2015,35(2) 石漫漫等 : 高产雷帕霉素的游动放线菌菌种的选育 73 的雷帕霉素的生产主要通过吸水链霉菌的发酵富集和分离纯化得到, 且其产量很低, 国内文献报道的最高产量也仅达到 450mg/L 左右但 Kojima [14] 等报道游动放线菌也能合成雷帕霉素, 且其合成能力比吸水链霉菌

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2015,35(2):72 77 DOI: /j.cb 高产雷帕霉素的游动放线菌菌种的选育 1 石漫漫 1,2 乔长晟朱 1 明李 2 雪 1 刘姗姗 (1 天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津 ) (2 天津北洋百川生物技术有限公司天津 ) 摘要以游动放线菌 (Actinoplanes)BCLP 016 为出发菌株, 采用常压室温等离子体 (ARTP) 诱变技术对其孢子进行处理, 并将三个不同时间处理的孢子悬液混合稀释涂布后, 根据菌株菌落形态挑取部分单菌落进行初筛, 经发酵复筛后, 筛选得到了一株雷帕霉素高产菌株 ARTP 039, 其雷帕霉素的产量可达到 mg/L, 较出发菌株 BCLP 016 的产量 mg/L, 提高了 43.81% 以筛选出的 ARTP 039 高产菌为出发菌株, 进行传统的紫外诱变, 选取高中低三个致死率相对应的时间对其孢子悬液进行处理, 并基于核糖体工程的理论选取了链霉素庆大霉素利福平氯霉素和红霉素五种抗性物质, 进行抗性初筛发酵复筛后, 最终筛选得到了一株雷帕霉素高产菌株 St 8 +Gen 6 +Rif 9 +Chl 3 +Er 4 015, 该菌株同时具有五种抗性该菌株的摇瓶实验结果表明, 发酵 7d 后, 其雷帕霉素的产量可达到 mg/L, 较出发菌株 BCLP 016 的产量, 提高了 %, 且其遗传稳定性良好关键词雷帕霉素游动放线菌常压室温等离子体诱变紫外诱变核糖体工程中图分类号 Q819 雷帕霉素 (rapamycin) 又名西罗莫司, 是具独特作用机制的含氮三烯大环内酯类抗生素, 具有抗真菌抗增殖和抗肿瘤作用 [1] 雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型强效免疫抑制剂, 可用于器官移植抗排斥作用, 它的免疫抑制作用比环孢菌素强数十倍, 是肾毒性最低的免疫抑制剂, 还可用于治疗类风湿性关节炎红 [2] 斑狼疮等自身免疫性疾病, 目前发展为基因治疗药和抗肿瘤药物 [3], 具有广阔的应用前景常压室温等离子体 (atmospheric and room temperatureplasma,artp) 诱变技术是近几年来发展起来的一种微生物诱变育种技术该技术无需真空装置, 操作简易, 成本低, 产生的等离子体分布均匀, 射流温度低, 活性粒子浓度高用该技术处理微生物菌种时, 与生物大分子和细胞的作用效果明显, 微生物基因组的突变速度快产生突变的多样性大, 是获得非转基因生物的有效手段 [4 7] 收稿日期 : 修回日期 : 通讯作者, 电子信箱 :qiaochangsheng@163.com 紫外线是一种使用最早沿用最久应用广泛效果明显的物理诱变剂尽管几十年来, 不断有各种新的诱变剂出现, 但到目前为止, 经诱变处理后得到的抗生素高产菌中, 有 80% 左右是通过紫外线诱变后经筛选获得的紫外线迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一 [8 10] 核糖体工程 (ribosomeengineering) 是由日本国家 [11] 食品研究所的 Ochi 教授首先提出的, 它以胞内的核糖体和 RNA 多聚酶为对象, 利用各类抗生素的抗性突变作为筛选标记来表征二者的功能变化, 从转录和翻译两个水平来激活微生物细胞的生物合成潜能 [12] 其 [13] 理论依据是微生物核糖体在结构上经过修饰改造后可以直接或间接地激活表达次级代谢调控相关的沉默基因, 进而激发微生物的生物合成潜能, 大幅度提高其次级代谢产物的产量甚至从中获得新的生物活性物质雷帕霉素广泛的应用, 使其具有明显的社会和经济效益, 其市场需求也在逐渐增大, 而目前国内外报道

