48 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.9206 高氏一号培养基 ( 组分 g/l): 可溶性淀粉 20; KNO 3 ;MgSO 4 7H 2 O0.5;K 2 HPO 4 3H 2 O0.5;NaCl 0.5;FeSO 4 7H 2 O0.0; 琼脂 20

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耶佶松
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,206,36(9):47 53 DOI:0.3523/j.cb 常压室温等离子体 (ARTP) 诱变茂源链霉菌菌株田淑翠牛延宁常忠义高红亮 2 步国健金明飞 ( 华东师范大学生命科学学院上海泰兴市东圣食品科技有限公司泰兴 2254) 摘要采用常压室温等离子体 (ARTP) 诱变技术处理茂源链霉菌 (Streptoverticiliummobaraense) 菌株 HS47 的孢子, 选育微生物谷氨酰胺转胺酶 (MTG) 高产菌株菌株的致死率强度和正突变率高低结果表明, 在电源功率为 20W, 处理距离 2mm, 工作气流量 0slpm 时, 等离子体氦气对茂源链霉菌 HS47 孢子的最佳处理时间为 30s 将诱变后的孢子液稀释涂布后, 利用 96 孔板高通量筛选方法对单菌落进行初筛, 选出高产的突变株进行两轮试管复筛, 筛选过程中保持对菌株的分离纯化, 最终获得一株高产菌株 M 8, 其 MTG 酶活由 2.8U/ml 提高到 5.U/ml, 较出发菌株 HS47 提高了 82% 该菌株的摇瓶发酵实验证明, 其酶活的提高是单位菌株分泌的 MTG 有所增加的结果经过 8 次传代, 证实该菌株具有良好的遗传稳定性这为谷氨酰胺转胺酶的工业化生产提供了菌种支持和理论支持关键词常温室压等离子体诱变高通量筛选茂源链霉菌谷氨酰胺转胺酶中图分类号 Q89 谷氨酰胺转胺酶 ( 蛋白质谷氨酸 γ 谷氨酰胺转移酶,transglutaminase,EC ,TG) 能催化蛋白质分子内分子间的交联, 从而改善蛋白质的营养价值质地结构口感等功能性质, 在纺织食品医药领域具有广泛的应用前景 [] [2] 20 世纪 80 年代末,Ando 等首先报道了利用微生物发酵法生产 TG 的结果这种方法成本低周期短, 并且生产出的微生物谷氨酰胺转胺酶 (MTG) 酶活完全不依赖于 Ca 2+, 因此迅速吸引了国内外学者的关注和兴趣, 并成为到目前为止大批量生产 TG 的最主要途径在工业发酵领域, 决定一种发酵产品顺利投产的关键性环节是对生产菌种的选育, 生产 MTG 的菌株主要属于放线菌类的链霉菌属, 茂源链霉菌 (Streptoverticiliummobaraense) 是常用的菌种之一, 因此对于茂源链霉菌的选育非常关键诱变育种技术仍然是现在世界各国广泛使用的菌株选育技术, 针对茂源链霉菌的诱变, 报道的紫外线辐照 (UV) [3] 亚硝基胍 (NTG) [4] 等方法都颇有成效, 但收稿日期 : 修回日期 : 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 ( ) 通讯作者, 电子信箱 :mfjin@bio.ecnu.edu.cn UV 能量较大, 会杀死细胞, 极易对人体造成巨大伤害 ; NTG 有毒, 有致癌的可能性, 因此传统的诱变方法对实验操作者的人身安全有很大的潜在危险性由清华大学自主研发的新型常压室温等离子体 (atmosphericand roomtemperatureplasma,artp) 诱变技术是新兴的一种诱变技术, 与传统诱变方法相比, 对人体和环境极为安全, 且具有射流温度低活性粒子分布均匀无需真空装置设备简单操作方便等特点 [5], 已应用于细菌 [6] [7] 酵母菌等的诱变, 并成功筛选得到高产菌株, 但对放线菌诱变的应用鲜有报道本研究利用 ARTP 诱变茂源链霉菌, 通过 96 孔板高通量筛选试管复筛和摇瓶发酵最终获得一株具有良好遗传稳定性的高产突变株 M 8, 提高了谷氨酰胺转胺酶的产量, 为谷氨酰胺转胺酶的工业化生产提供支持材料与方法. 材料.. 菌株茂源链霉菌 (Streptoverticilium mobaraense)hs47, 是实验室从土壤中分离后所得..2 培养基参照本实验室所用高氏一号培养基种子培养基和发酵培养基 [8]

