肿瘤样品回顾性分析LCM-qPCR-PGM

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1 应用说明 Arcturus XT LCM, ViiA 7, 以及 Ion PGM 系统 肿瘤样品回顾性分析时, 通过激光捕获显微切割 实时 PCR 和二代测序技术进行遗传异质性分析的方法 Kenji Amemiya, 1 Yosuke Hirotsu, 1 Shinsaku Ohtaki, 2 Manabu Watanabe, 2 Junko Kusano, 2 Takashi Ishikura, 2 Yoshiharu Hayashi, 2 and Masao Omata 1 1. 山梨县立中心医院 2. Life Technologies 日本有限公司 这里所展示的是在癌症研究过程中使用激光捕获显微切割技术 (LCM) 从少量保存组织中获取高质量基因组信息的工作流程 1. 使用 LCM 技术从 FFPE 样本采集靶向位点 2. 通过实时 PCR 技术对提取的 DNA 样本进行质量评估 3. 通过二代测序技术进行变异检测 4. 数据分析 我们为您提供一种利用实时 PCR 技术对 DNA 提取样本进行质量分析的简单方法 该方法可在保证对 DNA 提取样本进行快速定量的同时, 确定该 DNA 样本是否适合进行测序 在 Ion PGM TM 系统上, 通过靶向测序方法从所提取的 DNA 样本中获得高质量的序列信息 该技术凭借其快速 灵活的特点, 将很有可能成为癌症基因组相关实验室中不可或缺的必要工具, 帮助实验者从复杂样本中鉴定致病突变 Arcturus XT LCM 系统与 PicoPure DNA 提取试剂盒 ViiA 7 实时 PCR 系统与 TaqMan 检测 Ion PGM 系统与 Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 图 1. 癌症研究中针对 FFPE 组织样本进行二代测序的工作流程 Torrent Suite 软件与 Torrent Variant Caller 插件 简介理解肿瘤样本的遗传组成对于评估其内在生物学特性十分重要 DNA 测序技术是获取肿瘤内基因型完整快照从而鉴定潜在致病突变的理想方法 使用 Ion PGM TM 系统所进行的二代测序 (NGS) 技术在准确性 测序成本和测序速度都得到了长足的进步, 使这类研究变得触手可及 不过想要将该技术流程成功应用到癌症基因组学实验室中, 从样品制备到实施测序的整个过程中还需要考虑若干因素

