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1 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 : 387 ~ 396 SCIENTIA SINICA Vitae life.scichina.com SCIENCE CHINA PRESS 论文 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 1 孙宪昀, 朱菊芬 1* 李少杰 1, 宝丽 1, 胡成成 1, 金城 1 中国科学院微生物研究所, 真菌学国家重点实验室, 北京 ; 2 Department of Plant Pathology, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln , USA * 联系人, shaojieli@gmail.com 收稿日期 : ; 接受日期 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : , ) 和中国科学院 百人计划 资助项目 1, HARRIS Steven D. 2, 刘宏伟 1, 摘要为减少 DNA 中尿嘧啶的掺入, 细胞内尿嘧啶水平受到严格控制, 但其机制尚不清楚. 构巢曲霉 (Aspergillus nidulans) 乳清酸核苷 5 - 磷酸脱羧酶 PyrG 催化乳清苷酸 (OMP) 转化为尿苷酸 (UMP) 的反应, 本研究发现, 在过量尿嘧啶存在的情况下, PyrG 对维持细胞内较低尿嘧啶浓度具有重要作用. 与野生菌株相比, 过量尿嘧啶及其代谢物对乳清苷酸脱羧酶缺陷的 pyrg89 突变体具有更强的抑制作用, 并能增强 pyrg89 突变体的有性发育. 通过数字基因表达谱 (DGE) 分析 pyrg89 突变体和野生菌株对过量尿嘧啶的转录响应, 发现尿嘧啶转录激活 pyrg89 突变体中有性发育相关的基因. HPLC 定量分析显示, 在过量尿嘧啶存在的情况下, pyrg89 突变体胞内尿嘧啶水平是野生菌株的 6.5 倍. 本研究的结果不仅为细胞内尿嘧啶循环及细胞对过量尿嘧啶的适应机制提供了新内容, 还揭示了 OMP 脱羧酶对真菌生长发育存在潜在影响. 关键词乳清酸核苷 5 - 磷酸脱羧酶压力尿嘧啶有性发育 乳清酸核苷 5 - 磷酸脱羧酶 (OMP 脱羧酶, EC ) 通过脱羧作用催化乳清苷酸转化为尿苷酸, 是嘧啶从头合成的关键酶. OMP 脱羧酶在酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中由 URA3 基因编码 [1], 在构巢曲霉 (Aspergillus nidulans) 中由 pyrg 基因编码 [2], 而在粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa) 中则由 pyr-4 基因编码 [3]. 由于 OMP 脱羧酶受损的营养缺陷型突变体能够在添加了外源尿苷和尿嘧啶的培养基中正常 生长, 而且具有功能的 OMP 脱羧酶编码基因易于回补这种缺陷, 因此, 基于回补 OMP 脱羧酶突变体的遗传操作广泛用于酿酒酵母 [4] 构巢曲霉 [5] 产黄青霉 (Penicillium chrysogenum) [6] 黑曲霉(Aspergillus niger) [7] 瑞氏木霉(Trichoderma reesei) [8] 和烟曲霉 (Aspergillus fumigatus) [9] 等多种真菌. 在丝状真菌中, 粗糙脉孢菌 pyr-4 基因被广泛地用作一种筛选标记来回补 OMP 脱羧酶突变体 [5~11]. 引用格式 : 孙宪昀, 朱菊芬, 宝丽, 等. 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用. 中国科学 : 生命科学, 2013, 43: 英文版见 : Sun X Y, Zhu J F, Bao L, et al. PyrG is required for maintaining stable cellular uracil level and normal sporulation pattern under excess uracil stress in Aspergillus nidulans. Sci China Life Sci, 2013, 56: , doi: /s

2 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 当对一个新的突变体进行表型分析时, 对应的 OMP 脱羧酶缺陷出发株通常被用作对照. 为此, 尿嘧啶就需要添加到培养基中以维持 pryg 突变体的生长. 但是, 外源尿嘧啶的加入是否对 pryg 突变体和野生菌株的生长发育有不同的影响并不清楚. 有证据显示, 细胞内尿嘧啶水平是受到严格控制的, 以此来防止过多的尿嘧啶在细胞中积累. 在外源尿嘧啶胁迫时, 酿酒酵母中负责尿嘧啶转运的尿嘧啶通透酶基因 FUR4 [12] 的转录水平降低 [13,14]. 与之类似, 外源的尿嘧啶的加入也会降低构巢曲霉 Fur4p 类的尿嘧啶通透酶基因 furd 的表达 [15]. 在蛋白质翻译后水平, 外源尿嘧啶的存在加速了 Fur4p 的泛素化降解 [14]. 细胞内尿嘧啶水平的严密控制对于维持低的尿嘧啶 : 胸腺嘧啶比例尤为重要, 以此来降低尿嘧啶掺入 DNA 而造成的突变 [15]. 基因组 DNA 调节区域尿嘧啶对胸腺嘧啶的替换能够破坏蛋白质 -DNA 相互作用的特异性 [16]. 在本研究中, 发现 OMP 脱羧酶的缺失增加了构巢曲霉对过量尿嘧啶及其代谢物的敏感性. 过量的尿嘧啶及其代谢物也增强了 OMP 脱羧酶突变体的有性发育. 通过数字基因表达谱 (DGE) 对野生菌株及 pyrg 突变体的差异表达谱分析显示, 过量的尿嘧啶转录激活了 OMP 脱羧酶突变体中与有性发育相关的基因. 1 材料与方法 1.1 菌株及培养基 本研究中, 构巢曲霉 FGSC A773 (pyrg89, wa3, pyroa4, vea1) 菌株作为母本菌株. 将含有粗糙脉孢菌 pyr-4 基因的 PCR 片段转化到 A773 菌株获得 AHC01 (pyrg89, wa3, pyroa4, pyr-4, vea1) 菌株. 构巢曲霉的 [17] [18] 原生质体转化参照 Miller 等人和 Calvo 等人报道的方法. A773 菌株和构巢曲霉 FGSC A4 (vea+) 菌株杂交获得 ALS05 (wa3, pyroa4, vea1) 菌株. MMV 培养基 (1% 葡萄糖 硝酸盐 微量元素 维生素, ph 6.5) 作为构巢曲霉的生长培养基. 微量元素 硝酸盐和维生素的组成参照 Käfer [19] 在其附录中 的描述. 尿嘧啶核苷 (1 浓度为 5 mmol/l) 和尿嘧啶 (1 浓度为 10 mmol/l) 依需要加入, 加入 1.5% 琼脂来固化培养基. 1.2 胞内尿嘧啶及其中间代谢产物的分析 将构巢曲霉 A773 或 ALS05 菌株孢子接种于含有 150 ml 培养基 (MMV+1 尿苷 +4 尿嘧啶 ) 的 300 ml 三角瓶中, 于 28, 180 r/min 连续摇培 30 h. 随后, 参照 Ruijter 和 Visser [20] 所报道的方法提取胞内代谢产物, 并收集提取代谢产物后所余菌丝, 烘干后称取干重. 提取液通过 0.45 µm 滤器过滤后, 通过高效液相色谱 HPLC (4.6ID 250 mm COSMOSIL C18 色谱柱, 5% 乙腈和 0.04% 三氟乙酸盐溶液作为洗脱剂 ) 鉴定中间代谢物. 1.3 有性发育分析 有性发育的定性分析采用光学显微镜和电子显微镜观察的方法, 定量分析通过计数原子囊壳表面护卫细胞 (Hülle cells) 的方法来比较 pyrg 突变体和野生菌株之间有性发育的差异. 用打孔器获取 4 块 ( 直径约 0.5 cm) 生长于固体琼脂培养基 (MMV+1 尿苷 +4 尿 嘧啶 ) 的菌体块, 切碎后浸泡于 2 ml 无菌水中并混合均匀. 稀释成合适的浓度后在光学显微镜下利用血细胞计数板计数护卫细胞的数量. 3 次重复实验获得每平方毫米护卫细胞平均数及标准差. 1.4 DGE 分析 pyrg 突变体和野生菌株对过量尿嘧啶胁迫的转录响应 为了比较 pyrg89 突变体和野生菌株对过量尿嘧啶胁迫的转录响应, 利用数字基因表达谱 (DGE) 分析 pyrg89 突变体和野生菌株全基因组范围内对过量尿嘧啶胁迫的转录响应 [21]. 具体方法如下 : 接种野生菌株或 pyrg89 突变株的孢子于含有 75 ml 液体培养 基 (MMV+1 尿苷 +4 尿嘧啶, MMV+1 尿苷 +1 尿嘧 啶 ) 的 150 ml 三角瓶中, 在 28, 180 r/min 条件下培养 30 h. 每个处理 3 次重复, 然后提取细胞总 RNA 用于 DGE 分析. 依照试剂盒使用说明, 利用 DGE Tag Profile Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) 将总 RNA 中的 mrna 分离出来并进行测序标签的制备, [22] 详细方法参见 Sun 等人的描述. 原始数据经过处理后, 将所有处理后的标签序列比对到参考序列上 ( annotation/genome/aspergillus_group/blast.html). 同时, 为了监控正反链的比对, 正义和互补的反义序列都 进行了参考序列比对, 并最终统计出比对上基因的 388