2 48 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.9206 高氏一号培养基 ( 组分 g/l): 可溶性淀粉 20; KNO 3 ;MgSO 4 7H 2 O0.5;K 2 HPO 4 3H 2 O0.5;NaCl 0.5;FeSO 4 7H 2 O0.0; 琼脂 20;pH 调至 7.2~7.4 种子培养基 ( 组分 g/l): 甘油 20; 酵母膏 5; 鱼粉蛋白胨 25;MgSO 4 7H 2 O2;K 2 HPO 4 3H 2 O2;pH 调至 7.4 发酵培养基 ( 组分 g/l): 甘油 20; 酵母膏 6; 鱼粉蛋白胨 25;MgSO 4 7H 2 O2;K 2 HPO 4 3H 2 O2;pH 调至 7.4 培养基灭菌温度为 2, 时间为 20min..3 实验试剂与仪器 Na CBZ Gln Gly 购自上海多肽公司 ; 还原型谷胱甘肽购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ; 其他药品均为分析纯级产品, 购自国药集团化学试剂有限公司 SynergyHT 多功能酶标仪,BioTek; 常压室温等离子体诱变机, 北京思清源生物科技有限公司 ; 恒温水浴锅, 上海精宏实验设备有限公司 ; 恒温调速回旋式摇床 DKY Ⅱ, 上海杜科自动化设备有限公司 ;72 可见分光光度计, 上海元析仪器有限公司.2 菌株的 ARTP 诱变.2. 孢子悬液的制备将保藏的茂源链霉菌 HS47 菌种从安瓿管中用 ml 无菌水重悬, 转接入高氏一号茄子瓶斜面培养基上进行复壮, 置于 28 恒温恒湿培养箱中培养 7 天, 传三代进行活化, 刮取斜面菌苔于 0ml 无菌水中, 过滤即得孢子悬液用细胞计数板进行镜检计数, 调整孢子浓度为 0 8 个 /ml.2.2 菌株的 ARTP 诱变在超净工作台中用移液枪移取 0μl 孢子悬液, 均匀涂抹在直径为 6mm 的无菌金属垫片上, 将其置于无菌平皿内移至提前开机预热 20min 的 ARTP 诱变机中, 电源功率为 20W, 处理距离 2mm, 工作气流量 0slpm, 以氦气为工作气体, 以处理时间为诱变的主要操作参数, 从 0s 依次递增到 75s 处理过后, 将金属垫片放入装有 ml 无菌水的 EP 管中, 使金属垫片上的孢子液得以重悬, 将重悬液稀释涂布于高氏一号平板上, 置于 28 恒温恒湿培养箱中培养 7 天.2.3 ARTP 诱变致死率及突变率的计算致死率 (%)=(A-B)/A 00% 式中,A 为诱变处理前孢子液的浓度 ;B 为诱变处理后孢子液的浓度正突变率 (%)=C/E 00% 负突变率 (%)=D/E 00% 总突变率 (%)= 正突变率 (%)+ 负突变率 (%) 式中,C 为所筛选的菌株样本中的正突变菌株数 ;D 为所筛选的菌株样本中的负突变菌株数 ;E 为所筛选的菌株样本总数.3 诱变菌株的筛选整体筛选流程如下 : 高通量初筛分离纯化第一轮试管复筛分离纯化第二轮试管复筛摇瓶发酵验证传代保种孔板高通量初筛参照本实验室建立的方法 [4] 将经 ARTP 诱变处理后在高氏一号平板上长势均一的单菌落用牙签刮取点种在 96 孔板的各个孔中 ( 装液量 :50μl 发酵培养基 / 孔 ), 于 r/min 发酵培养 96h, 离心, 取发酵液上清液进行酶活测定.3.2 试管复筛将 96 孔板测定酶活较高的菌株扩大培养于试管斜面上, 用 ml 无菌水洗下斜面孢子, 混匀后接种 0.ml 孢子悬液于装有 3mL 发酵培养基的 20ml 试管中, 每株做 3 个平行,30 200r/min 下培养, 60h 时取样, 测定酶活.3.3 菌株分离纯化将酶活较高的菌株稀释涂布于高氏平板上生长 7 天后, 每株菌株选取 0~5 株单菌落用 96 孔板进行筛选和酶活测定, 最终选择整体酶活较高的菌株.3.4 摇瓶发酵将酶活较高的菌株接种于高氏一号平板上生长 7 天, 将菌体刮下, 用 2ml 无菌水重悬, 取 ml 菌液接种于装有 30ml 种子培养基的 250ml 的三角瓶中培养, 摇瓶转速为 200r/min,30 培养 24h, 将该种子液以 0% 的比例接种到装有 30ml 发酵培养基的 250ml 的三角瓶中相同条件下发酵培养, 每株做 3 个平行, 从 0h 开始每隔 4h 取样测定菌株酶活和生物量.4 菌株酶活和生物量的测定孔板酶活测定方法采用恒温空气浴法 [4].4.2 试管和摇瓶发酵酶活的测定参照氧肟酸比色法 [9], 以 L 谷氨酸 γ 单羟氧肟酸作标准曲线一个 MTG 酶活单位 (U/ml) 定义为 : 在 37 下, 每分钟催化底物生成 μmoll 谷氨酸 γ 单羟氧肟酸所需的酶量.4.3 生物量的测定以单位体积的细胞干重 (DCW) 表示 [0].5 数据处理及分析方法用 Graphpadprism5 MicrosoftExcel 进行数据处理和分析