2 肿瘤的产生和增值由基因组畸变的积累所导致, 组织的群体遗传组成也随之从均质变得复杂多变 多数肿瘤是由带有不同基因组成分的细胞聚集而成的, 因此在观测时往往只能得到这类肿瘤团块中的 平均 基因组信息, 而难以进行更精确的分析 理想情况下, 应对癌肿的细胞亚群或单细胞中所提取出的基因组 DNA 样本进行分析 然而, 这些分析通常会因细胞数目不足而受到限制, 往往只有少量的 DNA 可供进行后续分析 不仅如此, 从经福尔马林固定 石蜡包埋 (FFPE) 的样品中所提取的 DNA 大都存在至少部分降解的问题 因此, 研究人员迫切需要一种能对保存肿瘤样本中得到的低质量 DNA 样本进行分析的 NGS 测序方法 将回顾性结肠良性病例 FFPE 切片 (10μm) 铺盘于聚萘二甲酸 (PEN) 覆膜的载玻片上 ( 请查看订购信息 ), 并使用苏木精和曙红 (H&E) 进行染色 将 H&E 染色的玻片载入 ArcturusXT TM LCM 系统, 对肿瘤及非肿瘤区域进行鉴定 使用 IR 和 UV 显微解剖激光, 从 FFPE 样本中分别切取肿瘤及非肿瘤组织样本, 并收集于独立的 CapSure Macro LCM Caps 中 对 CapSure LCM Caps 保存的显微分离组织样本进行后续的 DNA 提取 最终得出肿瘤样本中显微分离区域的平均大小为 2.5mm 2, 非肿瘤样本为 2.2mm 2 在本应用笔记中, 我们将提供一整套能够从少量细胞中得到高质量基因组信息的 ( 从样本到测序 ) 工作流程 ( 图 1) 简要说来, 该流程首先使用 ArcturusXT TM LCM 系统对 FFPE 组织切片中的肿瘤和非肿瘤细胞进行采集 随后使用 PicoPure DNA 提取试剂盒对这些细胞中的基因组 DNA 进行分离, 再使用 ViiA TM 7 实时 PCR 系统及定制 TaqMan 检测对提取得到的基因组 DNA 的质量进行分析 然后通过 Ion AmpliSeq TM Cancer Hotspot Panel v2 对特定位点进行扩增, 最后通过 Ion PGM TM 系统进行测序 本次研究由山梨县立医院组织社长 Masao Omata 教授 ( 东京大学医学院名誉教授 ) 予以指导, 专为解释肿瘤细胞中基因组的改变 促进相关研究而设计 A B C 肿瘤组织 肿瘤组织 非肿瘤组织 D 非肿瘤组织 组织样品的激光捕获显微切割本研究使用 ArcturusXT TM LCM 系统从组织样本中进行细胞分离 该系统在同一显微解剖平台上同时整合了红外 (IR) 俘获激光和紫外 (UV) 切割激光 红外激光能够在温和条件下进行细胞捕获, 不仅能保留生物分子的完整性, 对于单细胞或少量细胞的显微分离效果也十分理想 使用紫外激光进行的显微解剖能够达到前所未有的速度和准确性, 适用于分离困难及致密的组织结构 使用该双重激光系统, 用户可对单一 ( 组织 ) 样本中的单个细胞 细胞群集及大区域组织进行简单 安全的显微分离 图 2. 良性结肠组织样本的激光捕获显微切割 此处所展示的为显微解剖前 (A) 和解剖后 (B) 的组织切片 从图中可看出, 样本中的肿瘤区域及非肿瘤区域都得到了分离 肿瘤组织 (C) 与非肿瘤组织 (D) 的显微分离区域则在其各自的 CapSure LCM cap 样品架中进行展示