3 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 标签数. 1.5 差异转录基因分析 为了获得 2 个样品间差异转录基因, 每个原始可用标签序列数都标准化为每百万标签数 (TPM). 依照先前报道的方法分析样品间差异转录基因或是标签数, 2 个样品间 TPM 比值大于 2 或是小于 0.5 作为差异转录的阈值 [23]. 通过计算皮尔森相关值 (P 值 ) 来获得平行库之间检测数目的相关性 ; 除了 P 值, 错误发现率 (FDR) 则用来控制差异转录的基因 [24]. 在本研究中, P 0.01, FDR 0.1 及转录水平比值对数的绝对值 1 用来界定显著差异转录的基因. 1.6 生物学功能聚类及富集分析 为了揭示响应过量尿嘧啶的差异转录基因的生物学功能, 基因的功能聚类采用 BLAST (ver ) 软件于 FunCat 数据库 ( de/proj/funcatdb/) 中进行比对, 以 e 值 为阈值. 为了进一步说明显著的生物学变化, 运用 R 统计软 件 ( 采用超几何测试算法 (P 0.01 和 FDR 0.1 作为阈值 ) 进行基因富集分析. 1.7 实时荧光定量 PCR 利用 cdna 合成试剂盒 (Fermentas, Burlington, Canada) 从细胞总 RNA 合成 cdna. 参照产品说明, 实时定量 PCR 分析采用 SYBR-Green 定量 PCR 试剂盒 (SYBR PrimeScript RT-PCR Kit, TaKaRa Biote- chnology Co. Ltd., 大连 ) 在 iq5 定量 PCR 仪 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 上进行. 每个 cdna 样品做 3 个平行分析并计算出平均循环阈值, 相对转录量的计算使用 2 Ct [25] 方法并以 β-tubulin 的转录水平来进行标准化. qrt-pcr 中使用的引物见表 1. 2 结果 2.1 pyrg89 突变增强了对过量尿嘧啶的敏感性 真菌细胞内的尿嘧啶水平被严格控制以防止过量尿嘧啶的积累. PyrG( 乳清苷 5 - 磷酸脱羧酶 ) 功能缺失的构巢曲霉突变株只能够在含有外源尿嘧啶和尿苷的培养基上生长, 以此猜测 pyrg 突变体应该比野生菌株更能耐受过量的外源尿嘧啶和尿苷. 为了验证此猜想, 本研究观察了野生菌株 ALS05 和 pyrg 表 1 定量 PCR 分析所用特异性引物 基因 nsdd nosa noxa fhba glpv upt hsp20 β-tub 引物名称及序列 (5 3 ) QnsdDF: GGCGGAACCATCACGTTCAAGTTT QnsdDR: TAACAGTGCTTGCACTTTGCGTCG QnosAF: ACCCATACGTTCTTCCTCCGTTCA QnosAR1: TTTCGATCGGTAGGTGTGGGCAAA QnoxAF: ACCGAACTGAAGAGCAGGACCAAT QnoxAR: ACCAATCTCTGTCCTGGAATGCGT QfhbAF: AAACAACGTACTTCCTGACGGCTC QfhbAR: TCTGCTTGTCGCCAAGGAAGAGAT QglpVF: GATCCGCCTTCAGTTTGCCATTGT QglpVR: AATCGCCCGAAGTCTCAGAGAGGTAT QuptF: AAGCCATCGACGTGCTGAAAGAGA QuptR: CTTAACCGCGGAAACCGTTGCATT Qhsp20F: TCTGAACATCAAGGGCCACAGTGA Qhsp20R: TAGGAAAGTTGAACGAGCGTCGGA QbtubF: TTCGGACGAGACATTCTGCTTGGA QbtubR: TGACAGCAGACACCAGATGGTTGA 突变体 A773(pyrG89) 在不同浓度的尿嘧啶和尿苷平板上生长的表型. 与预测相反, pyrg89 突变体对过量的尿嘧啶和尿苷比野生型更加敏感. 如图 1 所示, 经过 5 天的培养, 在含有高浓度尿嘧啶和尿苷 ( 正常用量的 4 倍, 用 4 尿嘧啶或 4 尿苷标记 ) 的平板上生长的野生菌株的菌落大小与在正常浓度尿嘧啶和尿苷 ( 用 1 尿嘧啶或 1 尿苷标记 ) 平板上的相似. 而在含 4 尿嘧啶和 4 尿苷的平板上生长的 pyrg89 突变体的菌落直径只有在含 1 尿嘧啶和 1 尿苷平板上的 69%±2% ( 图 1). 进一步研究发现, 是过量的尿嘧啶而不是尿苷对 pyrg89 突变体的生长起抑制作用 ( 图 1). 将粗糙脉胞菌的 pyr-4 基因转入 pyrg89 突变体中进行回补, 能完全使 pyrg89 突变体回复至野生型 ( 图 1). 这说明过量的尿嘧啶确实能够抑制 pyrg89 突变体的生长, 并且这种抑制作用是由 pyrg 的功能丧失引起的. 此外, 在 1 UU(10 mmol/l 尿嘧啶和 5 mmol/l 尿苷 ) 平板上, 野生菌株和 pyrg89 突变体都主要是通过无性产孢来繁殖的 ( 图 1 和 2). 在菌落表面大量产生的无性孢子使野生型和 pyrg 突变体的菌落呈白色. 在 4 UU(40 mmol/l 尿嘧啶和 20 mmol/l 尿苷 ) 平板上, 野生型仍以无性产孢为主, 而 pyrg89 突变体的无性产孢却显著减少, 而且有性发育明显增加从而使菌落呈淡黄色 ( 图 1 和 2). 进一步在解剖镜和扫描电子显微镜下观察发现, 在 4 UU 的平板上 pyrg89 突变体的原子囊丰富且被黄色的护卫细胞包围, 而 4 UU 的平板上的野生菌株及 1 UU 平板上的 pyrg 突变体表面的原子囊则非常稀少 ( 图 2). 389

