60 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 本文以富油土壤中筛选的革兰氏阳性细菌, 蜡状芽孢杆菌 W22 为出发菌株, 在优化发酵条件下 ( 初始 ph 值 8.0,32,200r/min 发酵 12h), 产磷脂酶 A1 酶活达 9.22U/ml,

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艮窦
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(10):59 66 基因组改组选育磷脂酶 A1 生产菌王洲薛正莲马琦亚苏燕南赵世光 ( 安徽工程大学生物与化学工程学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心芜湖 ) 摘要以蜡样芽胞杆菌 W22 为出发菌株, 通过紫外诱变和等离子体诱变得到若干株酶活力提高的突变株以紫外诱变突变菌株 W22 a W22 g 和等离子诱变菌株 W22 5 为基因组改组的亲本, 考察了原生质体的制备灭活条件原生质体的最佳制备条件是 : 溶菌酶浓度 0.5mg/ml, 酶解时间 90min, 反应温度 25, 预处理甘氨酸浓度为 20mg/ml 选择紫外灭活 160 秒热灭活 16 分钟的剂量来完成亲本原生质体的灭活从众多融合子中筛得一株突变株 WR2 2, 发酵酶活为 17.78U/ml, 相对于出发菌株 W22(9.22U/ml) 提高酶活达 92.8% 关键词磷脂酶 A1 紫外诱变等离子诱变基因组改组中图分类号 Q933 磷脂酶 A1(phospholipaseA1,PLA1,EC ) 是一种专一水解卵磷脂 sn 1 酰基产生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶类在植物油脱胶焙烤食品工业奶制品加工业蛋黄酱加工业等领域具有广泛的用途 [1] 目前商业化生产的磷脂酶 A1 主要由丹麦诺维信公司生产 [2 4], 国内对磷脂酶 A1 的研究相对迟缓 [5 7], 选育得 [8] 到的菌株产量与国外存在较大差距,Kim 等于 1996 年从土壤中筛选到一株产磷脂酶 A1 的沙雷氏菌, 培养基进行优化后, 酶活由最初的 4U/ml 提高至 31U/ml [9] Hartmann 等于 2000 年使用化学突变单细胞融合技术以及分子生物学手段基因杂交技术, 筛选得到了 4 株嗜热四膜虫 (Tetrahymenathermophila) 属的突变株, [10] 酶活最高可达 35.2±2.60U/ml 在国内, 付建红等于 2008 年筛选到一株产低温碱性的磷脂酶 A1 菌株 xjf1, 经初步鉴定, 为居泉沙雷氏菌通过发酵条件优化后, 磷脂酶 A1 活力最高达 17.5U/ml 2010 年, 司 [11] 武阳等从富油土壤中筛选到一株具有较高磷脂酶 A1 活力的沙雷氏菌, 经优化后酶活达到 18.68U/ml 因此, 通过各种育种方法来开发磷脂酶 A1 菌株是一项很有意义的工作收稿日期 : 修回日期 : 安徽省自然科学基金 ( M81) 安徽省高校自然科学基金 (KJ2009A168) 资助项目电子信箱 :wangzhou0920@126.com 等离子体诱变系统作为新兴的诱变方法无需抽真空且可避免高温对细胞的损伤, 已在阴沟肠杆菌 (Enterobactercloacae) 茂源链轮丝菌绿色木霉 (Trichodermaviride) [12 14] 的诱变中取得了良好的效果紫外诱变作为一种传统的诱变方法, 应用时间最长研究最多操作简便安全, 也是应用最广泛的育种方法之一原生质体融合又称体细胞杂交, 通过酶解使亲本形成原生质体, 然后在高渗环境中加入理化或者生物的助融条件, 使亲本通过这种无性的方式融合形成一个或者多核的杂合细胞的过程该方法打破了微生物的种属界限, 融合亲本不受种属的限制, 实现远缘菌株间的基因重组, 可使遗传物质传递更为完整获得更多基因重组的机会, 且可以在没有对亲本进行详细的研究基础上进行 [15] 原生质体融合技术与传统微生物诱变育种方法的结合即为基因组重排技术 (genomeshufling), 是由美国加州 Maxgen 公司于 20 世纪 90 年代在原生质体融合技术的基础上提出该方法也是当前微生物育种的一个应用和研究热点, 很受育种工作者的重视简而言之, 利用传统诱变手段筛选出正向突变菌株, 然后通过原生质体递推式融合使正向突变的若干个菌株进行原生质体融合, 筛选出符合育种要求的融合子, 从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株

