在MiniSeq系统上检测诱发癌症的生殖系变异

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运纱怀
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在 MiniSeq 系统上检测诱发癌症的生殖系变异利用 Illumina 最触手可及的测序平台, 鉴定与癌症易感性相关的基因组变异要点从样本到数据的生殖系检测方案简单的流程, 极少的手动操作时间通过专家选择和定制集合实现全面的变异检测检测各种癌症的易感基因变异和热点轻松的数据分析在本地或云端开展的全自动直观的数据分析端对端的 Illumina 支持简介 Illumina

1 在 MiniSeq 系统上检测诱发癌症的生殖系变异利用 Illumina 最触手可及的测序平台, 鉴定与癌症易感性相关的基因组变异要点从样本到数据的生殖系检测方案简单的流程, 极少的手动操作时间通过专家选择和定制集合实现全面的变异检测检测各种癌症的易感基因变异和热点轻松的数据分析在本地或云端开展的全自动直观的数据分析端对端的 Illumina 支持简介 Illumina 的全球专家可提供安装培训和支持新一代测序 (NGS) 技术在近期已带来癌症研究的突破, 包括将基因组变异与癌症易感性相关联 1-4 高通量 NGS 有能力同时测序多个基因和样本, 与传统的毛细管电泳 (CE)/ 桑格测序方法以及基于 PCR 的基因分型相比有着独特的优势桑格测序是目前的金标准方法, 有着快速而简单的流程然而, 它的扩展性低, 因为其样本起始量要求高发现能力低, 且分析灵敏度低 5,6 基于 PCR 的基因分型有着快速而简单的流程以及高的分析灵敏度然而, 它只能检测一组有限的突变, 几乎没有发现能力, 在处理多个样本时不能扩展或起始量要求高 7 NGS 则带来了更高的分析灵敏度 ( 检测极限低至 1% 的等位基因频率 ), 更高的发现能力, 可同时分析数百个基因, 以及更高的分辨率 8,9 全世界的实验室都在利用 NGS 来研究多个诱发癌症的改变, 与桑格 /CE 测序以及基于 PCR 的基因分型相比成本更低周转更快, 且组织需求量更低图 1: 靶向测序实现了变异检测 - 靶向测序让研究人员能够检测与各种癌症相关联的易感变异利用靶向测序方法, 癌症研究人员可关注一组感兴趣的基因基因区域或热点, 它们有着已知或疑似的癌症易感倾向 ( 图 1) 靶点癌症测序的商业化试剂盒集合了专家精选的内容, 大大缩小了测序的范围, 降低了成本和数据分析的负担由于它只评估有限的一组基因, 故靶向癌症测序可以更深地覆盖这些感兴趣的区域 MiniSeq 系统为靶向癌症测序带来了一个清晰完整且经济高效的方案它利用业界领先的 Illumina NGS 技术, 此技术被全世界 90% 以上的新一代测序文献所使用, 总共发表了 26,000 多篇同行评审的文献 * MiniSeq 系统由 Illumina 文库制备方案和从样本到数据的简化流程所支持 ( 图 2) 这些是由 Illumina 的科学家按照行业指南和专家建议, 针对 MiniSeq 系统开发和优化的 BaseSpace 让实验室能够安全地分析存档和共享测序数据, 并以直观的用户界面呈现专家 * 根据 Illumina 公司 2015 年存档数据计算设计内容制备文库测序分析数据 & 注释变异生殖系筛查 < 1 天 8-24 小时 24 小时 < 2 小时仅供定制 panel TruSight Cancer Prep Kits TruSeq Custom Amplicon Prep Kits MiniSeq 系统 Local Run Manager BaseSpace Apps VariantStudio 图 2:MiniSeq 系统的生殖系筛查流程 - 整合的流程带来了简化的文库制备测序以及数据分析, 实现了广泛样本的经济高效研究