4 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 图 1 过量尿嘧啶抑制构巢曲霉 pyrg89 突变体的生长并增强其有性发育 将构巢曲霉野生菌株 ALS05(WT), pyrg89 突变体 A773(pyrG89) 或互补菌株 AHC01(pyrG89+pyr-4) 的孢子接种到 MMVUU 培养基 (MMV+1 尿苷 +1 尿嘧啶 ) 或含有 4 添加物 (4 尿苷, 或 4 尿嘧啶, 或 4 尿苷和 4 尿嘧啶 ) 的 MMVUU 培养基平板的中心, 在 28 条件下培养 5 天, 1 尿苷的浓度为 5 mmol/l, 1 尿嘧啶的浓度为 10 mmol/l, 实验重复 3 次 2.2 pyrg89 突变增加对过量的尿嘧啶代谢相关物质的敏感性在真核细胞中, 细胞内的尿嘧啶可被用作前体物质来合成其他化合物或者通过 2 条通路被降解 [26,27]. 为了检测这些参与尿嘧啶代谢的化合物是否与尿嘧啶对 pyrg 突变体有类似的作用, 在培养基中加入过量 2 - 脱氧尿苷 (0.04 mol/l) 和尿素 (0.04 mol/l) 进行了等效实验. 如图 2 和 3 所示, 过量 2 - 脱氧尿苷 (0.04 mol/l) 和尿素 (0.04 mol/l) 抑制 pyrg89 突变体的生长但对野生菌株没有影响. 此外, 过量 2 - 脱氧尿苷 (0.04 mol/l) 和尿素 (0.04 mol/l) 增强 pyrg89 突变体有性发育而对野生型没有影响. 2.3 pyrg89 突变引起细胞内尿嘧啶的积累 pyrg89 突变体对过量尿嘧啶 (0.04 mol/l), 2 - 脱氧尿苷 (0.04 mol/l) 和尿素 (0.04 mol/l) 的超敏感表型很可能是由于尿嘧啶代谢被破坏引起的. 在 PyrG 功能缺失的情况下, 过量的尿嘧啶 2 - 脱氧尿苷和尿素可能会在细胞内积累并产生毒害. 为了验证这个假设, 采用 HPLC 对在 4 UU 培养基上生长的 pyrg89 突变体和野生菌株胞内的尿嘧啶 尿苷和 AMP 进行了定量分析. 结果显示, pyrg89 突变体胞内的尿嘧啶 尿苷和 AMP 分别比野生型中的高出 653%, 31% 和 51% ( 图 4). 2.4 pyrg89 突变体与野生菌株对过量尿嘧啶的转录响应分析为了弄清楚 pyrg 突变体中尿嘧啶积累及尿嘧啶对发育的影响机制, 通过数字基因表达谱 (DGE) 分析了在含有正常浓度尿嘧啶 (1 ) 和过量尿嘧啶 (4 ) 的液体培养基中生长的 pyrg89 突变体和野生菌株的差异转录谱. 在过量尿嘧啶胁迫下, 分别有 185 和 71 个基因在 pyrg89 突变体和野生菌株中上调, 分别有 317 和 162 个基因在 pyrg89 突变体和野生菌株中下调. 比较过量尿嘧啶胁迫下 pyrg89 突变体和野生菌株的转录谱差异发现, pyrg89 突变体中 1025 个基因的转录水平至少比野生菌株中低 50%, 655 个基因的转录水平比野生菌株高 (>1 倍 )( 网络版附表 1). 如表 2 所示, 在过量尿嘧啶胁迫下, 一些基因 ( 如 ANID_ 07074, ANID_03925, ANID_10399, ANID_02859 和 390

