730 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): [1] 大疾病 CO 2 /HCO 3 体系在机体的酸碱平衡调控中起着重要作用 先来看一个简单的大家都非常熟悉的化学反应 :CO 2 + H 2 O H 2 CO

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1 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 综述 Na + /HCO 3 共转运体 NBCe1 的生理及病理学作用 刘颖 1,3, 卢群伟 2,3, 陈历明 1,3,* 1 华中科技大学生命科学与技术学院生物物理学及分子生理学系 ; 2 遗传与发育生物学系 ; 3 分子生物物理学教育部重点实验室, 武汉 摘要 : 维持机体的酸碱稳态对各项生理活动的有序进行具有根本性的意义, 酸碱紊乱会导致一系列疾病 碳酸氢根 (HCO 3 ) 是机体中最重要的酸碱缓冲离子 SLC4 家族的 HCO 3 跨膜转运体是机体最主要的 HCO 3 跨膜运输载体之一, 在细胞 的 ph 调控以及上皮细胞中 HCO 3 的吸收或分泌过程中起着非常重要的作用 SLC4 家族的 NBCe1(SLC4A4) 是一个生电型的 Na + /HCO 3 共转运体, 在各种组织中有着非常广泛的表达, 具有极其重要的生理学作用 在肾脏近端肾小管中,NBCe1 负责 80% 以上的 HCO 3 的重吸收, 对于维持机体全局的酸碱平衡极其重要 人类的 SLC4A4 突变常导致严重的近端肾小管性酸中毒, 且常伴有侏儒症 偏头疼 白内障 青光眼以及牙齿釉质发育异常等 本文对最近十多年来有关 NBCe1 的结构 - 功能关系 功能调控机制 NBCe1 的生理及病理学作用机理等方面的研究进展进行综述与分析 关键词 : 碳酸氢根转运体 ; 酸碱平衡调控 ; 肾小管 ; 偏头疼 ; 代谢性酸中毒 ;SLC4A4 中图分类号 :R Physiology and pathophysiology of Na + /HCO 3 cotransporter NBCe1 LIU Ying 1,3, LU Qun-Wei 2,3, CHEN Li-Ming 1,3,* 1 Department of Biophysics and Molecular Physiology; 2 Department of Genetics and Developmental Biology; 3 Key Laboratory of Molecular Biophysics of Ministry of Education, School of Life Science & Technology, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan , China Abstract: Na + /HCO 3 cotransporter NBCe1 is an electrogenic member of the solute carrier 4 (SLC4) family and plays important roles in intracellular ph regulation as well as transepithelial HCO 3 movement. The physiological and pathological significance of NBCe1 has been well established by genetic studies with humans as well as knock-out study with mouse. NBCe1 is expressed in diverse tissues in mammals. The transporter plays an essential role in the maintenance of acid-base homeostasis in our body, being responsible for more ~80% of HCO 3 reabsorption in the proximal renal tubule. In humans, a number of SLC4A4 mutations have been associated with proximal renal tubule acidosis that is often accompanied with short stature, ocular abnormalities (including cataract, glaucoma, and band keratopathy), migraine, and/or defects in dental enamel development. In the present article, we review the molecular physiology, the structure/function relationship, the mechanisms underlying the functional regulation of NBCe1, as well as the physiological and pathological roles of the transporter. Key words: bicarbonate transporter; acid-base balance; renal tubule; migraine; metabolic