2 精选的工具, 使信息学分析得以简化 Illumina 的服务和支持团队遍布全世界, 他们覆盖从文库制备到数据分析的整个流程, 每周五天每天 24 小时提供培训协助, 并回答问题目标富集原理 MiniSeq 系统是 Illumina 最经济实惠的测序系统, 即使只运行少量样本, 也是经济高效的它让各种规模的实验室都能接触到 Illumina NGS 的高质量和可靠性有了 MiniSeq 系统, 转向靶向癌症测序将比以往更轻松简化的流程 MiniSeq 系统的流程简化了生殖系变异的检测, 让研究人员能够最大限度地提高效率 ( 图 2) 研究人员可使用 TruSight Cancer Sequencing Panel 这种商业化集合, 分析与癌症易感性相关的 94 个基因和 284 个单核苷酸变异 (SNP) 同时, 也可使用 TruSeq Custom Amplicon Low Input Library Prep Kit 生成的 1536 个扩增子, 通过用户定义的集合开展定制的生殖系分析文库制备 P7 Index 1 将双链的 DNA 文库变性让生物素化的探针与目标区域杂交通过与链霉亲和素结合的磁珠富集 Custom Probe 1 扩增子生成原理 Custom Probe 2 Index 2 P5 Illumina 的文库制备方法包括基于捕获的目标富集和扩增子生成 ( 图 3) 在目标富集中, 感兴趣的特定区域通过与生物素标记的探针杂交而被捕获, 之后通过磁性 pulldown 而被分离这种高度多重的方法实现了发现验证或分析遗传变异的广泛应用, 包括 TruSight Cancer panel TruSeq Custom Amplicon Low Input 所采用的扩增子生成方法利用了一种杂交 - 延伸 - 连接的方法它从双链 DNA 中产生了单链模板, 随后可通过 PCR 扩增 TruSight Cancer Library Prep TruSight Cancer Sequencing Panel 与 TruSight Rapid Capture 试剂盒兼容, 带来了一个整合的文库制备和富集流程这种快速的制备仅需要 50 ng 起始 DNA 和 1.5 天, 同时避免了机械剪切 TruSight Rapid Capture Sample Prep Guide 是适合 DNA 测序文库的制备简单易懂的操作方案它带领用户了解文库制备的每一步, 列出了必需的试剂, 并说明了安全的暂停点探针与未片段化的 gdna 两侧的区域杂交目标区域两侧的探针延伸并连接通过 PCR 添加测序引物和索引图 3: 文库制备方法 - Illumina 的测序文库制备方法包括目标富集和扩增子生成 Illumina 的专人服务为探针设计定制集合的功能评估以及提高目标覆盖度提供支持 TruSeq Custom Amplicon Low Input assay 特有对自动化友好的简化文库制备可在 6.5 小时内完成, 而手动操作时间仅需 3 小时 TruSeq Custom Amplicon Low Input Library Prep Reference Guide 含有初次使用者所需的一切, 包括操作概览提示与技巧详细的操作步骤试剂盒组分, 以及需要用户提供的耗材列表 TruSeq Custom Amplicon Low Input Library Prep TruSeq Custom Amplicon Low Input assay 让研究人员能够利用 Illumina 的 DesignStudio 软件创建一个针对感兴趣基因和区域的定制扩增子集合, 这个简单易用的免费在线工具带来了优化的覆盖度 ( 图 4) DesignStudio 产生的 TruSeq Custom Amplicon Low Input 设计可实现所有基因集合上高于 94% 的平均覆盖度了解 Illumina 专人服务的更多信息, 请联系 Illumina 的代表

的模块化设计允许用户根据需要安装和更新每个分析模块, 在各个测序应用中生成简单的报告此外,MiniSeq 系统上生成的测序数据可立即转移到 BaseSpace 计算环境 ( 云端或本地 ), 进行存储和分析 BaseSpace 应用程序 (App) 采用为信息学新手设计的点击即运行的直观界面, 提供了专家首选的数据分析工具 ( 图 6) 这些应用程序支持各种常见的测序数据分析需求, 如比对

