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彬岑
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1 2009 年第 29 卷有机化学 Vol. 29, 2009 第 4 期, 658~662 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 4, 658~662 学术动态细胞色素 P450 的结构与催化机理王斌 * 李德远 ( 军事经济学院军需系营养与食品研究所武汉 ) 摘要细胞色素 P450 酶是广泛存在的含亚铁血红素单加氧酶, 参与甾类激素的合成脂溶性维生素代谢多不饱和脂肪酸转换为生物活性分子, 以及致癌作用和药物代谢. 综述了细胞色素 P450 结构与功能的关系, 特别是细胞色素 P450 活性位点经历大幅度开 / 关运动结合底物和释放产物以及电子迁移途径. 关键词细胞色素 P450; 羟基化 ; 结构 ; 功能 ; 催化机理 Structure and Catalytic Mechanism of Cytochrome P450 Wang, Bin* Li, Deyuan (Institute of Nutrition Food, Military Economy Academy, Wuhan ) Abstract P450 enzymes are ubiquitous heme-containing monooxygenases and involved in a number of vital processes including carcinogenesis and drug metabolism as well as the biosynthesis of steroid hormones and fat-soluble vitamin metabolism and the conversion of polyunsaturated fatty acids to biologically active molecules. Recent advances in understanding structure-function relationships in cytochrome P450 are summarized. Of particular importance is the role that plays in P450 function, where the active site undergoes large open/close motions to enable substrates to bind and products to leave and electron transfer pathways. Keywords cytochrome P450; hydroxylation; structure; function; catalytic mechanism 细胞色素 P450 (cytochromes P450) 是一族在温和条件下能够把底物中反应惰性的碳氢键氧化的单加氧酶, 负责内生和外生底物的新陈代谢, 包括甾类激素胆汁酸药物胆固醇脂肪酸毒素前致癌剂的合成, 能够使相对不溶于水的有机底物溶解度增加而被排出生物体外. 细胞色素 P450 在原核生物中, 游离于胞质中, 为一种可溶性蛋白 ; 在真核生物中, 作为一种膜结合蛋白, 主要分布在内质网微粒体和线粒体内膜上. 目前超过 50% 的药物代谢经由细胞色素 P450 氧化, 在药物代谢和解毒方面具有重要作用. 细胞色素 P450 相对统一的结构与其分歧复杂的催化氧化功能之间存在何种对应关系一直是个谜 [1]. 随着蛋白组时代的来临, 多个细胞色素 P450 的结构得以阐明, 其催化机理越来越清晰. 本文综述细胞色素 P450 结构功能以及催化机理方面的研究进展. 1 结构特点细胞色素 P450 与一氧化氮合酶 (NOS) 一样都是以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶, 都需要亚铁血红素 (HEM) 活化氧. 活性中心 HEM 的铁离子一侧与半胱氨酸的硫络合, 另一侧可与水中的氧分子络合. 细胞色素 P450 中绝对保守的半胱氨酸与催化活性中心亚铁血红素中铁元素形成硫醇盐离子键, 成为铁的一个配体 [2]. 这正是细胞色素 P450 中的铁能与一氧化碳络合, 并在 450 nm 存在特征吸收的原因, 最初名称也由此而来. 数十个细胞色素 P450 晶体结构显示不同种属间的 * wb@163.com; Tel.: Received June 21, 2008; revised September 12, 2008; accepted November 10, 总后军需物资油料部 (No. 需 ) 资助项目.

No. 4 王斌等 : 细胞色素 P450 的结构与催化机理 659 序列差异较大, 但其三维结构高度保守. 所有细胞色素 P450 都基于序列维持整个结构折叠弯曲的相似, 其二级结构用典型细胞色素 P450 折叠命名法标示, 如图 1 所示的是 P450 StaP 的折叠结构和对应折叠弯曲结构的名称 [3].

尽管 P450 StaP 催化反应不同于常见的细胞色素 P450 对碳氢键的羟基化, 但是其结构具有细胞色素 P450 家族的酶特有的相似折叠结构和相同的氧化活性中心 (HEM), 从 N 端到 C 端包含 α 螺旋结构为 A, B, C, D, F, E, G, H, I, J, K, L 以及相似的 β 折叠结构. 不尽相同的过渡螺旋结构, 则通过标注 ' 区别, 如 B', K' 等.

