Microsoft PowerPoint - CE workshop_中台放射線2011
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- 囿令 祖
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1 Introduction of Capillary Electrophoresis 技術服務專員楊承熹博士 美商貝克曼庫爾特公司台灣分公司 生物醫學部 Basic Principle of CE Capillary um ID Sample Flow Capillary Liquid Coolant Applied Voltage Detector n-line Detection --- UV/Vis --- PDA ---LIF ---MS 0-30 kv Inlet Buffer : ph utlet Time program: 1. Rinse 2. Inject 3. Separate 4. Post-rinse 1
2 Principle of Capillary Electrophoresis + Anode - + Cathode s : sample ( 樣品 ) ep: electrophoresis ( 電泳流 ) eo: electroosmotic flow (EF, 電滲透流 ) What is electrophoresis ( 電泳 )? 帶電物質在電場作用下, 因其表面電荷不同而以不同 速度向電荷相反的方向移動, 此現象稱為電泳 帶電物質在電場中移動的速度與物質之電荷成正比, 而與質量成反比 2
3 What is electroosmotic flow ( 電滲透流 )? The negatively-charged wall attracts positively-charged ions from the buffer, creating an electric double layer. When voltage is applied, cations in the diffuse portion of double layer migrate in the direction of the cathode, carrying water with them. The result is a net flow of buffer solution in the direction of the negative electrode. Capillary wall Schematic of Electric Double Layer Capillary wall 3
4 Stern layer Schematic of Electric Double Layer Diffuse layer EF Stern layer Diffuse layer Unique feature of EF Laminar flow EF Flow 以電滲流作為驅動力可以避免拋物線流效應, 使分析物的峰寬較窄, 增加分析物解析度 4
5 Modes of Separation 1. Capillary Zone Electrophoresis (CZE) 2. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) 3. Capillary Gel Electrophoresis (CGE) 4. Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) Mode CZE MECC CGE CIEF Mechanism Charge / Mass Hydrophobicity ze PI Application Protein, peptide, 帶有電荷之藥物等化學物質 取代 : 傳統電泳以及 HPLC 之離子交換 主要為藥物以及其他小分子, 應用範圍廣泛 取代 :HPLC 之逆相層析 DNA, RNA, ligonucleotide, Protein, Polymer. 取代 :SDS PAGE, GPC Protein, peptide. 取代 :IEF Capillary Zone Electrophoresis (CZE) 分離原理 樣品在電解液中泳動, 根據物質之 charge/mass 比值差異來進行分離. 比值愈大, 跑得愈快 特徵 1. 可使用塗層 (coating- 避免樣品吸附或抑制電滲透流 ) 或未塗層 (uncoating) 之毛細管 2. 毛細管中除電解液外, 無需填充任何物質 3. 以電解液之 ph 值, 離子濃度, 溫度, 毛細管長度及電壓大小來控制分離狀態 4. 使用未塗層之毛細管進行分離時, 不僅是正電荷, 連無電荷及負電荷物質都會向負電極移動 ( 因為 EF), 所以可同時偵測正電荷 負電荷及中性物質 5
6 Schematic of CZE ( CZE ) Pharmaceutical alkaloid 生物鹼分析 6
7 ( CZE ) Fluparoxan 藥物不純物分析 ( CZE ) hgh derivatives analysis 人類生長激素分析 7
8 ( CZE ) Water soluble Vitamins 水溶性維他命分析 B1 葉酸 B6 維生素 C 菸鹼酸 維生素 K Indirect UV Detection( 間接紫外偵測法 ) -- 適用於偵測無 UV 吸光之物質 ( 例如金屬離子, 過渡元素, 陰離子, 有機酸, 界面活性劑, 單醣,polyamine 等 -- 電解液內需額外添加一種紫外光吸收物質 (UV carrier) 1. 陽離子 Imidazole, Amino pyridine, Benzylamine 等 2. 陰離子 Chromate, Phthalate, Benzoic acid, Pyromellitic acid 等 -- 可取代 AA 及 IC 8
9 Principle Indirect UV Detection 金屬陽離子分析 陽離子 UV carrier 9
10 Application: cations calibration Mg Na Standards: 1, 5, 10 and 25 mg/l NH 4 K Ca NH 4 : R 2 = Na : R 2 = AU K : R 2 = Mg: R 2 = Ca : R 2 = Minutes 陰離子分析 陰離子 UV carrier (Na 2 Cr 7 ) 10
11 rganic acids analysis Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) 分離原理 電解液中加入介面活性劑 (surfactant, 例如 SDS), 使形成 Micelle, 樣品根據疏水性 (Hydrophobicity) 之差異, 在 Micelle 及電解液之間分配系數不同, 來進行分離, 樣品疏水性愈強, 則進入 Micelle 的機會愈大. 通常物質進入 Micelle 後, 泳動的速度會變慢, 因此疏水性愈強的物質析出時間會愈長 特徵 1. 根據分子之疏水性及親水性之強弱差異進行分離 2. 可分離不帶電荷之物質, 疏水性強的物質或電荷 / 質量比值相近之物質 主要應用 根據藥物分析, 環境污染物 ( 多苯環, 除草劑, 殺蟲劑 ) 分析及其他小分子物質 11
12 Schematic of the separation principle of MECC ( MECC ) Penicillins Analysis 抗生素分析 CZE MECC +0.1 M SDS 12
13 Forensic drugs screen 法醫藥物篩檢 ( MECC ) Corticosteroids Analysis 皮質類固醇分析 ( MECC ) 13
14 Analysis of methamphetamine and its metabolites in urine Peaks: A, amphetamine; H, p-hydroxymethamphetamine; M, methamphetamine; IS, internal standard. Determination of xidized and reduced Glutathione in Whole Blood ( 抗氧化劑分析 ) 14