2 60 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 本文以富油土壤中筛选的革兰氏阳性细菌, 蜡状芽孢杆菌 W22 为出发菌株, 在优化发酵条件下 ( 初始 ph 值 8.0,32,200r/min 发酵 12h), 产磷脂酶 A1 酶活达 9.22U/ml, 选取紫外诱变和等离子诱变手段获得磷脂酶酶活提高突变菌株, 并以此作为原生质体融合亲本, 通过原生质体的制备灭活融合和再生, 从众多融合子中筛选出一株产磷脂酶 A1 相对于出发菌株酶活提高的融合子 1 材料 1.1 菌种来源实验室筛选保存的产磷脂酶 A1 菌株 : 蜡样芽胞杆菌 W 试剂胰蛋白胨酵母提取物琼脂糖琼脂粉葡萄糖等购自生工生物 ( 上海 ) 股份有限公司, 蛋白酶 K 溶菌酶 PEG 6000 等购自 BBI 1.3 培养基筛选培养基 (PLB): 卵磷脂 2%, 胰蛋白胨 1%, NaCl1%, 酵母粉 0.5%, 溴甲酚紫 3%,25mmol/L CaCl 2,pH7.0 卵磷脂加少量 Tween 80, 用高速匀浆机乳化后单独灭菌平板固体培养基加入 2% 琼脂粉高渗溶液 :0.6mol/L 的蔗糖溶液高渗培养基 : 以 0.6mol/L 的蔗糖溶液代替 PLB 中的水即可种子培养基 (LB): 胰蛋白胨 1%,NaCl1%, 酵母粉 0.5%,pH7.0 发酵培养基 : 卵磷脂 2%, 胰蛋白胨 1%,NaCl1%, 酵母粉 0.5%,25mmol/LCaCl 2,pH7.0 卵磷脂乳化后单独灭菌 2 方法 2.1 菌株诱变菌悬液的制备出发菌株 W22 在液体 LB 培养基中 37,200r/min 培养过夜将获得的菌液在 4000r/min 4 条件下离心 10min, 去上清, 用无菌生理盐水洗涤菌体 2~3 次, 最后用生理盐水调整成 10 8 CFU/ml 的菌悬液 [16] 紫外线诱变处理取 6ml 菌悬液于 9cm 的无菌培养皿中 ( 内置灭过菌的磁力转子 ), 用紫外灯 (15W,30cm) 分别照射 30s 60s 90s 120s 150s 180s 210s, 待诱变结束后, 每个时间点菌液稀释涂布浓度梯度 ( 除诱变处理外整个操作过程均红光中进行 ), 每个梯度两个平行, 于 37 避光培养 3~4d, 并注意观察菌落生长情况, 计算致死率和正突变率致死率 =( 未辐照总菌落数 - 诱变总菌落数 )/ 未辐照总菌落数 100%; 正突变率 =( 诱变菌株的圈径比大于出发菌株的圈径比的个数 / 诱变处理后总菌落数 ) 100% [17] 等离子诱变处理采用高纯氦气作为等离子体的工作气体, 在电源功率 40W, 照射距离 2mm, 气流量 12.5L/min 条件下, 对 10μl 菌悬液进行等离子体照射, 选择照射时间为 0s,10s,20s,30s,40s,50s,60s, 70s,80s 诱变结束后, 用镊子将样品载片取出, 放置于装有 1ml 灭菌生理盐水的离心管中, 震荡使菌体彻底悬浮于生理盐水中, 再用生理盐水稀释至 , 分别取 100μl 涂布于筛选平板上, 每个梯度两个平行, 后续操作与节相同 2.2 突变株的筛选 (1) 平板初筛 : 在含卵磷脂的筛选平板上, 可以产生磷脂酶 A1 的菌落会水解培养基中的卵磷脂产生晕圈, 晕圈的大小与酶活的高低呈正相关, 圈径比值比出发菌株圈径比值大的菌株为正突变菌株 (2) 摇瓶复筛 : 将初筛挑取的正突变株和出发菌株分别接种于 LB 