭亚油酸, 经 r/min, 离心 20min 后, 取正己烷层, 测定其含量. 亚油 酸异构酶活力单位 U 定义为 : 在上述酶活力测定方法下,1min 内生成 1μgCLA 所需的酶量. 酶活力 (U/mL)=(K G)/(V T), 式中 :K 为酶液稀释倍数,G 为所生成的共轭亚油酸量 ( μ g),v 为吸取酶液体积 (ml),t 为保温时间 (min) 2 结果与分析 2.1 碳源及其质量分数对突变株产酶的影响 由图 1 可知, 葡萄糖是最佳碳源, 当葡萄糖质量分数为 2% 时,B5 突变株酶活力最高, 达到 U/mL. 碳源在菌株的生长 繁殖及代谢活动中起着至关重要的作用, 在含有充足便于吸收的碳源的环境中, 微生物生长繁殖旺盛, 代谢水平高, 更容易生成丰富的产物.B5 突变株利用葡萄糖的效率要显著高于双糖和 多糖, 说明 B5 突变株对单糖的利用率要高于多糖. 2.2 氮源及其质量分数对突变株产酶的影响 由图 2 可知, 牛肉膏是最佳氮源, 当添加 2% 的牛肉膏时,B5 突变株酶活力最高, 达到 774.2U/mL. 氮 源作为微生物细胞蛋白质的组成部分, 对微生物的生长和酶的合成具有重要作用, 添加适当质量分数的有机 氮源牛肉膏能促进菌体生长和亚油酸异构酶的合成. 图 1 碳源及其质量分数对产酶的影响图 2 氮源及其质量分数对产酶的影响 56

3 张 3 珂,等: ARTP 诱变选育亚油酸异构酶高产菌株及其发酵条件优化 碳氮比对突变株生长和产酶的影响 以葡萄糖和牛肉膏作为碳源和氮源,分别选择碳氮比为 1 0 5, 1 1, 1 1 5, 1 2, 1 5 由 图 3 可 知,在碳氮比 1 1 5 时, B5 的生物量和酶活力都达到最高,酶活力为 1083 U/mL 碳 源 是 菌 株 生 长 繁 殖 的 保证,氮源是菌体合成蛋白质的来源,合适的碳氮比不仅有利于突变株的生长和 代 谢,更 有 利 于 突 变 株 关 键 酶的合成 [12G13] 4 温度对突变株生长和产酶的影响 图 4 结果表明,温度对突变株产酶的影响显著,当温度低于 37 时,随着温度的升高,菌体 的 生 物 量 和 产酶量也在升高 37 时酶活力为 1125 U/mL,生物量为 344,均达到最大值 继续提高培养温度, B5 的 生长和代谢都受到抑制,产酶量和生物量均呈快速下降趋势 图 3 碳氮比对产酶的影响 图 4 温度对产酶的影响 5 培养时间对突变株生长和产酶的影响 B5 突变株生长和产酶特性如图 5 所示,在 0~9h 内,菌株产酶量很低,在 9~24h 内,菌株开始迅速产 酶,在培养 36h 时,产酶量达到最大,这是因为亚油酸异构酶是一种诱导酶,当生长环境中含有亚油酸时,需 要一定时间诱导突变株中亚油酸异构酶基因的表达,从而开始合成大量的亚油酸异构酶 随着培养时间的进 一步延长,产酶量略有下降,这是由于进入静止期,菌 体 开 始 自 溶,酶 合 成 减 少 因 此,本 实 验 选 择 36h 作 为 B5 突变株的最佳培养时间 6 初始 ph 对突变株生长和产酶的影响 不同初始 ph 值下 B5 突变株的产酶及生长情 况 如 图 6 所 示 当 初 始 ph 为 5 5 时,突 变 株 的 酶 活 力 和 生物量均达到最高,酶活力为 1137 6U/mL,生物量为 359; ph 值过高或过低均会 不 同 程 度 抑 制 菌 株 的 生长和产酶,因此控制合适的初始 ph 值,对发挥突变株最大的产酶能力非常重要 图 5 突变株的生长和产酶的关系 图 6 初始 ph 对产酶的影响 57