5 中国科学: 生命科学 图 年 第 43 卷 第5期 过量尿嘧啶胁迫下构巢曲霉野生菌株和 pyrg89 突变体有性发育比较 将构巢曲霉野生菌株或 pyrg89 突变体的孢子接种到 MMVUU 培养基(MMV+1 尿苷+1 尿嘧啶)(对照)或含有 4 (0.04 mol/l)添加物(4 尿嘧 啶, 或 4 2 -脱氧尿苷, 或 4 尿素)的 MMVUU 培养基平板的中心, 在 28 条件下培养 5 天, 1 尿苷的浓度为 5 mmol/l, 1 尿嘧啶 1 2 -脱氧 尿苷或 1 尿素的浓度为 10 mmol/l. A: 解剖镜下的观测结果; B: 扫描电子显微镜下的观测结果; C: 对野生菌株和 pyrg89 突变体的护卫细胞 的计数比较, 所示数值为 3 次重复实验结果的平均值, 标准方差用误差线表示, 1 尿苷的浓度为 5 mmol/l, 1 尿嘧啶 1 2 -脱氧尿苷或 1 尿 素的浓度为 10 mmol/l 图3 过量尿嘧啶代谢物对构巢曲霉 pyrg 突变体生长和有性发育的影响 将构巢曲霉野生菌株或 pyrg89 突变体的孢子接种于 MMVUU 培养基(MMV+1 尿苷+1 尿嘧啶) (对照)或含有 4 (0.04 mol/l)添加物(4 尿素, 或 4 2 -脱氧尿苷)的 MMVUU 培养基平板的中心, 在 28 条件下培养 5 天, 1 尿苷的浓度为 5 mmol/l, 1 尿嘧啶 1 2 -脱氧尿苷或 1 尿素的 浓度为 10 mmol/l ANID_05567)在野生菌株中没有应答, 而在 pyrg89 菌株中维持高转录水平, 而在 pyrg89 突变体中却转 突变体中显著上调. 另外一些基因(如 ANID_06657, 录降低. 这些现象表明, pyrg89 突变体对过量尿嘧啶 ANID_01608, ANID_02578 和 ANID_ 05145)在野生 比野生菌株有更明显的转录应答, 说明 pyrg89 突变 391

6 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 图 4 构巢曲霉尿嘧啶代谢途径的中间代谢物的 HPLC 图谱 通过 HPLC 对生长在含有 4 尿嘧啶和 1 尿苷基本培养基上的 pyrg89 突变体和野生菌株胞内的尿嘧啶 尿苷和 AMP 进行了定量分析, 1 尿苷的浓度为 5 mmol/l, 1 尿嘧啶的浓度为 10 mmol/l; mau 为峰面积单位 体承受了更大的压力. 在过量尿嘧啶胁迫下维持稳定的基因表达也许对细胞代谢和生长有非常重要的作用. 2.5 核苷酸代谢相关基因对过量尿嘧啶的转录应答基因富集分析显示, 2 个被测菌株的差异转录基因主要参与了含碳化合物和糖类代谢, 转运化合物及与疾病 毒性和防御相关的功能 ( 网络版附表 1). 在这些和尿嘧啶代谢直接相关的基因中, 编码 5 - 核苷酸酶 (EC: ) 的基因 ANID_05655 在 pyrg89 突变体中的转录水平比野生菌株中的高 8 倍 ( 表 2). 5 - 核苷酸酶催化单磷酸核苷酸的去磷酸化并且参与了前体核苷酸的补充 [28]. 5 - 核苷酸酶转录的增加说明, pyrg 突变体中核苷酸和核苷的平衡被打乱. 外源嘧啶吸收利用的第一步是转运. 在构巢曲霉中, furd(anid_11247) 和 cnta(anid_05493) 分别是尿嘧啶和尿苷转运蛋白的编码基因 [29]. 如表 3 和网络版附表 1 所示, 二者在 pyrg 突变体中的转录水平都不高于野生菌株. 2.6 有性发育相关基因对过量尿嘧啶的转录应答在过量尿嘧啶胁迫下, 参与有性发育的几个关键基因在 pyrg89 突变体和野生菌株中存在明显的差 异表达. 如表 3 所示, esdc(anid_09121), nosa 和 noxa 在 pyrg89 突变体中的转录水平比野生菌株中高 4 倍以上. 相反, 黄素血红蛋白基因 fhba 在 pyrg89 突变体中的转录量只有野生菌株中的 26%. 这些结果进一步通过 qrt-pcr 进行了验证 ( 图 5). 构巢曲霉 esdc(early sexual development) 是有性发育中必需的早期关键基因 [30]. 基因 nosa 在构巢曲霉中控制子实体的形成 [31]. 基因 noxa 在有性发育期间被诱导表达, noxa 的敲除特异地阻断了有性子实体的分化 ( 子囊壳 ) [32]. 对黄素血红蛋白基因 fhba 来说, fhba 的敲除会诱导有性发育 [33]. 因此, pyrg 突变体中 esdc, nosa 和 noxa 的上调和 fhba 的下调表达促进了有性发育. 3 讨论 3.1 PyrG 参与维持细胞内尿嘧啶稳态 OMP 脱羧酶是嘧啶合成所必需的. 细胞内的尿嘧啶水平受严格控制以防止尿嘧啶的积累. 这主要是通过在转录水平 转录后水平及翻译后水平对尿嘧啶通透酶的调控实现的 [13~15]. 在本研究中, 发现培养基中过量的尿嘧啶导致 pyrg89 突变体胞中尿嘧啶的积累, 而不能影响野生菌株胞内尿嘧啶的水平. 这说明 OMP 脱羧酶参与维持胞内尿嘧啶在低水平状态. 392

7 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 a) 表 2 过量尿嘧啶压力下 pyrg89 突变体和野生菌株中转录差异明显的基因 a 基因 上调基因 b 功能注释 TPM c TPM-pyr -WT TPM c TPM-pyr -WT G89 G89 1 尿嘧啶 4 尿嘧啶 1 尿嘧啶 4 尿嘧啶 倍数 (pyrg89/ WT) 4 尿嘧啶 ANID_07074 假定蛋白, 代谢与氧化还原过程 ANID_03925 假定蛋白, 糖类代谢 ANID_10399 假定蛋白, 氧化还原过程 ANID_02859 二氢吡啶二羧酸合成酶家族蛋白, 代谢过程 ANID_08953 α- 葡萄糖苷酶 B, 麦芽糖代谢, agdb ANID_09121 esdc, 有性发育 ANID_05567 GrpB 结构域蛋白 ANID_08972 假定蛋白, 转运蛋白活性 ANID_09373 推测的 Zn(Ⅱ)2Cys6 转录因子 ANID_05977 酮基还原酶, 代谢过程 ANID_10949 ABC 转运蛋白 ANID_08602 假定蛋白, 具有氧化还原酶活性 ANID_06669 推测的糖转运蛋白 ANID_ 核苷酸酶 (EC: ) ANID_00841 假定蛋白 ANID_04220 锚蛋白重复蛋白, 参与减数分裂和胞质 核定位 ANID_ 硝基苯磷酸酶, 参与对氨基苯甲酸甲酯降解 ANID_03520 假定蛋白 ANID_10964 甲基转移酶, 代谢过程 ANID_04085 蛋白磷酸酶 2a 65 kd 调控亚基 下调基因 ANID_05447 谷氨酸脱羧酶, 氨基酸代谢 ANID_06657 假定蛋白 ANID_01608 假定蛋白 ANID_01510 氧化还原酶 oxidoreductin ANID_02578 假定蛋白, 具有过氧化物酶活性 ANID_05145 假定蛋白 ANID_04940 细胞响应压力的蛋白 ANID_02555 丝氨酸羧肽酶, 蛋白质代谢 ANID_12070 谷酰基 -trna 酰胺转移酶亚基 A ANID_01879 WD 重复蛋白, 谷胱甘肽分解代谢过程和胞质 核定位 ANID_04127 假定蛋白 ANID_11246 碱基 核苷 核苷酸和核酸转运蛋白 ANID_04135 δ-9- 硬脂酸脱氢酶, 脂肪酸代谢 ANID_10299 假定蛋白, 氨基酸代谢 ANID_02286 乙醇脱氢酶 Ⅲ(ADH Ⅲ) ANID_08122 MFS 多药转运蛋白 ANID_01378 假定蛋白 ANID_ kd 肌球蛋白交叉反应抗原家族蛋白 ANID_06525 NAD- 依赖性甲酸脱氢酶 (FDH) ANID_00186 假定蛋白 ANID_03796 假定蛋白 ANID_08461 假定蛋白 ANID_09470 尿酸酶 ( 尿酸氧化酶 ), 嘌呤代谢 a) a: 基因登录号参照 broad 曲霉比较基因组数据库 ( b: 功能注释参照 broad 对基因的描述 ; c: TPM 为每百万中的标签数 P 值 FDR 393