培养基中, 过夜培养后, 按照 1% 的接种量转接至发酵培养基中,32,200r/min 发酵 12h 取发酵液 12000r/min 离心 3min, 上清即为粗酶液, 测定磷脂酶 A1 活力, 挑选保存酶活较高的菌株 2.3 磷脂酶 A1 酶活定量测定磷脂酶 A1 的酶活测定参照国标 GBT , 由于磷脂酶 A1 在水解卵磷脂过程中会产生脂肪酸, 使用 NaOH 滴定可以定量酶反应过程中产生的自由脂肪酸的量酶活力定义为 : 在一定条件下,1min 内水解卵磷脂产生 1 微摩尔 (μmol) 游离脂肪酸所需的酶量即为一个酶活力单位 (U) 具体步骤如下: 将 4ml8% 乳化后的卵磷脂溶液与 5mlpH6.050 mmol/l 磷酸缓冲液混合后 45 温浴 5min, 加入 1ml 粗酶液,45 200r/min 反应 15min, 加入 6ml95% 乙醇终止反应, 用标准 NaOH 滴定至 ph 值为 10.3, 对照组为先加 6ml95% 乙醇再加粗酶液计算实验组和对照组的 NaOH 消耗差值, 由于 0.05mol/L 的 NaOH 标准溶液 1.00ml 相当于 50μmol 的脂肪酸, 因此可以按照以下公式计算酶活酶活计算公式 :E=(V2-V1) c 50 n/(0.05

3 2013,33(10) 王洲等 : 基因组改组选育磷脂酶 A1 生产菌 61 t m) 其中 :E: 酶活 (U/ml) V2: 实验组 NaOH 消耗量 (ml); V1: 对照组 NaOH 消耗量 (ml); c:naoh 标准液的浓度 (mol/l); 50~0.05mol/L 的 NaOH 标准溶液 1.00ml 相当于 50μmol 的脂肪酸 ; n: 酶液样品的稀释倍数 ; t: 测定酶活时的反应时间 (min); m: 加入的酶量 (ml) 2.4 基因组改组育种原生质体的制备将诱变后的菌株接种培养 (37,200r/min), 取对数后期的培养液 10ml 离心收集菌体, 高渗溶液洗涤 3 次考查溶菌酶浓度酶解温度酶解时间和甘氨酸浓度对原生质体制备的影响, 确定最佳原生质体制备条件正交试验设计见表 1 因素水平表 1 因素水平表 Table1 Thetableoffactorsandlevels 溶菌酶浓度 (mg/ml) 酶解时间 (min) 酶解温度 ( ) 甘氨酸浓度 (mg/ml) 计算原生质体形成率和再生率 : 形成率 = (A- B)/A 100%; 再生率 =(C -B)/(A-B) 100%, 其中 A: 总菌落数, 即未经溶菌酶处理的菌悬液涂布于 LB 固体平板上生长的菌落数 ;B: 未原生质体化的细胞数, 即酶解混合液经蒸馏水稀释后涂布于 LB 固体平板上生长的菌落数 ;C: 再生菌落数, 即酶解混合液经高渗溶液稀释后涂布于再生培养基上生长的菌落数原生质体的灭活紫外灭活 : 在优化的原生质体制备条件下用生理盐水将原生质体重悬, 稀释到 10 6 CFU/ml 取 2ml 重悬液置于灭菌的平板中, 在 15w 紫外灯距离 30cm 处分别照射 0s 40s 60s 80s 100s 120s 140s 160s 180s 热灭活 : 取 2ml 制得的重悬菌液于灭过菌的培养管中, 置于 55 的水浴锅中分别保温 8min 10min 12min 14min 16min 18min 将上述紫外灭活和热灭活处理的原生质体悬浮液立即稀释到适当浓度后涂布于高渗平板上,37 恒温培养, 菌落计数并计算灭活率, 确定处理的致死时间原生质体的融合和再生混合加入等量经紫外致死热致死的原生质体 W22 a W22 g W22 5 各 1ml 于小锥形瓶中, 加入终浓度 45% 的 PEG mol/LCaCl 2 在 30 的恒温培养箱中轻轻振荡, 10min 后用高渗溶液离心洗涤重悬最后, 稀释适当倍数后接种于若干个高渗筛选平板上, 于 37 恒温培养, 并观察菌落生长情况待长到一定程度, 挑出圈径比大的融合子进行摇瓶复筛遗传稳定性考察以出发菌株作对照, 将筛选得到酶活较高的融合子传代 5 次后摇瓶发酵测定磷脂酶 A1 活力, 考察菌株的遗传稳定性 