2 2015,35(2) 石漫漫等 : 高产雷帕霉素的游动放线菌菌种的选育 73 的雷帕霉素的生产主要通过吸水链霉菌的发酵富集和分离纯化得到, 且其产量很低, 国内文献报道的最高产量也仅达到 450mg/L 左右但 Kojima [14] 等报道游动放线菌也能合成雷帕霉素, 且其合成能力比吸水链霉菌 ATCC29253 强 10 倍以上, 但尚未见该菌用于生产的报道本研究以游动放线菌 BCLP 016 为出发菌株, 首次将常压室温等离子体诱变和紫外诱变复合, 用于高产雷帕霉素菌株的选育中, 以提高雷帕霉素的产量, 便于其进一步工业化生产, 满足市场需求 1 材料与方法 1.1 菌株游动放线菌 (Actinoplanes)BCLP 016, 由天津北洋百川生物技术有限公司保存 1.2 培养基斜面及平板培养基 : 燕麦片 35g/L, 葡萄糖 15g/L, 酵母粉 10g/L, 蛋白胨 8g/L, 琼脂 20g/L, 碳酸钙 3g/L, ph7.0~7.2,121, 灭菌 20min 种子培养基 : 可溶性淀粉 25g/L, 蛋白胨 5g/L, 葡萄糖 20g/L, 黄豆饼粉 10g/L, 碳酸钙 3g/L,pH7.0~ 7.2,121, 灭菌 20min 发酵培养基 : 葡萄糖 45g/L, 黄豆饼粉 40g/L, 淀粉 15g/L, 硫酸铵 1g/L, 碳酸钙 4g/L,pH7.0~7.2, 121, 灭菌 30min 1.3 试剂实验所用链霉素庆大霉素氯霉素和红霉素均购自生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司, 利福平购自北京索莱宝科技有限公司 1.4 方法雷帕霉素含量的测定采用高效液相色谱法 (HPLC), 具体的操作条件如下 : 高效液相色谱 Agilenttechnologies1200series, 检测器 : 紫外检测器 ; 色谱柱 GRACEAltima TM C185u mm,5μm; 流动相 : 甲醇乙腈水 = (v v v); 流速 :1ml/min, 检测波长 :277nm, 进样量 :20μl ph 的测定采用 PHSJ 4A 型数显式 ph 计测定 ph 值 1.5 菌株的诱变处理菌株的诱变处理流程制备出发菌株孢子悬液常压室温等离子体 (ARTP) 诱变根据菌落形态初筛发酵复筛斜面保存, 检验稳定性制作高产菌株的孢子悬液紫外诱变根据核糖体工程原理抗性初筛发酵复筛转接斜面保存, 遗传稳定性实验出发菌株的 ARTP 诱变 (1) 单孢子悬液的制备取活化好的出发菌株 BCLP 016 斜面用 0.85% 的生理盐水洗下, 用接种针将孢子刮下制成孢子悬浮液, 再将其转入带有玻璃珠的三角瓶内充分振荡, 打散后用带有纱布和棉花的无菌漏斗过滤, 得单孢子悬浮液, 使孢子数量控制在 10 7 ~10 8 个 /ml (2)ARTP 诱变致死率曲线的制作本实验采用由清华大学研发的常压室温等离子体诱变系统, 对出发菌株 BCLP 016 的孢子进行处理取 10μl 单孢子悬液于直径为 1cm 的圆形铁片上, 置于以氦气作为工作气体, 电源功率为 110W, 工作气流量 10L/min 的常压室温等离子体诱变系统中, 处理距离为 2mm, 分别处理 s 将处理完的小铁片置于装有 1ml0.85% 生理盐水的 EP 管中, 并将上述 10 个照射剂量的孢子悬液分别进行梯度稀释, 取各照射剂量的 10 1,10 2,10 3 三个稀释度的孢子悬液 0.1ml 涂平板, 每个梯度做三个平行将平板于 28 的培养箱中倒置培养 10~14d, 以未经 ARTP 处理的孢子悬液 ( 处理 0s) 涂布的平板做对比, 计算致死率以 ARTP 处理时间为横坐标, 致死率为纵坐标绘制致死率曲线 (3)ARTP 诱变后菌株的初筛选择高中低三个不同致死率下的照射时间, 分别对出发菌株 BCLP 016 的孢子悬浮液进行常压室温等离子体诱变处理 ; 然后把不同照射时间的孢子悬液混合均匀, 取 1ml 混合液进行梯度稀释, 取 10 2,10 3,10 4 三个稀释度的孢子悬液进行涂布平板 28, 倒置培养 10~14d 后, 根据菌落的形态变化, 随机挑选部分具有特殊形态的单菌落, 转接斜面保藏 (4) 菌株的复筛用 0.85% 的生理盐水 10ml 将斜面菌株的孢子洗下, 转接 3ml 孢子液到种子培养基中, 每株斜面的孢子液转接 2 个种子摇瓶,28, 220r/min, 培养 48~54h; 转接 5ml 种子液到发酵培养基, 每瓶种子液转接 2 瓶发酵作为平行,28,220r/min 发酵 7d 取新鲜的雷帕霉素发酵液, 加入等体积甲醇, 于 220r/min 下振荡浸提 2h,12000r/min 离心 10min, 取上清液, 过针孔过滤器后, 用 HPLC 测定上清液中雷帕霉素的含量, 其结果取四瓶发酵的平均值将获得的高产菌株转接斜面保存 (5) 高产菌株的遗传稳定性实验将筛选出的高产菌株在斜面培养基上连续转接 4~6 代, 每代菌株转接 3 瓶发酵作为平行, 检测雷帕霉素的产量, 并对各代