图 2 P450 cam 结合底物的晶体结构 Figure 2 Crystal structure of the P450c am with substrate 图 3 P450-2B4 的晶体结构 Figure 3 Structure of P450-2B4 还是有足够的结构差异, 以便大小不同的底物与不同种类细胞色素 P450 结合, 例如, 从 CYP2E1 (CYP 代表 P450)

2 No. 4 王斌等 : 细胞色素 P450 的结构与催化机理 659 序列差异较大, 但其三维结构高度保守. 所有细胞色素 P450 都基于序列维持整个结构折叠弯曲的相似, 其二级结构用典型细胞色素 P450 折叠命名法标示, 如图 1 所示的是 P450 StaP 的折叠结构和对应折叠弯曲结构的名称 [3]. 从链霉菌分离出的咔唑生物碱星孢菌素 (Staurosporine) 具有强抗癌作用, 其生物合成的关键步骤是由 P450 StaP 催化底物色素吡咯酸 (chromopyrrolic acid, CPA) 氧化脱氢, 形成分子内 C C 键成咔唑环, 经氧化脱羧完成. 尽管 P450 StaP 催化反应不同于常见的细胞色素 P450 对碳氢键的羟基化, 但是其结构具有细胞色素 P450 家族的酶特有的相似折叠结构和相同的氧化活性中心 (HEM), 从 N 端到 C 端包含 α 螺旋结构为 A, B, C, D, F, E, G, H, I, J, K, L 以及相似的 β 折叠结构. 不尽相同的过渡螺旋结构, 则通过标注 ' 区别, 如 B', K' 等. 晶体结构显示 P450 StaP 结合底物 CPA 的三种方式 : 一种是位于由 Hem, B'2 和 I 螺旋连接 F, G 螺旋的回转结构 (F/G loop) 缝制而成的活性中心口袋中, 其它两种结合方式的意义尚不十分清楚, 但可能揭示了底物进入活性中心的可能通道 [3]. 图 2 P450 cam 结合底物的晶体结构 Figure 2 Crystal structure of the P450c am with substrate 图 3 P450-2B4 的晶体结构 Figure 3 Structure of P450-2B4 还是有足够的结构差异, 以便大小不同的底物与不同种类细胞色素 P450 结合, 例如, 从 CYP2E1 (CYP 代表 P450) 结合的底物乙醇到 CYP165B1 和 CYP165C1 结合的巨型肽抗生素, 对细胞色素 P450 酶系稳定保守的空间结构适应这么大不同结构的底物是一个挑战. 图 1 StaP 未结合底物的晶体结构 Figure 1 Crystal structure of substrate-free form of StaP 从另一角度观察一些细胞色素 P450 与底物结合的空间构象, 可以明显看到围绕 I 螺旋表面形成通向活性位点的开 / 关运动的通道 ( 图 2 [4], 图 3 [5~7] ). 在钌与光敏剂络合后与底物结合, 再与 P450 cam 酶结合, X 光晶体衍射显示出 P450 cam 的亚分子结构和隐藏在深处活性位点的立体结构和性质, 其中钌到活性中心铁的间距即具有催化活性的大沟的深度为 21 Å. 综合几种细胞色素 P450 的结构显示, 亚铁血红素基团均被限制在末端的螺旋 I 和邻近的螺旋 L 之间 ( 对比图 1~ 图 3). 接近催化中心的半胱氨酸与邻近主链的氨基形成两个氢键 ; 长螺旋 I 形成了亚铁血红素口袋内壁, 并且包含了特征氨基酸序列 ; 高度保守具有酸性残基的苏氨酸位于活性位点, 参与催化作用 [3~5,8,9]. 尽管细胞色素 P450 酶系的折叠结构高度保守, 但 2 底物识别与结合的诱导 - 契合机制细胞色素 P450 催化的反应在以水为溶剂的环境中进行, 而底物是反应惰性的多种结构不同的脂溶性有机物, 难溶于水. 细胞色素 P450 在维持其折叠方式的同时, 需要适应和容纳不同结构的底物兼顾水与有机相, 让底物进入深埋着的活性中心. 因而, 结合底物和释放产物是关键步骤. 对于酶 - 底物的结合机制, 最有代表性的是 Koshland [10] 提出的诱导 - 契合学说. 诱导 - 契合学说认为酶的活性部位在天然状态下并不能与底物精确配合, 而是在底物的诱导下发生构象改变才能与底物契合, 同时底物的结构也发生了一定的变化以配合改变了的活性部位构象. 细胞色素 P450 通过诱导 - 契合机制识别底物是由六个底物识别位点 (substrate recognition sites, SRS) 来执行的 : B' 螺旋区 (SRS1), 螺旋 F 和 G 的一部分 (SRS2 和 SRS3), 螺旋 I 的一部分 (SRS4), 螺旋 K 的 β2 连接区