3 206,36(9) 田淑翠等 : 常压室温等离子体 (ARTP) 诱变茂源链霉菌菌株 49 2 结果与分析 2. ARTP 诱变时间的选择等离子体产生的活性粒子能穿过细胞壁到达细胞内, 打断基因和蛋白质键, 导致细胞壁部分或完全破裂, 使大部分微生物死亡, 只有少数微生物可以通过自身的 SOS 修复系统修复存活, 并在这一过程中产生基因突变, 因此选择合适的诱变条件能实现微生物的快速诱变 [] 在一定的电源功率工作气流量等离子体发射源与样品之间距离的条件下, 诱变主要的可变操作参数是处理时间因此分别对茂源链霉菌进行 0s 5s 30s 45s 60s 75s 的 ARTP 处理 ARTP 不同诱变时间下茂源链霉菌 HS47 的致死率曲线如图所示从图中看出, 随着诱变时间的增加, 菌体的存活率逐渐降低由于菌体细胞壁的保护, 在 45s 内致死率相对较低, 不到 90%, 但当作用时间达到 75s 时,ARTP 的诱变作用较为剧烈, 致死率达到 99.9% 为了更全面准确的确定 ARTP 诱变的时间, 除了菌株的致死率, 菌株所产 MTG 的酶活及突变率也是需要考虑的因素在对不同 ARTP 诱变时间的菌株进行筛图不同 ARTP 作用时间下茂源链霉菌 HS47 的致死率 Fig. ThelethalityrateofS.mobaraenseHS47 underdiferentartpactuationduration 选后测定酶活, 结果见图 2(a) 由图可以看出, 与野生菌相比, 突变株的平均酶活都有所提高, 其中,5s 时, 所筛选菌株的平均酶活与野生菌平均酶活之间差异显著 ; 30s 和 45s 时, 所筛选菌株的平均酶活与野生菌平均酶活之间差异极显著 60s 之后, 由于 ARTP 作用时间延长, 细胞的损伤严重, 突变株的酶活提高不大图 2 不同 ARTP 作用时间下茂源链霉菌 HS47 的酶活及突变率 Fig.2 TheenzymeactivityandmutationrateofS.mobaraenseHS47underdiferentARTPactuationduration (a)theenzymeactivityofs.mobaraensehs47underdiferentartpactuationduration (b)themutationrateofs.mobaraensehs47under diferentartpactuationduration Significantdiference(P<0.05); Extremelysignificant(P<0.0) 以野生菌的平均酶活为参考, 定义突变株中高于野生菌平均酶活 20% 的为正突变株, 低于野生菌平均酶活 20% 的为负突变株对其突变率进行统计分析, 结果见图 2 (b), 不同诱变时间下, 菌株的突变率不同,30s 时, 正突变率达到最高, 此时, 负突变率最低, 总突变率最高在综合考虑菌株致死率所产 MTG 酶活和菌株的突变率后, 为提高获得 MTG 生产能力和生存能力较强菌株的概率, 故选定 ARTP 处理时间为 30s 2.2 高产突变株的筛选孔板高通量初筛将 ARTP 作用时间 30s 的孢子进行大批量的稀释涂布, 根据菌落生长的大小和丰满度, 进行大批量的初筛培养, 酶活测定结果 ( 图 3) 表明, 突变株的平均酶活显著高于野生株的平均酶活, 选取酶活最高的野生菌株和高于野生菌最高酶活的 30

4 50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.9206 株突变株进行试管复筛试管复筛图 4(a) 为第一轮试管复筛结果, 筛选到 8 株酶活提高 30% 的高产菌株,0 株酶活提高 40% 的高产菌株由于这 0 株菌中还可能存在遗传不稳定或实验操作误差的可能, 为了获得准确的遗传稳定的高酶活突变株, 将这 0 株突变株和野生菌株分离纯化后进行第二轮试管复筛, 结果见图 4(b), 有 5 株菌株的酶活较出发菌株提高 55% 以上, 其中, 编号 M 8 的菌株酶活达到 5.U/ml, 比出发菌株 (2.8U/ml) 提高了 82% 图 3 ARTP 诱变菌株的 96 孔板初筛 Fig.3 96 welplatescreeningofstrains afterartpmutagenesis Redcircles:Thestrainschosenforscreeningintesttube; Significantdiference(P<0.05) 图 4 ARTP 诱变菌株的试管复筛 Fig.4 ScreeningofstrainsafterARTPmutationintesttube (a)thefirstroundscreenofstrainsafterartpmutationintesttube Thesolidlineindicatedthepositionwhererelativeenzymeactivitywere.3 foldsofthoseofthewildtypestrain;thedotedlineindicatedthepositionwhererelativeenzymeactivitywere.4foldsofthoseofthewildtype strain) (b)thesecondroundscreenofstrainsafterartpmutationintesttube Thesolidlineindicatedthepositionwhererelativeenzyme activitywere.55foldsofthoseofthewildtypestrain