3 74 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 菌株的雷帕霉素产量进行分析比较, 检验菌株的遗传性状是否稳定高产菌株的紫外诱变 (1) 紫外诱变致死率曲线的制作对通过上述 ARTP 诱变获得的高产菌株, 进行紫外诱变处理, 以通过复合诱变的手段, 进一步获得高产菌株 a 按照节的方法制作高产菌的单孢子悬液, 取 5ml 于直径 7cm 带有转子的平皿中, 将平皿放在诱变箱的磁力搅拌器上 b 将磁力搅拌器置于功率为 30W 的紫外灯下 30cm 处, 打开紫外灯, 预先照射 20min 稳定波长, 开启磁力搅拌器, 打开皿盖, 分别照射 0,10,30,45,60,75, 90,120,150,180 c 将上述 10 个不同照射时间的孢子悬液分别进行梯度稀释, 取各照射时间 10 1 ~ 个稀释度的孢子悬液 0.1ml 分别涂布平皿, 每个梯度做三个平行 d 在 28 避光的环境下, 将平皿倒置培养 10~14 天, 观察平板上单菌落的生长情况以未经紫外线处理 ( 处理 0s) 的孢子悬浮液涂布的平板作对比, 计算致死率, 以紫外照射时间为横坐标, 致死率为纵坐标作图绘制致死率曲线 (2) 抗性物质对高产菌株最低抑制浓度 (MIC) 的确定按照节中孢子悬液的制备方法, 将高产菌株的孢子悬液 1ml 转接到含有不同抗性物质不同设计水平的种子培养基中, 每个处理做三个平行, 于 28,220r/min 的摇床中培养 7~9d 将培养得到的种子液稀释涂布, 观察平板上菌株的生长情况, 以确定抗性物质对该菌的最低抑制浓度 (MIC) 所设计的抗性物质浓度见表 1 表 1 抗性物质浓度表 Table1 Resistantsubstanceconcentrationtable 抗性物质设计水平链霉素 (mg/l) 利福平 (mg/l) 庆大霉素 (mg/l) 氯霉素 (mg/l) 红霉素 (mg/l) (3) 菌株的诱变与筛选选择高中低三个不同致死率下的照射时间, 分别对获得的高产菌株的孢子悬浮液进行紫外照射处理 ; 然后把不同照射时间的孢子悬液混合均匀, 吸取 1ml 混合的孢子悬液转接于含有不同抗性物质的种子培养基中, 每种抗性物质的每个浓度有两个平行,28,220r/min 培养 7~9d 通过观察种子液的颜色变化, 以及划板验证, 在含有相应抗性物质的种子培养基中能够生长的, 即为具有此种抗性的菌株, 按照这种方法, 将得到的抗性菌的种子液交叉接入含有其他抗性物质的摇瓶里培养每步得到的抗性种子液都做 10 倍系列稀释, 取三个稀释度的种子液涂布,28 培养 5~8d, 挑选长出的单菌落, 转接斜面保藏对初筛菌株斜面按照中的方法进行菌株的复筛, 并对筛选得到的高产菌株按照中的方法检验其遗传稳定性 2 结果与讨论 2.1 常压室温等离子体诱变选育常压室温等离子体诱变的致死率曲线及诱变剂量的选择为确定常压室温等离子体 (ARTP) 对出发菌株的诱变剂量, 本研究按照中的方法测定了 ARTP 分别照射 s 的致死率, 得到的致死率曲线如图 1 所示图 1 ARTP 诱变的致死率曲线 Fig.1 ThefatalityratecurveofARTPmutagenesis 从图 1 可以看出, 在 ARTP 照射时间为 75s 时, 致死率达到了 86%, 当照射时间分别为 30s 和 45s 时, 致死率分别为 20% 和 46% 对于不同的菌株, 在不同的致死率下, 其正突变率不容易确定, 所以为了增加筛选出高产菌株的概率, 本研究采用的 ARTP 诱变剂量为 30s,45s,75s, 将经过这三个照射时间处理的孢子悬液混合后, 经过稀释涂布, 随机挑选具有特殊形态的单菌落用于初筛菌株的筛选结果经过 ARTP 诱变后, 在平板

4 2015,35(2) 石漫漫等 : 高产雷帕霉素的游动放线菌菌种的选育 75 上挑选具有特殊形态的单菌落, 其中具有代表性的主要有 139 株, 其典型的形态特征为 : 不规则凸起六瓣形凸起四瓣形凸起褶皱形凸起盆地形凸起以及平地形, 且出发菌株 BCLP 016 的菌落形态为不规则凸起对挑选出来的具有特殊形态的菌株进行发酵复筛, 以筛选得到雷帕霉素高产菌, 并考查经诱变后菌落形态与雷帕霉素产量的关系由发酵复筛结果可知, 平地形的菌株负突变率较高, 不规则凸起以及盆地形凸起的菌株正突变率较高通过 ARTP 诱变的方法, 经发酵复筛最终筛选得到一株产量比较高的菌株 ARTP 039, 其雷帕霉素的产量可达到 mg/L, 较出发菌株 BCLP 016 的产量 mg/L, 提高了 43.81%, 其菌落形态为盆地形凸起高产菌株 ARTP 039 的遗传稳定性实验将筛选出的高产菌株 ARTP 039 在斜面培养基上连续转接 6 代, 其产孢速度基本一致 ; 雷帕霉素的产量稳定在 ~365.67mg/L, 其结果见表 2, 表明该菌株的遗传性能稳定表 2 ARTP 039 的遗传稳定性 Table2 ThegeneticstabilityofARTP 039 传代数产量 (mg/l) 2.2 紫外诱变选育紫外诱变的致死率曲线及诱变剂量的选择不同菌株对紫外照射的耐受程度不同, 为确定紫外诱变的剂量, 本研究测定了紫外线分别照射 0,10,30,45, 60,75,90,120,150,180 对菌株 ARTP 039 的致死率, 得到的致死率曲线如图 2 所示从图 2 可以看出, 在紫外照射时间为 60s 时, 致死率达到了 88%, 当照射时间分别为 10s 和 30s 时, 致死率分别为 8% 和 30% 对于不同的菌株, 在不同的致死率下, 其正突变率不容易确定, 所以为了增加抗性筛选的概率, 本研究采用的紫外诱变剂量为 10,30,60s, 将经过这三个照射时间处理的孢子悬液混合后用于初筛抗性物质对菌株 ARTP 039 的最低抑制浓度 (MIC) 由表 3 可以看出链霉素利福平庆大霉素氯霉素和红霉素对菌株 ARTP 039 的最低抑制浓度分别为 0.08,0.6,0.6,2 和 0.04mg/L 为了得到能耐受这图 2 紫外诱变的致死率曲线 Fig.2 ThefatalityratecurveofUVmutagenesis 些物质的抗性菌株, 在最低抑制浓度的基础上, 分别以 1 倍 MIC 和 1.5 倍 MIC 作为筛菌剂浓度表 3 抗性物质对菌株 ARTP 039 的最低抑制浓度 (MIC) Table3 Theminimum inhibitoryconcentration (MIC)oftheresistantsubstanceonthestrain ARTP 039 筛菌剂 (mg/l) 链霉素 St 利福平 Rif 庆大霉素 Gen 氯霉素 Chl 红霉素 Er 设计水平注 : + 表示有菌生长, 其个数代表菌落数的多少 ; - 代表没有菌生长抗性菌株的筛选结果按照所给出的初筛思路来筛选具有不同抗性标记的诱变菌株, 分别得到了 St + 系列 St + Gen + 系列 St + Gen + Rif + 系列 St + Gen + Rif + Chl + 系列以及 St + Gen + Rif + Chl + Er + 系列的抗性菌株共 159 株, 转接斜面保藏, 用于摇瓶复筛最终筛选得到了一株具有链霉素庆大霉素利福平氯霉素和红霉素五种抗性的高产菌株 St 8 +Gen 6 +Rif 9 + Chl 3 +Er 4 015( 注 :St 8 +Gen 6 +Rif 9 +Chl 3 +Er 4 表示该菌株耐受五种抗性物质的浓度依次为

5 76 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 和 0.04mg/L,015 为该菌株的编号 ), 雷帕霉素的产量可达到 mg/L, 较出发菌株 BCLP 016 的产量 mg/L, 提高了 %; 较菌株 ARTP 039 的产量 mg/L 提高了 59.67% 遗传稳定性实验将筛选出的高产菌株 St 8 + Gen 6 +Rif 9 +Chl 3 +Er 在斜面培养基上连续转接 6 代, 其产孢速度基本一致 ; 雷帕霉素的产量稳定在 ~588.09mg/L, 其结果如表 4 所示, 表明该菌株的遗传性能稳定表 4 St 8 +Gen 6 +Rif 9 +Chl 3 + Er 的遗传稳定性 Table4 ThegeneticstabilityofSt 8 +Gen 6 + Rif 9 +Chl 3 +Er 传代数产量 (mg/l) 3 结论在进行 ARTP 诱变的过程中, 筛选得到了一株雷帕霉素高产菌株 ARTP 039, 其雷帕霉素的产量可达到 mg/L, 较出发菌株 BCLP 016 的产量 mg/l, 提高了 43.81%, 且其遗传稳定性良好在此过程中, 根据菌株的菌落形态进行初筛, 可以得出菌落形态为不规则凸起以及盆地形凸起的菌株, 正突变率较高在以后高产菌株选育的过程中, 可以根据此结果, 挑选具有正突变率较高的菌落形态的菌株, 以大幅度提高雷帕霉素的产量, 并提高筛菌效率, 减少筛菌的盲目性以 ARTP 诱变过程中筛选出的高产菌株 ARTP 039 为出发菌株, 进行紫外诱变的过程中, 以核糖体工程的理论进行抗性筛选, 分别得到了 St + 系列 St + Gen + 系列 St + Gen + Rif + 系列 St + Gen + Rif + Chl + 系列以及 St + Gen + Rif + Chl + Er + 系列的抗性菌株, 并通过发酵复筛, 最终筛选得到了一株雷帕霉素高产菌株 St 8 +Gen 6 + Rif 9 +Chl 3 +Er 4 015, 其雷帕霉素的产量可达到 mg/L, 较出发菌株 BCLP 016 的产量 mg/l, 提高了 %; 较菌株 ARTP 039 的产量 mg/L 提高了 59.67%, 且其遗传稳定性良好综合以上结果可知, 对游动放线菌进行常压室温等离子体诱变以及紫外诱变, 均能大幅度提高其产生雷帕霉素的能力, 且本文中提出的对菌株先进行 ARTP 诱变, 再以筛选出的高产菌进行紫外诱变的复合诱变的筛选思路, 对提高雷帕霉素的产量具有良好的效果, 可为以后高产菌株的选育过程提供一个良好的方法, 以提高筛菌效率参考文献 [1] 杨冬. 