3 DNA 提取使用 PicoPure DNA 提取试剂盒, 对 LCM caps 中的显微分离组织进行基因组 DNA (gdna) 的提取 该试剂盒提供了一个简捷快速的提取方法, 无需使用有机萃取法或离心柱 将提取溶液 (50μL, 由试剂盒中所提供的蛋白酶 K 及复溶液配制而成 ) 注入容积为 0.5mL 的微量离心管中 将持有俘获细胞的 LCM cap 与离心管进行匹配, 之后倒转离心管使溶解液与 LCM 细胞进行接触 样品在 65 C 孵育 16 小时后, 将溶解产物离心至微量离心管当中以分离基因组 DNA 从离心管上去除 LCM cap, 随后将溶解产物加热到 95 C 以灭活蛋白酶 K 表 1. 用于对肿瘤 非肿瘤和人类 RNase P 对照 DNA 样品进行质量评估的扩增参数 参数 设备 反应模式 主混合物 引物和探针的终浓度 反应体积 工作流程中所使用 ViiA TM 7 实时 PCR 系统 标准模式 重复 n = 3 标准曲线 TaqMan 基因表达主混合物 引物 900nM, 探针 250nM 每孔 20μL (DNA 样品每孔添加 1μL) 人类对照基因组 DNA (10ng /μl, 包括 TaqMan RNase P 检测试剂盒 ) 顺序稀释 4 次, 绘制 5 点校定曲线 对基因组 DNA 进行质量分析在某些情况下, 提取出的基因组 DNA 可能存在降解, 特别是在处理 FFPE 组织样本时 有许多方法可以对此降解 ( 的程度 ) 进行评估, 但大都因 DNA 样本量过低而导致其难以或无法实行 实时 PCR 凭借其高灵敏度和高特异性, 很适合进行此类检 测 我们专门针对这项研究开发了一种使用 ViiA 实 时 PCR 系统和 TaqMan 基因表达检测的方法, 以对 DNA 降解水平进行评估 TaqMan RNase P 检测试剂盒 ( 商品目录编号 ) 被用于生成 RNase P 基因上的一个短扩增子 (87bp) 此外我们还自行设计了一项 TaqMan 检测方案, 用于生成一条较长的扩增子 (256bp) 较长的扩增子在 PCR 反应中通常更难被扩增, 因此在测试时可被用于替代如 FFPE 组织样本这类扩增起来比较困难的样本 在进行 PCR 反应时长扩增子拥有比短扩增子更低的富集 速率, 这种情况在困难应用中更为明显 其原因在于存在降解的 DNA 样品中能够用于扩增的未片段化模板也相对较少, 因此在对降解的 DNA 样本进行检测的过程中, 较长扩增子预期会获得更高的 Ct 值 通过长短的扩增子之间的量化比较, 研究者可以评估 DNA 降解的程度并决定是否值得进行后续的 NGS 测序 表 1 概括了本项检测中将会用到的扩增参数 图 3 是测试样品的扩增曲线结果 人类对照 DNA 拥有质量较高且无损的结果, 因此长短扩增子均获得了相似的扩增谱 不过, 在进行观察时, 发现 FFPE 切片样本中肿瘤区及非肿瘤区中的长扩增子 Ct 值向更高方向的发生了移动, 这说明 DNA 发生了降解 这些数据说明尽管 FFPE 样本中得到的 DNA 在某种程度上发生了降解, 它们仍是可扩增且可判别的, 从而适于进入下一步的测序操作 A 对照 DNA B 肿瘤区域 C 非肿瘤区域 扩增图扩增图 扩增图 周期 周期 周期 图例长短 ( 扩增子 ) ( 扩增子 ) 图例长短 ( 扩增子 ) ( 扩增子 ) 图例长短 ( 扩增子 ) ( 扩增子 ) 图 3. 通过 qpcr 对提取出的核酸进行质量评估 (A) 人类对照 DNA ( 包含于 TaqMan RNase P 检测试剂盒 ) 基于该对照 DNA 的高质量无损结果, 也观察到长短扩增子预期的相似扩增曲线 图中分别显示了源自组织样本肿瘤区域 (B) 与非肿瘤区域 (C) 的 DNA 样本的扩增曲线 每个样品中长扩增子的 PCR 产物的延迟积累, 反映了扩增反应中完整有效的模板的存在量较低