以结构化的形式对疾病相关变异进行汇总和注释 MiniSeq 系统上的测序在文库制备中无论是使用目标富集还是扩增子生成方法, 在文库制备好之后, 它们都能在 MiniSeq 系统上轻松测序 ( 图 5) 它将克隆扩增和测序整合成仪器上的一个完全自动化的过程无需再购买和操作昂贵的特殊仪器 MiniSeq 系统特有上样即运行的操作和直观的用户界面, 在测序运行的每一阶段提供逐步的指导上样和设置

3 的模块化设计允许用户根据需要安装和更新每个分析模块, 在各个测序应用中生成简单的报告此外,MiniSeq 系统上生成的测序数据可立即转移到 BaseSpace 计算环境 ( 云端或本地 ), 进行存储和分析 BaseSpace 应用程序 (App) 采用为信息学新手设计的点击即运行的直观界面, 提供了专家首选的数据分析工具 ( 图 6) 这些应用程序支持各种常见的测序数据分析需求, 如比对变异检出等 BaseSpace 生态环境是目前最大的集合之一, 提供了商业化和开源的分析工具图 4: 定制探针设计 - 研究人员可利用 DesignStudio 来查看靶向的基因组区域和试图采用的扩增子, 以评估设计覆盖度和得分 VariantStudio 能够从测序数据中快速筛选出与疾病相关的变异, 并对其进行鉴定和注释 ( 图 7) 这个简单易用的应用程序能灵活地生成报告, 以结构化的形式对疾病相关变异进行汇总和注释 MiniSeq 系统上的测序在文库制备中无论是使用目标富集还是扩增子生成方法, 在文库制备好之后, 它们都能在 MiniSeq 系统上轻松测序 ( 图 5) 它将克隆扩增和测序整合成仪器上的一个完全自动化的过程无需再购买和操作昂贵的特殊仪器 MiniSeq 系统特有上样即运行的操作和直观的用户界面, 在测序运行的每一阶段提供逐步的指导上样和设置 MiniSeq 系统所需的时间不到五分钟测序运行可在 24 小时内完成 MiniSeq 试剂盒有中通量和高通量两种形式, 允许根据 read 长度样本量和通量要求来优化研究设计图 6:BaseSpace 的界面 - BaseSpace 特有点击即运行的直观用户界面, 让所有研究人员都能开展自己的信息学分析图 5:MiniSeq 系统 - MiniSeq 系统利用了 SBS 技术的最新进展和轻松的整合流程简化的数据分析和生物信息学利用 MiniSeq 系统开展数据分析时无需任何信息学专业知识或编程经验它特有机载的 Local Run Manager 软件, 可创建运行程序监控状态, 以及在运行后自动分析测序数据 Local Run Manager

图 7:VariantStudio - VariantStudio 软件特有直观的用户界面, 无需信息学知识, 也能实现轻松的数据分析和探索它将各种来源的信息整合到单个数据库, 便于对基因组数据进行全面地注释灵活的报告可对结果进行汇总和注释演示流程 TruSight Cancer 这是包含 SNP 插入缺失及其他结构变异的文本文件之后生成汇总表格, 报告富集变异检出覆盖度