雷帕霉素高产菌株的选育. 杭州 : 浙江大学, 材料与化工学院,2006. Yang D. Breeding of rapamycin high production strains. Hangzhou:ZhejiangUniversity,ColegeofMaterialScienceand ChemicalEngineering,2006. [2]BalterM.Proteinmatchmakermayleadnewgenetherapytothe altar.science,1996,273(5272):183. [3] Hidalgo M,Rowinsky E K.The rapamycin sensitive signal transductionpathwayasatargetforcancertherapy.oncogene, 2000,19(56): [4] LiH P,LiG,SunW T,etal.Radio frequency,atmospheric presureglowdischarges:producingmethods,characteristicsand applicationsinbio medicalfields.aipconferenceproceedings, 2008,982(1): [5]LiG,LiHP,WangLY,etal.Geneticefectsofradio frequency, atmospheric presure glow discharges with helium.applied PhysicsLeters,2008,92(22): [6] WangLY,HuangZL,LiG,etal.Novelmutationbreeding methodforstreptomycesavermitilisusinganatmosphericpresure glowdischargeplasma.journalofappliedmicrobiology,2010,108 (3): [7]ShiJJ,KongM G.Expansionoftheplasmastabilityrangein radio frequency atmospheric presure glow discharges.applied PhysicsLeters,2005,87(20): [8] 施巧琴, 吴松刚. 工业微生物育种学. 第 2 版. 北京 : 科学出版社, ShiQ Q,Wu S G.IndustrialMicrobiologyBreeding.2 nd ed. Beijing:SciencePres, [9] 陈红歌, 刘新育, 张世敏, 等. 木聚糖酶高产菌株的诱变. 微生物学通报,2004,31(6): ChenH G,LiuX Y,ZhangSM,etal.Mutationofthestrain producinghigherxylanase.microbiologychina,2004,31(6): [10] 杜海英, 于宏伟, 韩军, 等. 原生质体诱变选育乳糖酶高产菌株. 微生物学通报,2006,33(6): DuH Y,YuH W,HanJ,etal.Breedingofhigh yieldingβ galactosidase strains from protoplast of Aspergilus niger. MicrobiologyChina,2006,33(6): [11]OchiK.From microbialdiferentiationtoribosomeengineering. BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,2007,71(6):1373