3 660 有机化学 Vol. 29, 2009 (SRS6), 以及 β 发夹区 (SRS5)( 图 3). SRS 是柔性蛋白质区域, 能够移动到底物, 并结合在一起, 在诱导 - 契合机制作用下, 促成与底物的结合, 以及随后的催化反应. SRS 的点突变很大地影响酶识别与结合底物的特性. 图 3 中的 P450 2B4 的晶体结构显示了从蛋白质表面穿过周围细胞色素 P450 特有的螺旋和折叠结构延伸到活性中心 HEM 所敞开的裂缝 [5~7,10]. 裂缝开口与闭合的构象变化主要限于 F 到 G, B' 和 C 螺旋, N 端的 I 和 β 区域形成的盖帽结构域. 将 P450-2B4 与抑制剂 4-(4- 氯苯 ) 咪唑 (CPI) 结合前后的构象对比绘制在一张图中, 则可以明显看到构象的重排变化 ( 图 4) [6]. 图 4 显示了大规模的构象变化主要由结构保守的部分之间再布局, 伴随显著的少许二级结构的重塑, 例如底物识别位点 SRS1, SRS4, SRS5, SRS6 形成一个小的疏水大沟包围底物, 从开到关构象变化重新部署, F/G 回转结构 ( 包括 F', G'), B` 螺旋 C 螺旋靠近底物 CPI, I 移向 HEM( 图 4 黑色构象变到灰色构象 ). 这种结构显示细胞色素 P450 能够采用大开的构象接纳底物, 允许底物直接从外部迁移到活性部位 [11~17]. 图 4 比较 2B4( 黑色 ) 和 2B4/CPI 复合物 ( 灰色 ) 的结构 Figure 4 Comparison of the 2B4 structure (black) with 2B4/CPI complex (gray) [3,18] 此外, Masatomo 等分析 P450 StaP 结合和未结合底物 CPA 的 X 光晶体结构, 发现结合底物时, P450 StaP 采取更为有序构象, 活性位点残基构象重排, 特别是 StaP 在 B'1/B'2 loop 经历显著的构想变化. 在垂直于酶活性中心 HEM 平面结合底物的空穴中, 羧基间氢键作用和与吲哚环的 T 型相互作用控制着底物, 在催化过程中, HEM 向中心螺旋 I 移动. 这与在 P450 2B4 中看到的构象变化是一致的. 3 催化氧化反应过程在经历诱导 - 契合机制结合底物后, 细胞色素 P450 催化氧化底物的过程还需要经历以下过程完成催化氧化. 3.1 三价铁还原正如其它含铁蛋白结合氧气分子, 细胞色素 P450 在结合氧气分子之前, 三价铁被还原成更容易络合氧分子的二价铁. 不同类型细胞色素 P450 还原机制不同. P450BM-3( 脂肪酸单加氧酶, 分离自细菌 Bacillus megaterium) 的电子传递还原三价铁的模式最为简单. P450BM-3 由含 HEM 结构域和 FMN/FAD 还原酶结构域两部分通过一个单肽链连接而成 [19]. 亚铁血红素 (HEM) 和黄素单核苷酸 (FMN) 两结构域之间的体晶体结构如图 5 所示 [20], 孤立的圆球代表两结构域间的水分子, 虚线代表氢键桥键和盐桥. 结合 HEM 的多肽 Pro-382- Cys-400 部分提供直接从 FMN 到 HEM 的电子迁移途径. 两结构域之间有两个氢键 ( 虚线 ) 一个盐桥( 虚线 ) 几个水分子 ( 球状 ) 居中接触. 仅仅 967 Å 2 的直接接触面显示, HEM 和黄素 FMN 之间的相互作用不强, 二者所在平面几乎相互垂直, 但之间相距仅为 17~18 Å. FMN 的 7- 甲基距离 Ile-385 的羰基和 Gln-387 的氨基氮分别为 4.1 和 4.0 Å, 距离 HEM 中的铁 18.4 Å. 电子从 FMN 传递到 HEM 的关键是 Trp-574 的吲哚环. 该吲哚环与 FMN 的异咯嗪环共平面, 保护其重要部分免受溶剂作用. 两芳环相距仅 3.3 Å, 在超过 600 nm 的可见光范围有 BM3-FMN 宽吸跃迁收峰, 显示二者形成了电荷转移复合物 (Charge-transfer complex, CT complex). Trp-574 的吲哚环距离 Pro-382 羰基和侧链的 Ser-383<4 Å. 在界面适当位置排列的水分子的氢键作为 Trp-574 吲哚氮与 Ser-383 和 Ile-385 的羰基间桥梁. FMN 的异咯嗪环和 Trp-574 的吲哚环都具有大 π 轨道, 形成 CT 络合物, 邻近键连着亚铁血红素 - 肽链, 是从黄素到血红素的成键电子传递途径. 因此, 电子能够从黄素 Trp-574 流动到 Pro-382-Gln-387 多肽, 然后由半胱氨酸配体 (Cys-400) 经成键轨道直接到达 HEM 的铁元素 [19,20]. 3.2 HEM 结合氧气分子细胞色素 P450 活性中心的铁被还原形成亚铁血红素后, 容易结合到分子氧, 形成亚铁 P450- 二氧复合物. 三价铁还原和结合氧气分子的反应方程如下 [21] : P-Fe(III)+O 2 +e - P-Fe(II)-O 2 过氧化氢可取代氧气分子氧化底物, 使细胞色素 P450 催化氧化过程产生捷径 ( 图 6 中复合物 3~ 复合物 6) [22]. P-Fe(III)+H 2 O 2 P-Fe(III)-O-OH+H +