4 表 2. 通过实时 PCR 对样本肿瘤区域与非肿瘤区域进行 DNA 定量 短扩增子 (87bp) 长扩增子 (256bp) 样品数量 (ng/μl) SD 数量 (ng/μl) SD 肿瘤区域 非肿瘤区域 RQ 基于对照 DNA 样品的扩增生成一条标准曲线, 从肿瘤和非肿瘤样本抽出 DNA 的浓度依据该标准曲线进行定量 ( 表 2) 与预期一致, 当使用长扩增子进行分析时, 无论是对于肿瘤区域还是非肿瘤区域, 检出的 DNA 量都较低 这些数值可以用于计算相对定量 (relative quantification,rq), 后者可以用于指示基因组 DNA 的降解水平 ( 图 4) 相对于人类对照 DNA 组而言, 使用长扩增子得到的肿瘤区域的 RQ 值为 0.064, 而非肿瘤区域非 相对较低的 RQ 值表明可用于下游检测的未受损 DNA 的含量较少, 该值是进行后续 NGS 测序的一个重要参考指标 Human control DNA Tumor region Non-tumor region 人类对照 DNA 肿瘤区域非肿瘤区域 图 4. 样品的相对定量 (RQ) 计算长扩增子与短扩增子的 DNA 比值 ( 例如, 样品中肿瘤区域的比值计算为 0.151/1.309=0.115) 该比值进一步使用对照基因组 DNA 样本的长 / 短比值 (1.79, 结果未展示 ) 进行数据标准化 ( 最后 ) 对样品肿瘤区域 (0.115/1.79=0.064) 与非肿瘤区域的结果进行绘图 NGS 测序前的靶标选择与文库制备在本研究中, 测序分析之前使用 Ion AmpliSeq TM Cancer Hotspot Panel v2, 将对应于癌症基因已知变异的特定靶点通过一个多重反应中进行扩增 该面板由 207 对引物组成, 对 50 个致癌基因和抑癌基因, 如 KRAS BRAF EGFR 和 TP 53 进行查询, 涵盖了约 2800 个突变 热点 由于此面板生成的扩增子平均长度仅为 154bp, 因此能够成功应用于降解的基因组 DNA ( 的检测 ), 如 FFPE 样本中获得的基因组样本 此外,Ion AmpliSeq TM Cancer Hotspot Panel v2 能够以少至 10ng 的基因组 DNA, 对所有的靶标位点进行分析 ; 整个工作流程从 DNA 制备到注释突变, 仅用一天即可完成 二代测序技术在对靶向位点进行多重扩增之后, 使用 Ion PGM TM 系统进行 DNA 测序 不同于其他的二代测序平台,Ion PGM TM 系统使用了半导体技术来检测 DNA 合成过程中自然释放的氢离子, 而无需使用化学荧光染料及光学系统 使用 AB Library Builder TM 与 Ion OneTouch TM 系统自动化完成文库和模板制备步骤, 进一步简化了二代测序的工作流程 测序分析数据详见图 5 尽管 ( 所使用的 ) 原始样品起始量低于最优条件, 肿瘤与非肿瘤样本还是均获得了令人满意的测序数据,99% 甚至更多的靶标区域覆盖度为 100x, 并具有高度的序列准确性 由于本项研究中可用样本的 ( 数量 ) 限制, 对于肿瘤和非肿瘤样本均仅使用了 5ng 基因组 DNA 样本,( 最终 ) 获得了满意的效果 为了补偿基因组样本量的不足,( 我们向 ) Ion AmpliSeq TM 面板规程当中添加了 4 个 ( 反应 ) 循环 请访问 lifetechnologies.com/ampliseq 网址, 查看 Ion AmpliSeq TM Cancer Hotspot Panel v2 所分析靶向位点的完整列表

5 使用 Torrent Suite TM 和 Ion Reporter TM 软件对数据进行分析 通过 Torrent Suite TM 软件可以审查测序反应的质量和准确度, 还可变异检出 (variant calling) 等进一步的分析 Torrent Suite TM 软件包含 Torrent Variant Caller 插件, 专为从 Ion Torrent TM 测序结果中检测单核 苷酸多态性 (SNP) 和插入缺失突变 (indel) 而设计 图 6 展示了使用 Torrent Variant Caller 进行数据分析的一个案例 检出的变异可使用 TaqMan 分析进行验证 ( 尽管本实验中并未执行此步骤 )( 参考相关内容 TaqMan 突变检测分析 ) A 20x 覆盖度 100x 覆盖度打靶的读值深度读值数量 ( 千 ) 肿瘤区域 100% 99.17% 94.41% 1, 非肿瘤区域 100% 99.61% 88.69% 3,939 1,048 B 全部碱基的质量评分 (Sanger /illumina 1.9 编码 ) 全部碱基的质量评分 (Sanger /illumina 1.9 编码 ) 每个测得碱基的平均准确度 (Phred 标度 ) 每个测得碱基的平均准确度 (Phred 标度 ) 读取位置 (bp) 肿瘤区域 读取位置 (bp) 非肿瘤区域 图 5. 使用 Ion PGM TM 系统获得的测序结果 (A) 从样品的肿瘤区域与非肿瘤区域获得的结果汇总 (B) 各自读取的 Phred 评分 相关数据按照碱基位置与单个读取水平之间的函数关系进行绘图 检出碱基的质量以 Phred 标度进行显示, 评分 20 代表了 99% 的序列准确性, 评分 30 表示 99.9% 的准确性 图 6. 使用 Torrent Variant Caller 软件进行数据分析的一个实例 Torrent Suite 软件允许您在每个反应结束时, 通过使用不同的插件自定义分析 本流程使用了 Torrent Variant Caller 插件, 在 Ion Torrent 测序数据中检测 SNP 和 Indel 该软件对比参照或参照中的一个靶向子集进行 SNP 和 indel 变异的检出 插件可以在每项检测中设置为自动运行, 也可以在已完成的检测中手动运行