6 2015,35(2) 石漫漫等 : 高产雷帕霉素的游动放线菌菌种的选育 [12] 谢庶洁, 肖静, 徐俊. 微生物核糖体工程研究进展. 微生物学报,2009,49(08): XieSJ,XiaoJ,XuJ.Researchprogresofmicrobialribosome engineering.actamicrobiologicasinica,2009,49(8): [13] 陈丽仙. 核糖体工程技术在刺糖多孢菌上的初步应用. 福州 : 福建农林大学, 生物学院,2010. Chen L X.Preliminary application ofribosome engineering technology in Sacharopolyspora spinosa. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, Colege of Biological Sciences,2010. [14]KojimaN,KojimaY,SakakibaraT.Novelrapamycinproducer. European:001534, TheBreedingofHigh yieldingactinoplanesofrapamycin SHIMan man 1 QIAOChang sheng 1,2 ZHUMing 1 LIXue 2 LIUShan shan 1 (1KeyLaboratoryofIndustrialFermentationMicrobiology,MinistryofEducation,ColegeofBiotechnology, TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin ,China) (2TianjinPeiyangBiotransCo.,Ltd,Tianjin ,China) Abstract TheActinoplanesofBCLP 016wasselectedastheoriginalstrain,andamutagenesisof atmosphericandroomtemperatureplasma(artp)wasusedtotreatitsspores,thesporesuspensiontreatedwith threediferenttimewasmixed.afterdilutioncoated,pickingsomesinglecoloniesaccordingtothecolony morphologyofthestrainforscreening,afterfermentationrescreening,ahigh yieldingstrainofrapamycinartp 039wasscreenedout,itsrapamycinproductioncanreach369.39mg/L,comparedwiththeyieldoftheoriginal strainbclp mg/L,increasedby43.81%.Choosingthehigh yieldingstrainartp 039asthe startingstrain,thetraditionaluvmutagenesiswasconducted,threetimethatcorespondingwithfatalityratewas selectedtotreatitssporesuspension,basedonthetheoryoftheribosomeengineering,pickingoutfivekindsof resistantmaterialofstreptomycin,gentamicin,rifampicin,chloramphenicolanderythromycintoconductthe resistancescreening.afterfermentationrescreening,ahigh yieldingstrainofst 8 +Gen 6 +Rif 9 +Chl 3 +Er wasscreenedout,ithasfivekindsofresistance.thestrainfermentationtestshowedthatafter7daysof fermentation,therapamycinoutputcanreach589.79mg/l,comparedwiththeoriginalstrainbclp 016yield increasedby129.61%,anditsgeneticstabilityisgood. Keywords Rapamycin Actinoplanes ARTP UVmutagenesis Ribosomeengineering

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