3 结果与分析 3.1 紫外诱变致死率和正突变率将制备好的菌悬液处理后, 以紫外处理时间为横坐标, 对应百分比为纵坐标, 得到致死率曲线, 如图 1, 随着处理时间的增长, 菌的致死率也逐渐增高, 当处理 120s 时致死率达到 89.4%, 此时正突变率也相对很高达到 38% 所以对 W22 的紫外诱变处理, 选择 120s 为最佳诱变剂量图 1 W22 菌株紫外诱变致死率和正突变率致死率 ; 正突变率 Fig.1 Lethalityandpositivemutantsratioof UVmutagenesisfrom W22stain 紫外诱变初筛确定紫外诱变最佳诱变剂量后进行菌株的紫外诱变初筛, 以平板菌落圈径比作为初筛指标, 结果如图 2 所示经过紫外诱变后, 出现了浑浊圈大小不一的菌落, 根据菌落浑浊圈直径与菌落直径的比值 ( 圈径比 ), 筛选出圈径比明显增大的菌株, 将筛得 8 株菌株进一步做摇瓶复筛紫外诱变复筛将初筛得到的 8 株菌进行发酵培养并测定磷脂酶 A1 酶活, 发酵条件设定为初始 ph 值 8.0,32,200r/min 发酵 12h 后测定酶活, 各菌

4 62 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 图 2 W22 菌株紫外诱变初筛 (a) 紫外诱变平板初筛 (b) 紫外诱变突变株圈径比 Fig.2 PreliminaryscreeningofUVmutants 株发酵实验重复设定为 3 经酶活测定比较,W22 a W22 g 酶活较高且产酶稳定, 酶活达到 12.45U/ml 和 10.75U/ml 出发菌株及诱变菌株复筛酶活大小如图 3 所示以此确定 W22 a 和 W22 g 为原生质体融合亲本, 进行下一步实验研究 [18] 图 4 W22 菌株等离子诱变致死率和正突变率 Fig.4 Mutageniclethalityrateandpositivemutation rateofw22strainplasmamutation 图 3 W22 紫外诱变复筛 Fig.3 EnzymeactivityofW22UVmutants 3.2 等离子诱变致死率和正突变率出发菌株 W22 经不同时间照射后, 以等离子处理时间为横坐标, 致死率为纵坐标作图, 得到等离子诱变曲线, 如图 4 所示随着诱变时间的增加,W22 菌株的致死率也逐渐上升,30s 的时候致死率已达到 92.3%, 正突变率较高达到 42%, 所以实验最终确定最佳诱变时间为 30s W22 菌株等离子诱变初筛和复筛经等离子诱变后, 菌落生长良好, 初筛平板上正突变株较多, 浑浊圈大小对比明显, 如图 5(a) 诱变后圈径比较出发菌株明显增大的一共有 21 株菌株, 选取进行摇瓶复筛, 复筛酶活测定结果见图 5(B) 如图所示,W22 1, W22 5,W22 10,W22 19 和 W22 21 酶活较高, 其中 W22 5 最高为 12.82U/ml, 比诱变出发菌株酶活 9.22U/ml, 提高了 39.04%, 保存菌株 W22 5 进行基因组改组育种 3.3 基因组改组本文以紫外诱变菌株 W22 a,w22 g 和等离子诱变菌株 W22 5 为亲本株, 利用灭活原生质体的方法作为筛选融合子的手段, 即在对亲本进行原生质体紫外照射加热, 使得原生质体丧失在再生培养基上生长的能力而在特定的条件下发生融合则可能由于互补而形成有活性的异核的杂合二倍体, 通过染色体交换而产生重组体原生质体的制备按照水平因素表进行正交试验, 综合考察溶菌酶的浓度酶解时间处理温度以及甘氨酸浓度对突变株 ( 以 W22 a 为例 ) 原生质体形成率和再生率的影响, 结果见表 2