6 TaqMan 突变检测分析通过二代测序检出的候选突变可以通过实时 PCR 进行验证 TaqMan 突变检测分析可以在癌症相关基因中检测体细胞突变 这些检测使用了 castpcr TM ( 竞争性等位基因特异的 TaqMan 聚合酶链式反应 ) 技术 此项分析具备高度特异性和敏感度, 能够在野生型 DNA 背景当中检测出低至 0.1% 的等位基因突变 我们当前的分析中支持了涵盖 778 个突变的 46 个基因, 未来将支持更多 图 7 图解了 TaqMan 突变检测分析技术的原理 A 突变等位基因分析 B 等位基因特异性引物 突变的等位基因 阻滞物 野生型等位基因 TaqMan ABL1 CSF1R FGFR3 KDR NRAS SMARCB1 AKT1 CTNNB1 FLT3 KIT PDGFRA SMO ALK EGFR GNAS KRAS PIK3CA SRC APC ERBB2 HNF1A MET PTEN STK11 ATM ERBB4 HRAS MLH1 PTPN11 TP53 BRAF FBXW7 IDH1 MPL RB1 VHL CDH1 FGFR1 JAK2 NOTCH1 RET CDKN2A FGFR2 JAK3 NPM1 SMAD4 探针 TaqMan 探针 引物 引物 等位基因 - 特异性引物驱动了突变等位基因的扩增 M G B 寡聚核苷酸阻滞物抑制了野生型等位基因的扩增 图 7. TaqMan 突变检测分析的原理 (A) TaqMan 突变检测分析包含突变等位基因检测, 能够特异性地检测一个或多个突变等位基因 一条等位基因特异性的引物能够对突变等位基因进行扩增, 而一条寡聚核苷酸阻滞物同时对野生型等位基因的扩增进行抑制 (B) 当前 TaqMan 突变检测分析系统所支持的基因 讨论在本应用笔记中, 我们描述了一项从样品直到最终序列的一整套 DNA 分析解决方案, 该 DNA 采集自可追溯的肿瘤病例 FFPE 样本 由于通过 LCM 技术分离得到的肿瘤与非肿瘤细胞可以在所有工作流程的步骤中同步进行平行分析, 使得测序结果能够更精确地反映基因组中真实发生的改变, 研究者们也可进一步增强对结果的信心 FFPE 样本中分离得到的基因组 DNA 通常发生会发生降解而 ( 导致 ) 存在量降低 我们因此在 NGS 分析之前执行了一项质控步骤以对 (DNA 的 ) 降解程度进行评估 此外, 通过比较实时 PCR 测得的样品 DNA 量与对照 DNA 量的相对值 - RQ 值, 使研究人员能够在 NGS 检测之前对 DNA 样品进行定量 尽管使用 Ion AmpliSeq TM Cancer Hotspot Panel v2 进行 NGS 检测的推荐 DNA 上样量为 10ng, 本项研究结果仍显示无论对于肿瘤还是非肿瘤样本, 每个反应仅需 5ng 上样 DNA 即可获得满意的结果 在 NGS 测序之前评估样本 DNA 降解水平及 DNA 产量的做法值得推荐, 因为其有助于节省时间和资源 Ion PGM TM 系统适合于各式各样的应用, 例如靶向测序 外显子组测序和基因组重测 此处使用了靶向测序方法针对人类基因组中癌症基因高频突变区域进行了多重 PCR 检测 即使是使用 FFPE 组织样本, 肿瘤与非肿瘤细胞中仍均获得了高质量的序列读值 从靶向 DNA 扩增直至测序的整个工作流程, 可以在一天之内完成 基于该流程的速度及所获结果的质量, 当下我们正在进一步深化研究, 希望能够对阐明癌细胞中发生的遗传改变有所助益