4 图 7:VariantStudio - VariantStudio 软件特有直观的用户界面, 无需信息学知识, 也能实现轻松的数据分析和探索它将各种来源的信息整合到单个数据库, 便于对基因组数据进行全面地注释灵活的报告可对结果进行汇总和注释演示流程 TruSight Cancer 这是包含 SNP 插入缺失及其他结构变异的文本文件之后生成汇总表格, 报告富集变异检出覆盖度插入片段长度以及重复文库制备利用 TruSight Cancer Oligo Box 和 TruSight Rapid Capture Library Prep Kit 制备文库 DNA 样本提取自血液, 每个样本取 50 ng DNA 用于检测 TruSight Cancer 文库是按照 TruSight Rapid Capture Sample Prep Guide 的操作制备的在 MiniSeq 系统上进行测序前, 文库经过定量和均一化 MiniSeq 系统上的测序样本文库被上样到试剂槽中, 试剂槽和流动槽被放置于 MiniSeq 仪器中克隆扩增及 bp 读长的双端测序自动开展, 无需任何用户干预, 需要 16 小时图 8:BaseSpace 中的 TruSight Cancer 数据分析 - BaseSpace 中的 BWA Enrichment App 生成的汇总表格图中显示了运行指标 ( 比对序列比对碱基和富集 ) 数据分析比对和变异检出序列数据是利用 BaseSpace 中的 BWA Enrichment App 分析的 ( 图 8) 在多重分离和 FASTQ 文件生成之后, 软件利用 Burrows- Wheeler Aligner(BWA) 将序列与 hg19 人类参考基因组进行比对, 以创建 BAM 文件随后利用 Genome Analysis Toolkit(GATK) 对清单文件中指定的目标区域开展变异分析 GATK 输出的是 VCF 文件, 结果与讨论 TruSight Cancer Sequencing Panel 中 99% 的碱基以 20 倍覆盖度覆盖, 为变异检出带来高可信度 ( 表 1) 它还获得了 99% 的比对序列和 77% 的填补序列富集, 便于特异且准确的测序 ( 表 1) Single Nucleotide Polymorphism 数据库 (dbsnp) 是大量的简单遗传多态性在公共领域的存档 10 随着大多数的 SNV( 单核苷酸变异 ) 和 indel( 插入或缺失 ) 在 dbsnp 数据库中发现,TruSight Cancer 测序数据产生了高度相关的研究数据, 并提高了鉴定新易感遗传变异的发现能力 ( 图 9)

5 表 1:TruSight Cancer Sequencing Panel 覆盖度汇总样本平均覆盖深度覆盖均一性 (% > 平均 0.2 ) 目标区域覆盖度 (1 ) 目标区域覆盖度 (10 ) 目标区域覆盖度 (1 ) (20 ) 目标区域覆盖度 (50 ) % 99.9% 99.4% 99.1% 98.6% % 100.0% 99.6% 99.5% 99.1% % 99.7% 99.2% 99.0% 98.5% % 100.0% 99.8% 99.7% 99.4% % 100.0% 99.9% 99.6% 99.4% % 99.8% 99.3% 99.0% 98.4% MiniSeq 系统上一次具有代表性的运行的汇总 (BWA 富集 ), 它利用 TruSight Cancer Sequencing Kit 运行 6 个样本图 9:TruSight Cancer 变异汇总 - TruSight Cancer Sequencing Panel 实现了准确且特异的测序, 可提供高可信度的变异检出, 并提高了发现能力

6 结语订购信息 MiniSeq 系统带来了一个清晰完整且经济高效的工具集, 便于对与癌症易感性相关的基因组变异进行生殖系筛查研究人员既可选择成熟的 Illumina 分析方法, 它们具有专家精选的内容, 按照行业指南开发也可与 Illumina 的科学家合作, 开发自己的定制集合有了 MiniSeq 系统, 任何规模的实验室都能研究多个诱发癌症的改变, 与 CE/ 桑格测序或基于 PCR 的基因分型方法相比成本更低周转更快, 且组织需求量更低了解更多了解靶向癌症测序的更多信息, 请访问 : applications/cancer/research/cancer-dna-sequencing/ targeted-cancer-seq.html 产品 MiniSeq 系统 MiniSeq High Output Kit (75 Cycles) MiniSeq High Output Kit (150 Cycles) MiniSeq High Output Kit (300 Cycles) MiniSeq Mid Output Kit (300 Cycles) TruSight Cancer TruSight Cancer Sequencing Panel Includes oligos sufficient for 4 enrichments and up to 48 samples TruSight Cancer MiniSeq Bundle Includes oligos, library prep panel, and 2 MiniSeq High Output Kits (300 Cycles), sufficient for 48 samples TruSight Rapid Capture (1 index, 8 samples) TruSight Rapid Capture (2 indexes, 8 samples) TruSight Rapid Capture (4 indexes, 16 samples) TruSight Rapid Capture (24 indexes, 48 samples) TruSight Rapid Capture (24 indexes, 96 samples) TruSight Rapid Capture (96 indexes, 288 samples) TruSeq Custom Amplicon Low Input TruSeq Custom Amplicon Low Input Kit (96 samples) TruSeq Custom Amplicon Low Input Kit (16 samples) TruSeq Custom Amplicon Index Kit 货号 SY FC FC FC FC 货号 FC FC FC FC FC FC FC 货号 FC FC FC