acidosis; SLC4A4 1 ph 调控及 SLC4 家族 ph 几乎影响着细胞内外的一切生物学过程 维持机体的酸碱稳态 (acid-base homeostasis) 具有特 别重要的意义, 机体酸碱平衡紊乱会导致一系列重 Received Accepted This review was supported by the National Natural Science Foundation of China (No , ) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities, Ministry of Education, China (No. HUST: 2011TS099). * Corresponding author. Tel: ; liming.chen@hust.edu.cn

2 730 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): [1] 大疾病 CO 2 /HCO 3 体系在机体的酸碱平衡调控中起着重要作用 先来看一个简单的大家都非常熟悉的化学反应 :CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO 3 该反应平衡的第一步, 即 CO 2 与 H 2 O 结合生成 H 2 CO 3 的过程是一个慢反应 在机体内这个反应受到碳酸酐 [2] 酶 (carbonic anhydrase) 的催化 CO 2 /HCO 3 是机体内最主要的 ph 缓冲体系, 在血液中贡献了 65% 以上的酸碱缓冲能力, 机体中体液的 ph 主要取决 [3] 于 CO 2 与 HCO 3 之间的平衡 如果因呼吸系统功能异常而导致 CO 2 浓度过高, 会引起呼吸性酸中毒 (respiratory acidosis) ; 而肾脏重吸收功能异常而 导致 HCO 3 浓度过低, 则引起代谢性酸中毒 (metabolic acidosis), 后文将会进行详细的讨论 因此,HCO 3 跨膜运输对于维持我们机体的酸 碱平衡起着非常关键的作用 HCO 3 转运体主要分布在 SLC4 和 SLC26 两个基因家族中, 这些离子转 运体在胞内 ph 调控以及上皮组织中 HCO 3 离子的 [47] 吸收或分泌中起着极其重要的作用 ( 参见综述 ) 其中,SLC4 家族有 10 个基因成员 (SLC4A15 和 SLC4A711), 这些基因的表达产物包括 :(1) 三个 Na + 非依赖的阴离子交换体 AE13(SLC4A13) ; (2) 五个 Na + 依赖的碳酸氢根转运体 (Na + -coupled HCO 3 transporters, 简称 NCBTs), 其中两个生电性的 NBCe1(SLC4A4) 和 NBCe2(SLC4A5), 三个电中性的 NBCn1 (SLC4A7) NBCn2 ( 也叫 NCBE ;SLC4A10) 以及 Na + -driven Cl-HCO 3 exchanger (SLC4A8) ;(3) 一个 Na + 依赖的硼酸根转运体 (SLC4A11) SLC4A9 也是一个 HCO 3 转运载体, 但是其对 Na + 的依赖性目前还存在争议 [5] 有关 SLC4 家族的概况, 可以参见 Alper 等 ( 关 [4] 于阴离子交换体 ) 及 Boron 等 ( 关于 NCBT) 最新发表的综述 本文将主要对 NBCe1 相关的最新研究进展进行综述与分析 回顾 NBCe1 发现与克隆的历史, 然后讨论 NBCe1 结构与功能关系 功能调控机制以及 NBCe1 的生理及病理学作用机理等 2 NBCe1 的发现与克隆 NBCe1 首先是在肾小管中发现的 1983 年,Boron 和 Boulpaep [8] 以蝾螈 (Salamander) 的肾小管为实验材料, 通过电生理学技术, 在肾小管上皮细胞中发现了一种离子跨膜转运活性, 这种离子转运活性具 有如下四个特性 :HCO 3 依赖性,Na + 依赖性, 对 DIDS (4,4-diisothiocyanatostilbene-2,2-disulfonic acid) 的敏感性, 并且会引起膜电位变化 ( 生电性 ) [9] 1997 年,Romero 等成功地从蝾螈的肾小管中克隆了 NBCe1 的 cdna 他们将这种 cdna 在非洲爪蟾卵母细胞中进行异源表达, 然后通过电生理学技术研究了其表达产物的生物物理学特性 他们的结果表明, 这种 cdna 表达产物的生理学特性 与 Boron 等在肾小管上皮细胞中观察到的 HCO 3 离 子转运活性完全一致 : 具有 HCO 3 依赖性,Na + 依赖性, 对 DIDS 敏感, 引起膜电位的变化 这样, Romero 等首次从分子水平证实了 NBCe1 的存在, 这也是成功克隆的第一个 NCBT 的 cdna Romero 等关于 NBCe1 cdna 的成功克隆, 极大地促进了其它 NCBT 基因的 cdna 克隆 此后, 大量 NCBT 的 cdna 陆续被克隆出来, 极大地促进 [4] 了 NCBT 相关的分子生理学研究的发展 3 NBCe1 的剪接异构体如图 1A 所示, 编码 NBCe1 的基因 SLC4A4 含有 26 个外显子, 包括两个不同的转录启动子 ( 分别位于第 1 和第 4 号外显子 ), 可以分别表达出两种不同的氨基末端 (Nt) [10] 此外,SLC4A4 的第 25 [11] 号外显子可以发生选择性剪接 第 25 号外显子含有一个终止密码子, 它的选择性剪接产生两种不 [12] 同的羧基末端 (Ct) 最近 Liu 等发现,SLC4A4 的第 6 