5 206,36(9) 田淑翠等 : 常压室温等离子体 (ARTP) 诱变茂源链霉菌菌株突变高产株的摇瓶发酵为了准确得到突变株 M 8 的 MTG 酶活及探究其生长趋势, 将高产突变株 M 8 与野生型菌株 HS47 同时进行摇瓶发酵培养, 每隔 4h 测定菌株的生物量和所产 MTG 的酶活, 结果见图 5 图 6 突变株 M 8 的传代发酵 Fig.6 Fermentationofgenerationsof mutationstrainm 8 图 5 高产菌株的生长和产酶曲线 Fig.5 Thegrowthandenzymeactivitycurve ofthehigh yields.mobaraense 由图 5 可知, 突变株与野生菌株的生长趋势基本一致发酵前期和中期, 诱变高产菌的生长速率远远高于野生菌 40h 时, 突变株 M 8 和野生菌 HS47 的酶活均达到最高, 此时突变株酶活为 5.U/ml, 比野生菌株 (2.8U/ml) 提高了 82%, 而此时, 突变株的生物量略低于野生菌株, 因此高产菌酶活的提高是单位菌株分泌的 MTG 有所增加的结果 2.4 突变高产株的遗传稳定性为了检测突变株的遗传稳定性, 对突变高产株 M 8 在试管斜面上连续传接 8 代, 然后进行摇瓶发酵培养, 检测发酵液中 MTG 酶活, 结果 ( 图 6) 表明, 突变株经 8 次传代后, 产生的 MTG 酶活基本稳定,ARTP 诱变产生的突变株 M 8 具有良好的遗传稳定性 3 讨论有超级黏合剂之称的微生物谷氨酰胺转胺酶 (MTG) 在食品工业中得到了广泛应用, 目前国内用来生产 MTG 的菌株为茂源链霉菌, 国内该菌株的产量远远落后于代表世界先进水平的日本味之素公司的菌株产量, 难以达到工业化大规模生产的要求, 极大的制约了 MTG 商业化的应用范围通过基因工程改造的方法可以快速提高菌株的产量 [2], 但基因工程菌用于食品中存在很大的社会争议, 因此国内对茂源链霉菌菌株的选育仍采用传统诱变的方法相对于其他传统诱变技术, 除了满足操作简便设备简单条件温和安全性高的基础上,ARTP 诱变育种技术的显著特点是通过一次操作可获得多达个以上的突变体, 可以极大提高突变库的容量, 达到高效育种的目的 [3] 本文采用 ARTP 的诱变方法对一株野生型茂源链霉菌 HS47 进行了诱变, 通过致死率和突变率的计算, 优化了 ARTP 诱变的时间, 最终选择 30s 的诱变时间, 并加大了对这个时间的突变库的筛选同时,ARTP 诱变时间的确定可以为以后的诱变提供参考, 减少了实验的盲目性, 提高了实验效率随后对诱变后的菌株进行高通量筛选筛选的诱变菌株遗传特性不稳定, 极易发生回复突变, 如果不能及时的将菌株分离纯化, 就会出现菌株退化的现象, 因此将初筛选出的高产菌株经过分离纯化后再进行试管复筛结果表明, 经过分离纯化, 初筛选出的 30 株高产菌株中酶活高于野生菌酶活 30% 的菌株就高达 8 株, 整体酶活结果与初筛结果体现了高度的一致性为了进一步避免由于菌株的遗传不稳定或实验操作造成误差, 也为了增加获得遗传稳定的高酶活突变株的准确率, 将第一轮试管复筛中酶活高于野生菌酶活 40% 的 0 株突变株分离纯化后进行了第二轮复筛, 结果表明第一轮复筛选出的高产突变菌株在第二轮筛选中仍保持高产的能力, 并得到了一株 MTG 的高产菌株 M 8, 其每毫升发酵上清液 MTG 的酶活可达 5.U, 较出发株的酶活提高了 82% 通过摇瓶扩大发酵培养证实

6 52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.9206 菌株 M 8 的生长速率比野生菌株要快, 单位菌株分泌的 MTG 量增加使得 MTG 酶活有所提高传代发酵试验证明, 菌株 M 8 遗传稳定性良好, 从而最终证明 : 对茂源链霉菌进行 ARTP 诱变且在筛选过程中注重对菌株的分离纯化能大幅度提高其产 MTG 的能力, 为以后高产 MTG 茂源链霉菌菌株的选育提供了一个良好的方法以本研究获得的高产突变株为出发株继续进行诱变和筛选, 或对其发酵培养基进行优化都有望使 MTG 的产量得到进一步的提高, 从而加速 MTG 实现工业化大规模生产达到世界先进水平的进程参考文献 [] SantosM, TornéJM. Recentpatentson transglutaminase productionandapplications:abriefreview.recentpatentson Biotechnology,2009,3(3): [2] Ando H, AdachiM, Umeda K, etal. Purification and characteristics of a novel transglutaminase derived from microorganisms.agricultural& BiologicalChemistry,989,53 (0): [3] 张莹, 郭琛琛, 黑东燕, 等. 