7 参考文献 1. Rahman N. Integrating germline cancer predisposition gene testing into routine clinical practice - The Mainstreaming Cancer Genetics programme [AACR abstract 4705].Cancer Res.2014;74(19suppl): Münz M, Ruark E, Renwick A, et al.csn and CAVA: variant annotation tools for rapid, robust next-generation sequencing analysis in the clinical setting. Genome Med.2015;7(76): Wimberger P, Benet-Pages A, Schubert S, et al.identification of ERCC2 as novel susceptibility gene for hereditary breast and ovarian cancer [ASCO abstract 1512].J Clin Oncol.2015;33(suppl): Sykorova V, Dvorakova S, Vcelak J, et al.search for new genetic biomarkers in poorly differentiated and anaplastic thyroid carcinomas using next generation sequencing.anticancer Res.2015;35(4): Shendrue J, and Hanlee J. Next-generation DNA sequencing.nat Biotech.2008;26: Schuster SC.Next-generation sequencing transforms today s biology.nat Methods.2008;5(1): Tuononen K, Maki-Nevala S, Sarhadi VK, et al.comparison of targeted nextgeneration sequencing (NGS) and real-time PCR in the detection of EGFR, KRAS, and BRAF mutations on formalin-fixed, paraffin-embedded tumor material of non-small cell lung carcinoma-superiority of NGS.Genes, Chromosomes and Cancer.2013;52(5): Liu L, Li Y, Li S, et al.comparison of next-generation sequencing systems.j Biomed Biotechnol.2012;2012: Ross MG, Russ C, Costello M, et al.characterizing and measuring bias in sequence data.genome Biol.2013;14:R Sherry ST, Ward MH, Kholodov M, et al. dbsnp: the NCBI database of genetic variation.nucleic Acids Res.2001;29(1): 通过 Illumina 的服务培训和咨询, 最大限度地提高性能和生产力无论是在仪器运行过程中需要即时的帮助, 还是需要对复杂流程进行深度咨询,Illumina 都能帮助您 Illumina 的服务和支持团队提供了一整套便捷且可以定制的方案, 从初期培训, 到仪器支持, 再到 NGS 的持续教育 Illumina 的专业售后服务包 Illumina 提供了专业售后服务包点数可用于兑换优惠的 Illumina 专业服务服务包的好处在于 : 一次性投资在售后无需额外支出减轻风险点数可兑换未来无法预期的服务节省成本与目录定价相比经济高效专业的服务产品售后服务分级的仪器服务计划 + 附加服务仪器合规服务仪器按需服务 Illumina 大学培训在您指定的机构开展专家指导的培训在 Illumina 培训中心开展专家指导的培训在线课程在线研讨会 Illumina 咨询仪器和文库制备检测的概念验证服务设计协助和产品优化的专人服务按小时计算的 IT 和生物信息学咨询带来个性化协助了解 Illumina 的更多支持信息, 请访问 : illumina.com/services/instrument-services-training. html

8 Illumina 中国上海办公室电话 (021) 传真 (021) 北京办公室电话 (010) 传真 (010) 技术支持热线 Illumina, Inc. 保留所有权利 Illumina, MiniSeq, BaseSpace, TruSight, TruSeq, DesignStudio 和南瓜橙色是 Illumina, Inc. 的商标或注册商标本文档包含的所有其他品牌和名称均为其各自所有者的财产 Pub. No Current as of 21 May 2016

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MiniSeq系统：探索无限可能 MiniSeq 系统探索无限可能了解用于分子生物学研究的成熟 NGS 方案让您使用 Illumina NGS 更流畅 MiniSeq 系统提供了强大而又高性价比的方法用于 DNA 和 RNA 测序, 是一个高精确性的台式测序仪它的方便性和流水线式的样本到答案的流程使得一次运行就可以快速测序并分析单个基因或者整个通路 MiniSeq 系统兼容整套 Illumina 文库制备方案, 拥有直观触屏式用户界面