号外显子也可以发生选择性剪接, 并发现了两种新的 SLC4A4 的转录子, 这两种转录子缺失了一段 27 个核苷酸的序列, 即 Cassette I 基于这三种可能的变化, 即两种不同的 Nt Cassette I 的有无和两种不同的 Ct, 理论上 SLC4A4 可以产生 8 种不同的表达产物形式 ( 剪接体 ) 目前已经克隆了五种不同的 NBCe1 剪接体, 我们分别将其记为 NBCe1-A 至 -E ( 图 1B) 在这五种剪接体中,NBCe1-A/B/D/E 的 mrna 都含有第 25 号外显子, 因而它们的 Ct 较短 ;NBCe1-C 的 mrna 不含第 25 号外显子, 其 Ct 较长 NBCe1-A/B/C 均含有 Cassette I, 而 NBCe1-D/E 不含 Cassette I 与其它剪接体比较, 在组织中, 不含 Cassette I 的 NBCe1-D/E 的相对表达水平 (mrna) 非常低, 提示这两种剪接 [12] 体可能只在某些特化的细胞中有表达 NBCe1 剪接体一级结构上的差别至少具有三个方面的重要生物学意义 :(1) 不同 NBCe1 剪接体的表达具有很高的组织特异性 ;(2) 一级结构的差异

3 刘颖等 :Na + /HCO 3 共转运体 NBCe1 731 图 1. SLC4A4 基因结构及 NBCe1 剪接体一级结构示意图 Fig. 1. Structure of SLC4A4 gene and diagrams of NBCe1 variants. A: Structure of SLC4A4 gene. SLC4A4 contains 26 exons and two promoters, i.e., exon 1 and exon 4 (indicated by * ). Exon 25 containing a stop codon can be alternatively spliced, resulting in the expression of two alternative Ct. B: Diagrams of the five known NBCe1 variants. The numbers indicate the length of the unique portions of the Nt and Ct. The alphabetic order of NBCe1 variants indicates the order of cloning. The vertical dashed lines indicate the boundary between the putative Nt and transmembrane domain (TMD) (encoded in exon 12) and that between TMD and Ct (encoded in exon 23). NBCe1-B/C/E are transcribed utilizing the promoter upstream of exon 1, whereas NBCe1-A/D are transcribed utilizing the promoter upstream of exon 4. NBCe1-D/E lack cassette I due to splicing out the last 27-nucleotides at the 3 end of exon 6. Among all the five variants, only NBCe1-C contains the unique long Ct due to omission of exon 25. The unique Nt of NBCe1-B/C/E contains a IRBIT-binding site, whereas the unique Ct of NBCe1-C contains a PDZ-binding motif. The diagrams of the SLC4A4 gene and NBCe1 variants are drawn to scale. 影响 NBCe1 剪接体内在的生物学活性 ;(3) 一级结构上的差异影响 NBCe1 转运体的蛋白相互作用及功能调控机制 下面分别从这个三个方面来进行阐述 3.1 NBCe1 剪接体表达的组织特异性 NBCe1 在许多不同组织中具有非常广泛的表 [9] [13, 14] [15, 16] 达, 包括肾小管 胰腺导管 成釉质细胞 [17] [18] [19] 心肌 骨骼肌 中枢神经系统 眼组织 ( 包括角膜 睫状体 视网膜 眼结膜 ) [20] 食管黏膜 [21] [22] 下腺 腮腺腺泡细胞 消化道组织 ( 包括十二 [23] [24] [25] 指肠 小肠上皮细胞 直肠上皮细胞 ) 雄性及雌性生殖道组织 ( 包括雄性生殖道组织睾丸 附睾和输精管, 及雌性生殖道组织子宫内膜和输卵管上皮组织 ) [12, 26] 等 研究表明 NBCe1 不同剪接体的表达有很高的组织特异性 NBCe1-A 表达在近端肾小管上皮细胞 [8, 9] 的基底膜中 肾小管上皮细胞起着吸收 HCO 3 的作用,NBCe1-A 按 1:3 的比例将 Na + 和 HCO 3 从上皮细胞中转运至组织间隙, 其离子转运方向是向 [8, 9, 27] 胞外的 而 NBCe1-B 主要表达在分泌 HCO 3 [13, 14] 的上皮细胞的基底膜, 比如胰导管上皮细胞 [16] [2325] 成釉质细胞 消化道上皮细胞 与肾小管上皮细胞相反, 在这些上皮细胞中,NBCe1-B 按 1:2 的比例将 Na + 和 HCO 3 从组织间隙转运至上皮细胞 中, 再通过顶膜的其它离子转运体将 HCO 3 分泌至管腔中 因此,NBCe1-B 在这些上皮细胞中的离子 转运方向是向内的, 促进 HCO 3 的分泌 注意, 目前研究的结果表明, 在这些上皮细胞中,NBCe1 无一例外地都分布于上皮细胞基底膜 研究表明 NBCe1-A/B 的 Ct 含有一个特异的信号肽, [28] 使 NBCe1 特异地定位于基底膜 此外, 心肌细胞中也表达 NBCe1-B [17] 在中枢系统中有 NBCe1-B 和 NBCe1-C 的表达, 但主要是 NBCe1-C [19] 在下文 NBCe1 在中枢神经系统中的作用 一节的讨论中, 我们会看到 NBCe1-B 与 NBCe1-C 在神经元和神经胶质细胞中也各有高度特异性的表达分布