5 2013,33(10) 王洲等 : 基因组改组选育磷脂酶 A1 生产菌 63 [18] 图 5 W22 菌株等离子诱变筛选 (a) 等离子诱变平板初筛 (b) 等离子诱变摇瓶复筛 Fig.5 ScreenofW22plasmamutants 表 2 正交试验设计及对原生质体形成率及再生率的影响 Table2 Influenceoforthogonaldesignonprotoplastformationrateandregenerationrate 水平因素形成率 (%) 再生率 (%) I I I I I I R R 由表 2 可以看出, 不同的原生质体制备条件, 均表现出较高的原生质体形成率且形成率较为一致, 而不同制备条件下的原生质体再生率却相对差异较大由正交数据可看出, 酶解时间对原生质体形成率影响较大, 溶菌酶浓度对再生率影响较大综合考虑各因素, 本文设定原生质体最适制备条件为, 溶菌酶浓度 0.5mg/ml, 酶解时间 90min, 反应温度 25, 预处理甘氨酸浓度为 20mg/ml 原生质体显微观察结果如图原生体的灭活不同条件下对原生质体进行致死处理后, 在再生平板上的生长情况如表 3

6 64 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 图 6 原生质体的显微观察 (a) 未酶解时的菌体状态 (b) 酶解后形成的原生质体状态 Fig.6 Microscopicobservationofprotoplast 表 3 紫外及加热对原生质体灭活影响 Table3 EfectofheatandUVirradiationoninactivatingofprotoplast 时间 (s) 紫外 (UV) 致死率 (%) 时间 (min) 热处理致死率 (%) 由表 3 可知, 在两种原生质体致死处理方式中, 其灭活率均随着致死剂量的增加而增大紫外灭活时, 当剂量达到 140s 时, 其灭活率为 92.6%,160s 时达到 100% 灭活 ; 同样, 在热灭活剂量为 16min 时, 其灭活率达到 100% 因此, 我们选择紫外灭活 160s 热灭活 16min 的剂量来完成亲本原生质体的灭活采取紫外灭活和加热灭活两种方法对融合的原生质体进行灭活, 由于致死机理的差异, 更有利于亲本原生质体实现互补融合再生原生质体的融合及筛选按照上述方法制备 W22 a W22 g W22 5 的原生质体, 并进行紫外灭活和热灭活处理后进行融合操作, 并实时观察融合子在高渗再生平板上的生长情况, 待长出后, 小心点种到普通的磷脂酶筛选平板上, 挑选出圈径比大的菌株进行摇瓶复筛, 摇瓶复筛实验重复 3 次, 分别测定酶活融合子筛选平板生长情况及复筛酶活测定结果如图 7 所示, 挑出的融合子的酶活相对于亲本基本都有提高其中 WR2 2 酶活最高, 为 17.78U/ml, 相对于 W22 5 亲本提高了 38.69%, 涂布该菌于 PLB 平板, 如图 8 经观察 WR2 2 的菌落形态和亲本相比菌落偏小, 但是圈径比却明显增大, 融合子 WR2 1 菌落表现出光滑的特点, 结果见图 9 图 7 融合子的筛选 (a) 融合子在高渗平板上生长情况 (b) 融合子摇瓶发酵酶活 Fig.7 Screeningoffusants

7 2013,33(10) 王洲等 : 基因组改组选育磷脂酶 A1 生产菌 65 参考文献 [1]GregoryS,Richmond,TeryK.Smith.PhospholipasesA1.IntJ MolSci,2011,12: [2] 杨博, 王宏建. 经济环保的酶法脱胶技术. 中国油脂,2004,29 (3): Yang B, Wang H J. Economicaland environment friendly 图 8 WR2 2 在 PLB 培养基上的生长情况 Fig.8 ThegrowthofWR2 2inthePLBmedium 图 9 W22 和融合子在 PLB 平板上的菌落形态 Fig.9 ThecolonymorphologyofW22and fusantsonplbplate 遗传稳定性实验将酶活较高的融合子 WR2 1 WR2 2 和 WR2 9 进行传代培养, 传代 5 次后 WR2 1 和 WR2 2 遗传稳定, 而融合子 WR2 9 出现一定程度退化, 结果如表 4 保存酶活力大幅提高并且遗传性状稳定的融合子表 4 酶活稳定性分析 Table4 Analysisofthefusionenzyme