15 Capillary Gel Electrophoresis (CGE) 分離原理 毛細管內先填充 Gel( 例如 polyacrylamide 或 cellulose), 此時 Gel 會在毛細管內形成分子篩, 樣品依分子量之大小在毛細管內移動速度不同而進行分離 特徵 1. 可分離蛋白質,DNA,RNA, 多醣類及高分子聚合物, 並定其分子量 2. 可改變 Gel 的濃度來控制分離的範圍 主要應用 蛋白質,DNA,RNA, 多醣類及高分子聚合物 Nucleic Acids - CH 2 Base H H H H H P CH 2 H { - { H H P CH 2 H - { H P H Base H H H Nucleic Acids: DNA and RNA Polymer composed of units with the same charge-to to-mass ratio Base H 15
16 ze Based Separation in Gel Denatured DNA with constant charge to mass ratio Longer DNA molecules move slower through gel Cathode + Anode Separation of ligonucleotides ( CGE ) 16
17 Synthetic oligonucleotide purity analysis ( CGE ) Laser Fluorescence 17
18 ( CGE ) Separation of a DNA ladder. Fragments between 72 and base pairs Relative Fluorescence Intensity ( CGE ) Plasmid purity Analysis 40 (A) RFU / (C) (B) (D) linear 5.7 kb marker (E) (F) Migration time / min 18
19 SDS-Gel Analysis Automated SDS-Gel capillary technology Molecular eve capillary filled with polymer gel solution replaceable sieving matrix improved reproducibility detection window Separation and Detection Mechanism protein forms complex with SDS complexes have same charge to size ratio proteins migrate in order of increasing size absorbance measurements performed using PDA 0.12 PDA - 220nm SDS-Gel Analysis - broad ProteomeLab range of separation TM PA K 50K Goodness of fit: K 0.09 AU AU K 100K K 225K Minutes SDS-MW analysis of a Protein Standard ladder using the new SDS-Gel polymer. 75 um x 20 cm (det) bare fused silica capillary, E.K. sample introduction ( CGE ) 19
20 AU PDA - 220nm p102302ll101602degmab Minutes AU mau min SDS-Gel IgG Purity Analysis - resolution - PDA - 220nm p102302ll101602degmab AU AU 0.02 degradation products hi-mw impurity Minutes Detection of degradation products ( CGE ) SDS-Gel Analysis - resolution - kd AU Minutes CE-SDS reduced / UV (220nm) 20
21 SDS-Gel IgG Purity Analysis - resolution of impurities - Resolution of IgG degradation isoforms SDS-Gel IgG Purity Analysis - reproducibility - PDA - 220nm IgG reduce PDA - 220nm IgG reduce PDA - 220nm IgG reduce AU AU Human IgG Minutes 21
22 等電點 (pi) 此為蛋白質的特性, 當蛋白質存在於某一個 ph 值環境下, 其正電荷及負電荷的數目相等 ( 淨電荷等於零, 不帶電 ), 則此 ph 值即為其等電點 分離原理 電解液中混合 gel 及 ampholite( 小分子兩性離子混合物 ), 通電後 ampholite 會先形成 ph 梯度, 樣品會各自向其等電點移動, 直到不帶電荷 ( 等電點 ) 時則停止移動, 最後利用氣體壓力將已等電聚焦之樣品推動, 經過偵測器進行偵測 特徵 Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) 1. 需使用 coating 毛細管, 避免電滲透流存在, 破壞 ph 梯度 2. 蛋白質因等電點之差異而進行分離, 並可直接定量 3. 小分子之 peptide 亦可分離定量 Capillary Isoelectric Focusing (cief( cief) cief Methodology (Sample Loading) Detection Window Anode Cathode Sample Vial Waste Waste Vial Vial 22
23 The Isoelectric Point (pi) of a Protein cief Methodology (Focusing) Detection Window Anode H Cathode H- Phosphoric Acid pi = 7.0 Compounds' pi Regions abs Detection of small cathodic peaks during focusing Sodium Hydroxide pi = 9.5 pi = min 15 min 23
24 Chemical Mobilization With Acetic Acid Anode Cathode H30+ CH3C- CH3H CH3C- Phosphoric Acid abs Detection of large merged peaks during mobilization Acetic Acid 15 min 32 min 分析物可以根據等電點的差異性被分離 Synthetic Peptide pi Markers as Internal Standards 24
25 cief - Capillary Isoelectric Focusing Universal cief methods cover a broad range of therapeutic MAbs cief - Capillary Isoelectric Focusing Reproducibility: pi < 0.1% RSD Isoform composition <1% RSD 25
26 Leading Advantages f CE mple and selective separation mechanism Minimal reagent consumption Nanoliter injection volumes High degree of system automation Fast analysis time Q & A? 26
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