8 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 a) 表 3 pyrg89 突变体和野生菌株中尿嘧啶和尿苷转运蛋白基因及参与有性发育的基因对过量尿嘧啶胁迫转录响应的比较 a 基因 b 功能注释 TPM c -WT 1 尿嘧啶 TPMpyrG89 1 尿嘧啶 TPM c - WT 4 尿嘧啶 TPMpyrG89 4 尿嘧啶 倍数 (pyrg89/wt) 4 尿嘧啶 尿嘧啶和尿苷转运蛋白基因 ANID_11247 尿嘧啶转运蛋白 FurD ANID_05493 浓缩的核苷透性酶 CntA 参与有性发育的基因 ANID_01052 有性发育调控蛋白 VeA ANID_03152 有性发育转录因子 NsdD ANID_04263 C2H2 锌指蛋白 NsdC ANID_09121 有性发育早期蛋白 EsdC ANID_06505 转录抑制子 rco-1, TupA/RocA ANID_05170 有性发育转录因子 RosA ANID_02260 NADH- 辅酶 Q 氧化还原酶亚基 ANID_01848 C6 有性发育转录因子 NosA ANID_02330 有性发育晚期蛋白 ANID_07169 黄素血红蛋白 FhbA ANID_00807 甲基转移酶 LaeA ANID_05457 NADPH 氧化酶 NoxA ANID_05836 细胞模式形成相关蛋白 StuA a) a: 基因登录号参照 broad 曲霉比较基因组数据库 ( b: 功能注释参照 broad 对基因的描述 ; c: TPM 为每百万中的标签数 ; - 代表 P 值大于 0.01 P 值 FDR 图 5 实时荧光定量 PCR 鉴定 pyrg89 突变体和野生菌株在过量尿嘧啶胁迫下的差异转录基因 图中显示了 4 个下调基因和 3 个上调基因的相对转录水平, 所示数值为 3 次重复的平均值, 标准方差用误差线表示 构巢曲霉 furd(anid_11247) 和 cnta(anid_05493) 是目前仅知的分别编码尿嘧啶转运蛋白和尿苷转运蛋白基因. 而研究分析表明, 构巢曲霉中还应该有更多的尿嘧啶转运蛋白基因 [29]. 因此, 即使 furd 和 cnta 在 pyrg 突变体中的转录水平相对于野生菌株没有提高, 这仍然不能断定 pyrg89 突变体中尿嘧啶的积累不是源于尿嘧啶的运输增多. 然而, 如果尿嘧啶的积累不是源于尿嘧啶的运输增多, 那么 PyrG 除了 催化 UMP 的生物合成, 也许还以一种未知的机制参与了过量尿嘧啶的循环. 尿嘧啶的积累被认为对细胞是有毒害的, 但这些毒害作用还未观察到. 本研究中, 提供了直接的证据表明高浓度的尿嘧啶影响真菌的生长发育. 由于在过量外源尿嘧啶条件下, pyrg89 突变体会积累过量尿嘧啶, 因此, pyrg89 突变体可以作为研究增加尿嘧啶是否能提高尿嘧啶整合到 DNA 中频率的理想模型. 与尿嘧啶不同, 虽然尿苷在 pyrg89 突变体中存在积累, 但其抑制作用的表型还未观察到. 这可能是由于尿苷不能作为底物直接被整合到 DNA 中来合成尿嘧啶 -DNA, 因此其毒性要低于尿嘧啶. 3.2 过量尿嘧啶激活有性发育对于大多数丝状子囊真菌, 无性产孢是正常环境条件下的主要繁殖方式, 而有性发育通常需要一些极端条件的诱导, 如低温和长时间的黑暗. 因此, 有性发育也许是真菌在极端环境下生存的一种策略. 本研究显示, 尿嘧啶及其代谢途径中的其他代谢物能够激活 pyrg89 突变体进行有性发育而抑制无性产孢, 并且与有性发育相关的关键基因, 如 esdc, nosa 和 noxa 等被诱导表达. 以上结果表明, 胞内尿嘧啶及其相关代谢产物的积累能够改变构巢曲霉的生长 394