7 Professor Emeritus, University of Tokyo Masao Omata 教授 山梨县 ( 中心 / 北区 ) 医院院长东京大学荣誉教授 参考文献 1. Arzumanyan A, Reis HM, Feitelson MA (2013) Pathogenic mechanisms in HBV- and HCV-associated hepatocellular carcinoma. Nat Rev Cancer 13: Bhandari A, Crowe SE (2012) Helicobacter pylori in gastric malignancies. Curr Gastroenterol Rep 14: Masao Omata 教授从事于胃肠和肝脏疾病的医学研究达 43 年 从 1981 年开始, 他的研究主要集中于乙型肝炎病毒 (HBV) 的分子生物学研究 他针对乙型和丙型肝炎相关的肝癌与幽门螺旋杆菌相关的胃癌的发生学进行了基础和临床研究 研究表明这些癌瘤的形成过程在缺乏这些病原体的情况下无法起始 [1,2] 对胃癌和肝癌细胞的综合研究显示, 在开始暴露于病原物的 30 至 40 年后, 这些细胞中可以观察到许多遗传改变 看起来这些病理学症状的原因似乎是单一基因或信号通路 尽管去除这些病原物可能会显著减少胃癌和肠癌的发生, 然而彻底理解其病理学并发展对应的治疗措施仍存在难度 针对肺癌与结肠癌的大规模基因组学研究能够在深层次让临床研究者们鉴定得到这些癌症相关的未知致病突变 如今肺癌与结肠癌的靶向治疗正基于这些研究进行着 Omata 博士及其他的癌症研究者们仍很乐观,( 他们相信 ) 深度测序也同样会在胃癌和肝癌的研究中获得类似的突破

8 Ordering information Product Cat. No. Laser capture microdissection PEN Membrane Glass Slides LCM0522 CapSure Macro LCM Caps LCM0211 Arcturus PicoPure DNA Extraction Kit KIT0103 Arcturus XT Laser Capture Microdissection Instrument Go to: lifetechnologies.com/arcturus Real-time PCR TaqMan RNase P Detection Reagents TaqMan Gene Expression Master Mix ViiA 7 Real-Time PCR system Go to: lifetechnologies.com/viia7 Next-generation sequencing Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v Ion AmpliSeq Library Kit LV Ion PGM Template OT2 200 Kit Ion PGM Sequencing 200 Kit v Ion 316 Chip Kit v Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Ion PGM System

ALK 全 名 :Anaplastic lymphoma kinase, 位 于 2 号 染 色 体 上 功 能 :ALK 在 神 经 发 育 过 程 中 起 重 要 作 用, 是 正 调 控 元 件 与 肿 瘤 的 关 系 :EML4-ALK 融 合 基 因 占 非 小 细 胞 肺 癌 中 的 3

ALK 全 名 :Anaplastic lymphoma kinase, 位 于 2 号 染 色 体 上 功 能 :ALK 在 神 经 发 育 过 程 中 起 重 要 作 用, 是 正 调 控 元 件 与 肿 瘤 的 关 系 :EML4-ALK 融 合 基 因 占 非 小 细 胞 肺 癌 中 的 3 基 因 列 表 : 选 自 Life 公 司 出 品 的 Cancer Panel 中 的 50 个 基 因 资 料 来 源 : 陈 巍 学 基 因 的 博 客 ABL1 全 名 :Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ABL1 基 因 位 于 第 9 号 染 色 体 上 临 床 作 用 : 当 BRA 基 因 与 ABL1 基 因 型 成

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