复合诱变法选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株. 食品科学,204,35(): ZhangY, Guo C H CH, He D Y, etal.screening and characterizationofhigh yieldmicrobialtransglutaminase producing mutantsinducedbyanovelmethod.foodscience,204,35 (): [4] 郭玮婷, 张慧, 查东风, 等. 产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的快速筛选方法. 中国生物工程杂志,205,35(8): GuoW T,ZhangH,ZhaDF,etal.Arapidmethodofscreening forthermostabletransglutaminasefrom Streptomycesmobaraensis. ChinaBiotechnology,205,35(8): [5]ZhangX,ZhangX F,LiH P,etal.Atmosphericandroom temperatureplasma(artp) asanew powerfulmutagenesis tool.appliedmicrobiology& Biotechnology,204,98(2): [6] Lu Y, WangL, MaK, etal. Characteristicsofhydrogen productionofanenterobacteraerogenesmutantgeneratedbya new atmospheric and room temperature plasma (ARTP). BiochemEngJ,20,55():7 22. [7] 金丽华, 方明月, 张罛, 等. 常压室温等离子体快速诱变产油酵母的条件及其突变株的特性. 生物工程学报,20,27 (3): JinLH,FangM Y,ZhangCH,etal.Operatingconditionsfor therapidmutationoftheoleaginousyeastbyatmosphericandroom temperatureplasmasand the characteristicsofthe mutants. ChineseJournalofBiotechnology,20,27(3): [8] 刘雅清, 侯孝仑, 郭玮婷, 等. 甲壳素促进茂源链霉菌发酵产酶. 中国生物工程杂志,205,35(6): Liu Y Q, Hou X L,guo W T,etal.Enhancementof transglutaminaseproductioninstreptoverticilium mobaraensisas achievedbytreatmentwithchitin.chinabiotechnology,205,35 (6): [9] GrosowiczN,WainfanE,BorekE,etal.Theenzymatic formationofhydroxamicacidsfrom glutamine.jbiolchem, 950,87(): 25. [0] 陈佳, 金明飞, 谭玉静, 等.NaCl 对轮枝链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的促进作用研究. 