9 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 发育状态. 与过量尿嘧啶条件下的 pyrg89 突变体相似, 鞘磷脂合成存在缺陷的构巢曲霉突变体也表现出有性产孢增强而无性产孢减弱的特征 [34]. 这些现象都表明有性发育能够被各种代谢异常所激发. 每种代谢过程都可能存在感受其代谢变化的监视器. 然而, 不同代谢监视器的异常信号也许会被传递到相同的未知信号通路上而控制真菌的发育. 这一通路被代谢监视器激发后能够在转录水平上激活 esdc, nosa 和 noxa 等有性发育关键调控基因的转录, 而后进一步激活有性发育必需基因的表达. 3.3 pyrg 影响真菌对多种压力的敏感性构巢曲霉及其他真菌的基因敲除或过表达通常采用营养缺陷型的 pyrg 突变体作为出发菌株, 通过营养缺陷标记筛选, 获得基因敲除或过表达新突变株. 新突变株的表型分析通常用出发菌株 pyrg 突变体作为对照来进行分析. 然而, 本研究明确表明, pyrg 突变能够引起真菌生长发育状态的改变. 因此, 当用 pyrg 突变体作为出发菌株得到新突变体的时候, 必须保证新突变体的表型是源于新基因的改变而不是由 pyrg 突变引起的. 参考文献 1 Bach M L, Lacroute F. Direct selective techniques for the isolation of pyrimidine auxotrophs in yeast. Mol Gen Genet, 1972, 115: Palmer L M, Cove D J. Pyrimidine biosynthesis in Aspergillus nidulans: isolation and preliminary characterisation of auxotrophic mutants. Mol Gen Genet, 1975, 138: Perkins D D, Radford A, Newmeyer D, et al. Chromosomal loci of Neurospora crassa. Microbiol Rev, 1982, 46: Boeke J, LaCroute F, Fink G R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5 -phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet, 1984, 197: Ballance D J, Turner G. Development of a high-frequency transforming vector for Aspergillus nidulans. Gene, 1985, 36: Díez B, Alvarez E, Cantoral J M, et al. Selection and characterization of pyrg mutants of Penicillium chrysogenum lacking orotidine-5 -phosphate decarboxylase and complementation by the pyr4 gene of Neurospora crassa. Curr Genet, 1987, 12: van Hartingsveldt W, Mattern I E, van Zeijl C M, et al. Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrg gene. Mol Gen Genet, 1987, 206: Smith J L, Bayliss F T, Ward M. Sequence of the cloned pyr4 gene of Trichoderma reesei and its use as a homologous selectable marker for transformation. Curr Genet, 1991, 19: Weidner G, d Enfert C, Koch A, et al. Development of a homologous transformation system for the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus based on the pyrg gene encoding orotidine 5 -monophosphate decarboxylase. Curr Genet, 1998, 33: Oakley B R, Rinehart J E, Mitchell B L, et al. Cloning, mapping, and molecular analysis of the pyrg (orotidine-5 -phosphate decarboxylase) gene of Aspergillus nidulans. Gene, 1987, 61: Waring R B, May G S, Morris N R. Characterization of an inducible expression system in Aspergillus nidulans using alca and tubulin-coding genes. Gene, 1989, 79: Chevallier M R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol, 1982, 2: Galan J M, Moreau V, André B, et al. Ubiquitination mediated by the Npi1p/Rsp5p ubiquitin-protein ligase is required for endocytosis of the yeast uracil permease. J Biol Chem, 1996, 271: Séron K, Blondel M O, Haguenauer-Tsapis R, et al. Uracil-induced down regulation of the yeast uracil permease. J Bacteriol, 1999, 181: Amillis S, Hamari Z, Roumelioti K, et al. Regulation of expression and kinetic modeling of substrate interactions of a uracil transporter in Aspergillus nidulans. Mol Membr Biol, 2007, 24: Verri A, Mazzarello P, Biamonti G, et al. The specific binding of nuclear proteins to the camp responsive element sequence is reduced by misincorporation of uracil and increased be the deamination of cytosine. Nucleic Acids Res, 1990, 18: Miller B, Miller K, Timberlake W. Direct and indirect gene replacements in Aspergillus nidulans. Mol Cell Biol, 1985, 5: Calvo A M, Bok J, Brooks W, et al. VeA is required for toxin and sclerotial production in Aspergillus parasiticus. Appl Environ Microbiol, 2004, 70: Käfer E. Meiotic and mitotic recombination in Aspergillus and its chromosomal aberrations. Adv Genet, 1977, 19: Ruijter G J G, Visser J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. J Microbiol Methods, 1996, 25: Nielsen K, Høgh A L, Emmersen J. DeepSAGE-digital transcriptomics with high sensitivity, simple experimental protocol and multiplexing of samples. Nucleic Acids Res, 2006, 34: e

10 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 22 Sun X Y, Zhang H X, Zhang Z Y, et al. Involvement of a helix-loop-helix transcription factor CHC-1 in CO 2 -mediated conidiation suppression in Neurospora crassa. Fungal Genet Biol, 2011, 48: Audic S, Claverie J M. The significance of digital gene expression profiles. Genome Res, 1997, 7: Benjamini Y, Drai D, Elmer G, et al. Controlling the false discovery rate in behavior genetics research. Behav Brain Res, 2001, 125: Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2 - Ct method. Methods, 2001, 25: Vogels G D, van der Drift C. Degradation of purines and pyrimidines by microorganisms. Bacteriol Rev, 1976, 40: Andersen G, Björnberg O, Polakova S, et al. A second pathway to degrade pyrimidine nucleic acid precursors in eukaryotes. J Mol Biol, 2008, 380: Hunsucker S A, Mitchell B S, Spychala J. The 5 -nucleotidases as regulators of nucleotide and drug metabolism. Pharmacol Ther, 2005, 107: Hamari Z, Amillis S, Drevet C, et al. Convergent evolution and orphan genes in the Fur4p-like family and characterization of a general nucleoside transporter in Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 2009, 73: Han K H, Kim J H, Moon H, et al. The Aspergillus nidulans esdc (early sexual development) gene is necessary for sexual development and is controlled by vea and a heterotrimeric G protein. Fungal Genet Biol, 2008, 45: Vienken K, Fischer R. The Zn(Ⅱ)2Cys6 putative transcription factor NosA controls fruiting body formation in Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 2006, 61: Lara-Ortíz T, Riveros-Rosas H, Aguirre J. Reactive oxygen species generated by microbial NADPH oxidase NoxA regulate sexual development in Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 2003, 50: Baidya S, Cary J W, Grayburn W S, et al. Role of nitric oxide and flavohemoglobin homolog genes in Aspergillus nidulans sexual development and mycotoxin production. Appl Environ Microbiol, 2011, 77: Li S, Bao D, Yuen G, et al. BasA regulates cell wall organization and asexual/sexual sporulation ratio in Aspergillus nidulans. Genet, 2007, 176:

11 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 : 1 ~ 42 SCIENTIA SINICA Vitae life.scichina.com SCIENCE CHINA PRESS 论文 附录 a Funcat 编号 附表 1 差异转录基因的功能聚类及富集分析 (4 尿嘧啶, pyrg89/wt) a) b 鉴定的基因差异转录的基因 P- 值 FDR b b 重要性 a Funcat 名称 TRUE 含碳组分及糖类代谢 TRUE 转运化合物 ( 底物 ) TRUE 病害 毒性及防卫反应 FALSE 氨基酸代谢 FALSE 氮 硫和硒代谢 FALSE 核苷酸 核苷和碱基代谢 FALSE 脂类 脂肪酸和类异戊二烯代谢 FALSE 次级代谢 FALSE 发酵 FALSE DNA 加工 FALSE 细胞循环 FALSE RNA 合成 FALSE RNA 加工 FALSE RNA 修饰 FALSE 蛋白质修饰 FALSE 蛋白 / 多肽降解 FALSE 调控靶标, 蛋白活性调控 FALSE 转运工具 FALSE 转运通路 FALSE 细胞及胞内信号传导 FALSE 转膜信号传导 FALSE 解毒作用 FALSE 体内离子平衡 FALSE 细胞对外界刺激的感应和响应 FALSE 真菌特异性系统感应和响应 FALSE 细胞生长和形态建成 FALSE 细胞分化 FALSE 细胞死亡 FALSE 真菌 / 微生物发育 FALSE 真菌 / 微生物细胞类型分化 a) a: 差异表达基因的功能聚类采用 Blast 软件 (ver ) 比对 FunCat 数据库获得 ( b: 运用 R 统计软件 ( 采用超几何测试算法 (P 0.01 和 FDR 0.1 作为阈值 ) 进行基因富集分析

12 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 2 a 基因 TPM b - WT-4 尿嘧啶 TPM-pyrG89-4 尿嘧啶 a) 附表 2 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 突变体与野生菌株差异转录的基因 log2 比值 (pyrg89/wt) P- 值 FDR Blast 比对基因非冗余库 ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [Aspergillus nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-126/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: xenobiotic compound monooxygenase, DszA family (AFU_orthologue; AFUA_3G15040) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-141/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-142/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-12 ANID_ E E-11 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-09 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-09 gi ref XP_ / e-38/predicted protein [A. terreus NIH2624] ANID_ E E-09 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC E E-08 ANID_ gi ref XP_ / e-141/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-08 ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-08 gi ref XP_ / e-49/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/NIMA_EMENI G2-specific protein kinase NIMA (Never E E-07 in mitosis) [A. nidulans ANID_ E E-06 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-151/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-06 ANID_ gi sp Q5AQY2.2 GMT2_EMENI/ e-155/RecName: Full=GDP-mannose E E-06 transporter 2; Short=GMT 2 ANID_ E E-06 gi emb CAK / e-136/prolyl aminopeptidase papa-a. niger ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: MFS transporter, putative (AFU_orthologue; AFUA_1G13970) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-153/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-05 ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC E E-05 ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-74/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /8.2858e-159/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /6.5464e-168/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-127/hypothetical protein AN [A. nidulans 2.28E E-05 ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi tpe CBF / e-160/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-51/cytosine deaminase, putative [A. flavus NRRL3357] ANID_ gi ref XP_ / e-157/hypothetical protein AN [A. nidulans 2.28E E-05 ANID_ E gi ref XP_ / e-67/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ / e-154/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ / e-155/STCO_EMENI Putative sterigmatocystin biosynthesis protein stco [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: ABC multidrug transporter (Eurofung) [A. nidulans E ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: DNA replication ATPase (Eurofung) [A. nidulans E ANID_ E gi tpe CBF / e-141/TPA: hypothetical protein ANIA_11209 [A.

13 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-164/hypothetical protein AN [A. nidulans E ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC E ANID_ E gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ /2.1815e-145/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-82/hypothetical protein AOR_1_ [A oryzae RIB40] ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-93/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-16/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-16/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: Putative Zn(II)2Cys6 transcription factor (Eurofung) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-143/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF / e-112/TPA: 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, putative (AFU_orthologue; AFUA_3G00290) [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: HET domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G03140) [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: ATP-dependent DNA helicase II subunit 1 (EC )(ATP-dependent DNA helicase II subunit Ku70) [Source:UniProtKB/Swiss-Prot;Acc:Q5AVC7] [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-70/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-122/hypothetical protein AN [A. nidulans 9.82E E-07 ANID_ gi ref XP_ / e-152/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-170/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-10 ANID_ gi ref XP_ / e-142/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-152/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-13 ANID_ E gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF / e-174/TPA: dihydrodipicolinate synthetase family E E-08 protein (AFU_orthologue; AFUA_3G11920) [A. nidulans ANID_ E E-12 gi dbj BAB /0/alpha-glucosidase B [Emericella nidulans] ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-44/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-129/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-06 gi ref XP_ / e-80/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ / e-115/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ /5.6803e-82/hypothetical protein TSTA_ [Talaromyces stipitatus ATCC 10500] ANID_ E E-12 gi gb AAM / e-84/ESDC [Emericella nidulans] ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: alpha glucosidase II, alpha subunit, putative (AFU_orthologue; AFUA_5G03500) [A. nidulans ANID_ E-05 gi ref XP_ / e-17/predicted protein [Ajellomyces capsulatus NAm1] ANID_ gi ref XP_ / e-173/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-51/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-11 gi tpe CBF / e-112/TPA: GrpB domain protein (AFU_orthologue; AFUA_1G01530) [A. nidulans 3

14 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: Putative Zn(II)2Cys6 transcription factor (Eurofung) [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: DIL and Ankyrin domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G12450) [A. nidulans ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: Putative Zn(II)2Cys6 transcription factor (Eurofung) [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi gb EDP /1.2018e-158/oxidoreductase, FAD-binding, putative [A. fumigatus A1163] ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: Hsp70 family protein (AFU_orthologue; AFUA_4G14040) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ / e-20/hypothetical protein ANI_1_ [A. niger CBS ] ANID_ E gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF / e-108/TPA: ketoreductase (AFU_orthologue; AFUA_2G10280) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/transporter protein smf2 [Neosartorya fischeri NRRL ] ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC E E-05 ANID_ E E-06 gi tpe CBF /0/TPA: dynamin GTPase, putative (AFU_orthologue; AFUA_6G11890) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-07 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein NFIA_ [N. fischeri NRRL 181] ANID_ E gi tpe CBF / e-32/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi tpe CBF / e-27/TPA: hypothetical protein ANIA_11510 [A. nidulans ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi gb AAL /0/polymerase zeta subunit [Emericella nidulans] ANID_ E E-08 gi tpe CBF /0/TPA: ABC transporter protein [Source:UniProtKB/TrEMBL;Acc:Q96VK5] [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: F-box domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G12050) [A. nidulans ANID_ E E-07 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-127/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-10 ANID_ gi tpe CBF / e-114/TPA: hypothetical protein ANIA_00723 [A E E-05 nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: Putative Zn(II)2Cys6 transcription factor (Eurofung) [A. nidulans ANID_ E E-12 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-07 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ / e-79/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: GABA transporter, putative (Eurofung) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-152/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-05 ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/2,3-cyclic-nucleotide 2-phosphodiesterase [N. fischeri NRRL 181] ANID_ E E-09 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-10 gi ref XP_ / e-52/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-06 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-113/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-07 ANID_ E E-11 gi tpe CBF / e-90/TPA: ankyrin repeat protein (AFU_orthologue; AFUA_1G06370) [A. nidulans ANID_ E E-12 gi tpe CBF / e-134/TPA: 4-nitrophenylphosphatase (AFU_orthologue; AFUA_3G08310) [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: small oligopeptide transporter, OPT family (AFU_orthologue; AFUA_6G10220) [A. nidulans 4