No. 4 王斌等 : 细胞色素 P450 的结构与催化机理 661 化复合物中的氧氧化, 即氧的电负性较大, 电子流向氧, 形成阳离子自由基, 得到 π 体系部分的稳定作用. 过氧键不稳定, 经结合质子和异裂产生一分子水和高活性的氧合铁中间体. 铁表观化合价升为 +5 价, 得到卟啉环 π 体系的络合稳定.

P Fe(III)-O-OH +H + [P Fe(IV)=O] + +H 2 O 高价铁氧中间体 P Fe(IV)=O 的形成是整个催化循环过程中的限制性步骤, 正是该氧铁卟啉阳离子自由基, 即能提供单电子, 又含正电荷, 提供活性氧原子, 在水溶液中能够实现转移氧原子, 插入到惰性的 C H 键中, 实现温和条件下烃的羟基化 [23~26]. 3.

4 No. 4 王斌等 : 细胞色素 P450 的结构与催化机理 661 化复合物中的氧氧化, 即氧的电负性较大, 电子流向氧, 形成阳离子自由基, 得到 π 体系部分的稳定作用. 过氧键不稳定, 经结合质子和异裂产生一分子水和高活性的氧合铁中间体. 铁表观化合价升为 +5 价, 得到卟啉环 π 体系的络合稳定. 如 P 代表卟啉, PFe(V)=O 氧合形式也可简写为 P Fe(IV)=O 或 [FeO] 3+, 其中 P 代表卟啉自由基阳离子 [21,22]. P Fe(III)-O-OH +H + [P Fe(IV)=O] + +H 2 O 高价铁氧中间体 P Fe(IV)=O 的形成是整个催化循环过程中的限制性步骤, 正是该氧铁卟啉阳离子自由基, 即能提供单电子, 又含正电荷, 提供活性氧原子, 在水溶液中能够实现转移氧原子, 插入到惰性的 C H 键中, 实现温和条件下烃的羟基化 [23~26]. 3.5 氧化底物图 5 P450BM-3 (A) 和 HEM-FMN 两结构域作用界面 (B) Figure 5 Cytochrome P450BM-3 (A), and its HEM-FMN domain interface (B) 氧合铁中间体 PFe(V)=O 中的铁为高价五价, 具有较高的氧化能力, 而细胞色素 P450 底物上的碳氢键正好接近高价铁原子. 氧原子从氧合铁中间体迁移到底物上, 形成氧化产物. 最后, 产物被水或新的底物取代, 从复合状态解脱离去, 完成循环. 至此, 细胞色素 P450 完成了羟基化作用. 但对于 P450 StaP 的催化过程主要是经历高价铁氧中间体 P Fe(IV)=O 对底物氧化脱氢, 而不是在 C H 键上插入氧 [27~29]. 尽管中间催化历程存在氧化脱氢与单加氧的不同, 但由于活性中心空间折叠和螺旋结构与典型细胞色素 P450 相同, 仍将 P450 StaP 归为细胞色素 P450 酶系. 4 小结图 6 细胞色素 P450 催化氧化过程 Figure 6 Catalytic cycle way for oxygen activation and transfer by cytochrome P 形成 Fe(III)- 氢过氧化复合物 P-Fe(II)-O 2 经第二个单电子还原和质子化, 形成 Fe(III)- 氢过氧化复合物 P-Fe(III)-O-OH. P-Fe(II)-O 2 +e - +H 高活性氧合铁中间体形成 P-Fe(III)-O-OH+H 2 O 卟啉环的 π 体系富含 π 电子, 容易被 Fe(III)- 氢过氧细胞色素 P450 是一类具有相同的亚铁血红素催化氧化活性中心相近空间折叠和螺旋结构能够活化氧气催化氧化有机底物的一类氧化还原酶. 细胞色素 P450 与底物和氧化产物的复合物晶体结构得到 X 光晶体衍射数据的证实, 而其他中间体, 由于反应活性高, 在动力学研究中缺少足够的中间体聚积, 有待直接测定方法进行证实. 随着细胞色素 P450 结构和功能研究的深入, 进一步加深理解酶的结构与功能的关系, 将推动药物设计和酶化学的发展. References 1 Denisov, I. G.; Makris, T. M.; Sligar, S. G. Chem. Rev. 2005, 105(6), Wang, B.; Su, X.-S.; Zhang, S.-H. Chin. J. Org. Chem. 2005, 25(3), 342 (in Chinese). ( 王斌, 苏喜生, 张声华, 有机化学, 2005, 25(3), 342.)