中国生物工程杂志,203,33(2): ChenJ,JinMF,TanYJ,etal.Enhancementoftransglutaminase production in Streptoverticilium mobaraensis as achieved by treatmentwithnacl.chinabiotechnology,203,33(2): [] LiG,LiH P,WangLY,etal.Geneticefectsofradio frequency,atmospheric presureglow dischargeswithhelium. ApplPhysLet,2008,92(22): [2]Hui LinY,LiP,YingL.Purificationandon columnactivation ofa recombinanthistidine tagged pro transglutaminase after solubleexpresioninescherichiacoli.biosciencebiotechnology &Biochemistry,2009,73(): [3]WangQ,FengLR,WeiL,etal.Mutationbreedingoflycopene producingstrainblakesleatrisporabyanovelatmosphericand room temperatureplasma(artp).appliedbiochemistry& Biotechnology,204,74():

7 206,36(9) 田淑翠等 : 常压室温等离子体 (ARTP) 诱变茂源链霉菌菌株 53 TheStreptoverticilium mobaraensemutagenesisusingatmospheric PresurePlasmaatRoom Temperature(ARTP)Method TIANShu cui NIUYan ning CHANGZhong yi GAOHong liang BUGuo jian 2 JINMing fei (LifeScienceColegeofEastChinaNormalUniversity,Shanghai 20024,China) (2TaixingDongshengFoodScienceandTechnologyLimitedCompany,Taixing 2254,China) Abstract Togetmicroorganismtransglutaminase(MTG)highyieldstrains,thesporesofStreptoverticilium mobaraensestrainhs47weremutagenizedusingatmosphericpresureplasmaatroom temperature(artp) method.thefatalityratestrengthandpositivemutationrateresultofthestrainsrevealthatwhenthepoweris 20W,handlingdistanceis2mm,workingflowis0slpm,theoptimumtimefortheplasmaheliumtomutagenized sporesofs.mobaraensehs47was30s.spreadthemutagenicsporesdiluenttotabletsandscreensinglecolonies using96 welplateshigh throughputscreeningmethod.pickoutthehighyieldmutantstrainstogoonwithtwo roundsoftesttubescreening.amongtheproces,keeptheseparationandpurificationofstrains.finaly,one highyieldstrainm 8wasfound.ItsMTGenzymeactivitywas5.U/ml,increasedby82% comparedtothe startingstrainhs47whosemtgenzymeactivitywasonly2.8u/ml.thereaultsofshakingflaskfermentationof strainm 8showthatitsincreaseintheenzymeactivityresultsfromtheincreaseofMTGsecretionofunitstrain. TheMTGenzymeactivityofM 8ofeightbatcheshavenosignificantdiference,sothestrainhasgoodgenetic stability.thefoundofm 8providesstrainsupportandtheoreticalsupportforindustrializedproductionofMTG. Key words ARTP mutagenesis High through screening Streptoverticilium mobaraense Transglutaminase

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第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