15 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 5 期 ANID_ E E-06 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-06 gi gb AAK AF349513_1/0/general amidase-b [Emericella nidulans] ANID_ E E-05 gi emb CAK /0/unnamed protein product [A. niger] ANID_ gi ref XP_ / e-170/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-05 ANID_ gi ref XP_ / e-107/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-05 ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC E E-13 ANID_ E gi ref XP_ /3.2032e-119/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans gi tpe CBF /0/TPA: oxidoreductase, acting on the CH-OH group of ANID_ donors, NAD or NADP as acceptor (AFU_orthologue; AFUA_5G10280) [A. nidulans ANID_ E E-09 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-09 gi ref XP_ / e-56/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-85/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-136/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-05 ANID_ E E-06 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-170/hypothetical protein AN [A. nidulans 1.05E E-05 ANID_ E gi gb EDP / e-86/oxidoreductase, short chain dehydrogenase/reductase family [A. fumigatus A1163] ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-86/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF / e-125/TPA: DUF218 domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G14300) [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ /0/RSC complex subunit Sfh1, putative [A. clavatus NRRL 1] ANID_ E E-10 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-06 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-13 gi tpe CBF /0/TPA: protein phosphotase 2a 65kd regulatory sububit (AFU_orthologue; AFUA_1G05610) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-158/hypothetical protein AN [A. nidulans E ANID_ E E-08 gi tpe CBF /0/TPA: ribonuclease HI large subunit (AFU_orthologue; AFUA_1G07600) [A. nidulans ANID_ E E-06 gi ref XP_ / e-75/Pc16g13150 [Penicillium chrysogenum Wisconsin ] ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: NACHT domain protein (AFU_orthologue; AFUA_2G01760) [A. nidulans ANID_ E E-05 gi gb ABF /0/alpha-glucosidase [Emericella nidulans] ANID_ gi ref XP_ / e-177/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF / e-146/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-11 gi gb AAN /0/NADPH oxidase [Emericella nidulans] ANID_ E E-12 gi tpe CBF /0/TPA: Fatty acid synthase, alpha subunit [Source:UniProtKB/TrEMBL;Acc:P78615] [A. nidulans ANID_ E E-06 gi tpe CBF / e-85/TPA: PaaI_thioesterase family protein, putative (AFU_orthologue; AFUA_4G04355) [A. nidulans ANID_ E E-13 gi tpe CBF / e-75/TPA: allergenic cerato-platanin Asp F13 (AFU_orthologue; AFUA_2G12630) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-140/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-07 ANID_ E E-13 gi tpe CBF / e-157/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-175/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-06 ANID_ gi sp Q5BG98.1 MCR1_EMENI/ e-165/RecName: 5

16 孙宪昀等 : 过量尿嘧啶胁迫下 pyrg 对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用 Full=NADH-cytochrome b5 reductase 2; AltName: Full=Mitochondrial cytochrome b reductase ANID_ E E-08 gi tpe CBF / e-136/TPA: class II aldolase/adducin domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G01330) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-85/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-116/hypothetical protein AN [A. nidulans E E-05 ANID_ E E-12 gi tpe CBF / e-66/TPA: 60S ribosomal protein L13 (AFU_orthologue; AFUA_4G04460) [A. nidulans ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: NACHT and Ankyrin domain protein (AFU_orthologue; AFUA_6G07030) [A. nidulans ANID_ E E-06 gi tpe CBF /0/TPA: LRP16 family protein (AFU_orthologue; AFUA_3G13850) [A. nidulans ANID_ E E-14 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-14 gi tpe CBF /0/TPA: phosphatidyl synthase (AFU_orthologue; AFUA_3G12330) [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF / e-153/TPA: C2H2 finger domain protein, putative E E-07 (AFU_orthologue; AFUA_8G04290) [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: DNA polymerase gamma (AFU_orthologue; AFUA_5G12640) [A. nidulans ANID_ E E-13 gi tpe CBF / e-100/TPA: DUF124 domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G08610) [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-24/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-13 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: PfkB family carbohydrate kinase (Mak32), putative (AFU_orthologue; AFUA_1G12750) [A. nidulans ANID_ ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-06 gi ref XP_ / e-72/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: conserved hypothetical protein [A. nidulans FGSC E ANID_ E E-13 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-08 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi tpe CBF /0/TPA: phosphate transport (Eurofung) [A. nidulans FGSC E E-12 ANID_ E E-05 gi emb CAJ /0/NosA protein [Emericella nidulans] ANID_ E E-05 gi tpe CBF /0/TPA: ABC1 domain protein (AFU_orthologue; AFUA_3G07620) [A. nidulans ANID_ E E-07 gi ref XP_ / e-47/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ / e-121/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-07 gi tpe CBF /0/TPA: vacuolar protein sorting protein, putative (AFU_orthologue; AFUA_8G02780) [A. nidulans gi sp P TREA_EMENI/0/RecName: Full=Acid trehalase; AltName: ANID_ E E-08 Full=Alpha,alpha-trehalase; AltName: Full=Alpha,alpha-trehalose glucohydrolase; Flags: Precursor ANID_ E E-09 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-07 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/Coatomer subunit beta, putative [A. flavus NRRL3357] ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: LPS glycosyltransferase, putative (AFU_orthologue; AFUA_8G00650) [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ / e-127/SET domain-containing protein, putative [A. flavus NRRL3357] ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-85/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-08 gi tpe CBF / e-157/TPA: 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase (AFU_orthologue; AFUA_1G10100) [A. nidulans ANID_ E gi tpe CBF /0/TPA: class V chitinase, putative (AFU_orthologue; AFUA_1G02800) [A. nidulans ANID_ E gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-12 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-05 gi ref XP_ / e-92/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans ANID_ E E-07 gi ref XP_ /0/hypothetical protein AN [A. nidulans 6