5 662 有机化学 Vol. 29, Masatomo, M.; Hiroshi, S.; Yoshitsugu, S.; Shumpei, A.; Hiroyasu, O.; Shingo, N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104(28), Ivan, J. D.; Brian, R. C.; Jonathan, J. W.; Jay, R. W.; Harry, B. G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96(23), Scott. E. E.; He, Y. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100(23), Zhao, Y.-H.; White, M. A.; Muralidharaet, B. K.; Sun, L.; Halpert, J. R.; Stout, D. C. J. Biol. Chem. 2006, 281(9), Muralidhara, B. K.; Negi, S.; Chin, C. C.; Braun, W.; Halpert, J. R. J. Biol. Chem. 2006, 281(12), Pylypenko, O.; Schlichting, I. Annu. Rev. Biochem. 2004, 73, Wade, R. C.; Winn, P. J.; Schlichting, I. J. Inorg. Biochem. 2004, 98(7), Koshland, D. E. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, Schlichting, I.; Berendzen, J.; Chu, K.; Stock, A. M.; Maves, S. A.; Benson, D. E.; Sweet, R. M.; Ringe, D.; Petsko, G. A.; Sligar, S. G. Science 2000, 287(5458), Zhang, H.-M.; Im, S.-C.; Waskell, L. J. Biol. Chem. 2007, 282(41), Guengerich, F. P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103(37), Bayburt, T. H.; Sligar, S. G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99(10), Poulos, T. L. Drug Metab. Dispos. 2005, 33(1), Scott, E. E.; White, M. A.; He, Y. A.; Eric, F. J. J. Biol. Chem. 2004, 279(26), Funhoff, E. G.; Van Beilen, J. B. Biocatal. Biotransform. 2007, 25(2~4), Howard-Jones, A. R.; Walsh, C. T. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128(37), Noble, M. A.; Girvan, H. M.; Smith, S. J.; Smith, W. E; Murataliev, M.; Guzov, V. M.; Feyereisen, R.; Munro, A. W. Drug Metab. Rev. 2007, 39(2~3), Sevrioukova, I. F.; Li, H.-Y.; Zhang, H.; Peterson, J. A.; Poulos, T. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96(5), Woggon, W. D.; Wagenknecht, H. A.; Claude, C. J. Inorg. Biochem. 2001, 83(4), Groves, J. T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100(7), Guallar, V.; Baik, M.-H.; Lippard, S. J.; Friesner, R. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100(2), Podust, L. M.; Kim, Y.-C.; Arase, M.; Neely, A. B.; Beck, B. J.; Bach, H.; Sherman, D. H.; Lamb, D. C.; Kelly, S. L.; Waterman, M. R. J. Biol. Chem. 2003, 278(14), Guengerich, F. P. Chem. Res. Toxicol. 2001, 14(6), Meunier, B.; Bernadou, J. Top. Catal. 2002, 21(1~3), Fujii, H. Coord. Chem. Rev. 2002, 226(1~2), Stone, K. L.; Behan, R. K.; Green, M. T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102(46), Marika, E.; Tove, S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103(37), (Y Qin, X.)

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Microsoft Word - 050771.doc 2005 年第 25 卷有机化学 Vol. 25, 2005 第 7 期, 771~779 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 7, 771~779 综述与进展紫草素的全合成研究进展徐德锋管鹏健毛志强李绍顺 * ( 上海交通大学药学院上海 200030) 摘要综述