4 徐州工程学院学报 ( 自然科学版 ) 2018 年第 4 期 2.7 产酶条件优化与响应面分析通过对单因素实验结果进行分析, 可知培养温度 培养基初始 ph 培养基碳氮比是影响 B5 产酶最显著的 3 个因素, 设定其它条件为 :2% 葡萄糖,2% 牛肉膏, 培养时间 36h. 设计 3 因素 3 水平响应面实验, 并通过响应面分析, 分析结果见图 7~ 图 9. 图 7 温度和 ph 的交互作用图 8 碳氮比和 ph 的交互作用 图 9 碳氮比和温度的交互作用 由图 7 可知, 设定碳氮比为 0 时, 酶活力随着初始 ph 的增大先增大后减小. 当初始 ph 较低时, 酶活力 随着温度的增加先增大后减小. 根据酶活力的变化可以看出, 初始 ph 对酶活力的影响大于温度, 但两者之 间的交互作用不显著. 由图 8 可知, 设定温度为 0 时, 酶活力随着初始 ph 的增大先增大后减小. 当初始 ph 较低时, 酶活力随 着碳氮比的增加先呈现上升趋势, 后趋于稳定并逐渐开始减小. 因此, 在一定温度条件下, 合适的碳氮比和初 始 ph 有利于突变株产酶量的提高. 固定初始 ph 在零水平上, 酶活力随着温度的增大先增大后减小. 当温度较低时, 酶活力随着碳氮比的 增加先增大, 后逐渐开始减小. 温度与碳氮比之间存在明显的交互效应 (P=0.0038<0.05), 因此, 在一定初 始 ph 下, 合适的碳氮比和温度有利于突变株产酶量的提高,2 个因子在所选择的范围内可以产生最佳响 应值. 3 结论通过对嗜酸乳杆菌进行 ARTP 诱变处理, 得到一株遗传稳定的高产突变株 B5, 而 B5 的生长及产酶受 多种发酵条件的影响. 通过单因素试验结合响应面试验, 获得了 B5 的最佳发酵产酶条件 : 培养温度 36.4, 初始 ph5.6, 碳氮比 1 1.5, 培养时间 36h. 亚油酸异构酶产量达到 U/mL, 是原始菌株的 2.84 倍. 58

5 张 珂, 等 :ARTP 诱变选育亚油酸异构酶高产菌株及其发酵条件优化 参考文献 : [1]ADOLFR,LAMMT.FractionationofcisGoleicandtranGoleic,linoleic,andconjugatedlinoleicfatyacidmethylestersbysilG verionhighperformanceliquidchromatography[j].journalofchromatographya,1998,799(1/2):329g332. [2]IPC,CHIN SF,SCIMECAJA,etal.Mammarycancerpreventionbyconjugateddienoicderivativeoflinoleicacid[J]. CancerResearch,1991,51(22):6118G6124. [3]AZAIN MJ,HAUSMAN DB,SISK M B,etal.Dietaryconjugatedlinoleicacidreducesratadiposetissuecelsizerather thancelnumber[j].journalofnutrition,2000,130(6):1548g1554. [4]CHINSF,STORKSONJM,ALBRIGHT KJ,etal.ConjugatedlinoleicacidisagrowthfactorforratsasshownbyenG hancedweightgainandimprovedfeedeficiency[j].journalofnutrition,1994,124(12):2344g2349. [5] 刘怀忠, 梁峙, 赵海明, 等. 益生菌共轭亚油酸奶工艺优化研究 [J]. 徐州工程学院学报 ( 自然科学版 ),2014,29(3):25G29. [6] 王广彬, 肖扬, 马捷, 等. 共轭亚油酸强化型乳制品的稳定性研究 [J]. 徐州工程学院学报 ( 自然科学版 ),2014,29(2):24G29. [7]ROSSON R A,GRUND A D,DENG M D,etal.Linoleateisomerase:US,US [P] [8] 曹健, 魏明, 曾实, 等. 一株嗜酸乳杆菌突变株转化亚油酸为共轭亚油酸条件的研究 [J]. 食品科学,2003(9):76G79. [9] 赵宏伟. 共轭亚油酸高产菌株的诱变选育及其在发酵乳上的应用研究 [D]. 北京 : 中国农业科学院,2011. [10]RAINIO A,VAHVASELKAE M,SUOMALAINEN T,etal.ProductionofconjugatedlinoleicacidbyPropionibacterium feundenreichissp.shermani[j].lait,2002,47(8):735. [11] 刘晓华, 曹郁生, 陈燕. 产共轭亚油酸乳酸菌的筛选及生产条件的研究 [J]. 广州食品工业科技,2003,19(B11):3G5. [12] 王月囡, 曹健, 张琳, 等. 产酶培养条件对一株嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶活力的影响 [J]. 食品科学,2007(11):310G314. [13] 吴风亮. 嗜酸乳杆菌产共轭亚油酸及其乳制品的研究 [D]. 保定 : 河北农业大学,2006. ( 责任编辑崔思荣 ) BreedingofLinoleicAcidIsomeraseGProducingStrainand OptimizationofFermentativeConditions ZHANG Ke,WEIMing,CUIXiaofeng,XUEZhenglian (ColegeofBiologyandChemistryEngineering,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu241000,China) Abstract:AhighproductivitystrainoflinoleicacidisomerasewasobtainedbyARTP mutagenesisin Lactobacilusacidophilus.Theefectsofcarbon,nitrogen,C/N,cultivationtemperature,cultivationtime andinitialph onsynthesisoflinoleicacidisomerasewerestudied.theconditionsforproducinglinoleic acidisomerasewereoptimizedbytheresponsesurfaceexperiment.theresultsshowedthatthebestcarbon sourceandnitrogensourceareglucoseandbeefextractrespectively.theoptimalconditionsforproducing linoleicacidisomeraseareasfolows:2% glucose,2% beefextract,c/n1 1.5,cultivationtime36h,culG tivationtemperature36.4,initialph 5.6.Underaboveconditions,theyieldoflinoleicacidisomerase reached1214.1u/ml,whichwas2.84timesashighasthatoftheoriginalstrain. Keywords:Lactobacilusacidophilus;ARTP;linoleicacidisomerase;optimizationofconditions 59

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