stabilityinactivity 酶活 (U/ml) 菌株初始融合子传代 5 次 WR WR WR 结论本研究通过对富油土壤中筛选到的产磷脂酶 A1 蜡样芽胞杆菌 W22 进行诱变选育, 筛选酶活提高最多最稳定的 3 株菌株作为亲本进行基因组改组, 对改组后的菌株进行发酵酶活测定, 筛选获得融合子 WR2 2 酶活提高最多, 达到 17.78U/ml, 相对于出发菌株 W22 的酶活 9.22U/ml, 提高了 92.8%, 并可进行稳定遗传 techiqueofenzymaticdegumming.chinaoilsandfats,2004,29 (3): [3] 高荫榆, 郭磊, 丁红秀, 等. 植物油脱胶研究进展. 食品科学, 2006,27(9): GaoY Y,GuoL,DingH X,etal.Developmentreview on vegetableoildegumming.foodscience,2006,27(9): [4] 杨继国, 杨博, 孟炯, 等. 新型磷脂酶 LecitaseUltra 用于大豆油脱胶的研究. 中国油脂,2003,28(10): YangJG,YangB,MengJ,etal.Soybeanoildegummingbya novelphospholipase lecitaseultra.chinaoilsandfats,2003,28 (10): [5] BoYang,RongZhou,Ji GuoYang,etal.Insightintothe enzymaticdegummingprocesofsoybean oil. Journalofthe AmericanOilChemistsSociety,2008,85(5): [6]MehranJahani,AlizadehM,PirozifardM,etal.Optimizationof enzymaticdegummingprocesforricebranoilusingresponse surfacemethodology.foodscienceandtechnology,2008,41 (10): [7]GuralaSheelu,KavithaG.Eficientimmobilizationoflecitasein gelatinhydrogelanddegummingofricebranoilusingaspinning basketreactor.journaloftheamericanoilchemistssociety, 2008(85): [8]KimM K,Kim JK,RheeJS.IsolationofPhospholipaseA1 producingmicroorganisms.industrialmicrobiol,1996,16: [9]HartmannM,GubermanA,Florin Christensen.Screeningfor andcharacterizationofphospholipasea1hypersecretorymutantsof Tetrahymenathermophila.ApplMicrobiolBiotechnol,2000,54: [10] 付建红, 唐辉桂, 姚斌, 等. 一株产低温碱性磷脂酶 A1 耐冷细菌的筛选及发酵条件的初步研究. 工业微生物.2008,38 (5): FuJH,TangH G,YaoB,etal.Screeningofpsychrotrophic bacteriaproducingcold adaptedalkalinephospholipasea1and preliminary studieson itsfermentation conditions. Industrial Microbiology,2008,38(5): [11] 司武阳, 薛正莲, 赵梦梦, 等. 磷脂酶 A1 产生菌株的筛选. 食品与发酵科技,2010,46(2):27 30.

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