4 732 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): NBCe1 剪接体的功能与活性比较 NBCe1 不同剪接体在一级结构上的差别, 可以 [29] 对其离子转运活性产生重要的影响 McAlear 等以非洲爪蟾卵母细胞为异源表达体系, 通过电压钳技术以及微电极测定胞内 ph 的技术比较了 NBCe1- A/B/C 三种剪接体的 HCO 3 转运活性, 结果表明 NBCe1-A 的活性约是 NBCe1-C 的 4 倍 他们进一步通过删除突变去掉 NBCe1-A 的 Nt 特异的氨基酸序列, 使其活性降低了约 50% ; 而去掉 NBCe1-C 的 Nt 特异的序列 (85 aa), 使其活性增加了约 2.7 倍 McAlear 等的研究结果表明 NBCe1-A 的 Nt 含有一个增强离子转运活性的结构域, 或者叫自激活结构域 (auto-stimulatory domain, ASD) ; 而 NBCe1-B/C 的 Nt 含有一个抑制离子转运活性的结构域, 或者叫自抑制结构域 (auto-inhibitory domain, AID) 以上这些研究表明 Nt 结构上的差异对不同 NBCe1 剪接体内在的生物学活性 (intrinsic activity) 有着重要影响 关于缺失 Cassette I 对 NBCe1 活性的影响, 目前尚不清楚 序列分析表明 Cassette I 含有一个可能的磷酸化位点, 表明 Cassette I 可能是 NBCe1 的 [12] 一个重要的功能调控位点 3.3 NBCe1 的功能调控机制 NCBT 是一个比较新的研究领域, 关于这些蛋白的功能调控网路, 目前依然所知很少 最近几年, 关于 NBCe1 的相互作用蛋白及功能调控机制的研究, 已经有了一些令人兴奋的进展 有意思的是, 在下面的讨论中我们会看到, 在不同组织中, 不同 NBCe1 剪接体分别受到不同的信号通路的调控 [30] Shirakabe 等发现,NBCe1-B 的活性受到 IRBIT 的调控 IRBIT 是一个 IP3 受体 内质网膜上的一种 Ca 2+ [31] 通道 结合蛋白 [inositol trisphosphate (IP3) receptor binding protein released with inositol trisphosphate] IRBIT 的结合可增强 NBCe1-B [30] 的活性 进一步研究显示,NBCe1-B 与 IRBIT 结合的特异性序列为其 Nt 起始部分的一段序列 (116 残基 ) [30, 32] 上文提到,NBCe1-B/C 的 Nt 有一个自抑制结 [32] 构域 (AID) 最近,Lee 等以非洲爪蟾卵母细胞为表达体系, 进一步研究了 IRBIT 调控 NBCe1 活性的机制 他们发现将 IRBIT 与 NBCe1-B 共表达, 或者通过突变删除 NBCe1-B 的 Nt 特异的那段序列 ( 其中包含 AID 结构域 ), 可以同等程度地增强转 运体的活性 然而,IRBIT 的作用位点和 NBCe1-B Nt 的 AID 并不重叠, 因为他们删除 NBCe1-B Nt 的 2~16 位的氨基酸残基序列后, 突变体仍然保留了 100% 的自我抑制能力, 但是 IRBIT 对该突变的活性没有任何增强效应 许多研究表明,IRBIT 在上皮细胞的离子转运 [33] 过程的调控中起着非常关键的作用 ( 参见综 [34] 述 ), 可以调控多种其它在上皮细胞的离子跨膜运输中起着重要作用的离子通道或离子转运体, 比如囊性纤维化跨膜电导调节体 (cystic fibrosis fransmembrane conductance regulator, CFTR) [35] 和 Na + /H + 交换体 3 (Na + /H + exchanger 3, NHE3) [36] [33] Yang 等通过研究认为,IRBIT 通过介导蛋白磷酸酶 (protein phosphatase 1, PP1) 对 NBCe1 及 CFTR 的去磷酸化作用, 从而上调 NBCe1-B 及 CFTR 在细胞膜上的 蛋白表达水平, 从而促进上皮细胞的 HCO 3 分泌过程 ; 而蛋白激酶 WNK (with no lysine) 和 SPAK (Ste20- related proline/alanine kinase) 途径则通过介导 NBCe1-B 和 CFTR 的磷酸化作用, 下调这些膜蛋白在细胞膜上的表达水平, 从而抑制上皮细胞的 HCO 3 分泌过程 在肾小管上皮细胞中,NBCe1-A 的功能调控途径则与 NBCe1-B 完全不一样 我们知道, 胰岛素对于肾小管的重吸收过程起着重要的调节作用, 其 [37] 作用靶点主要位于近端肾小管 ( 参见综述 ) Ruiz 等发现胰岛素可以刺激近端肾小管基底膜的 NBCe1 [38] 的活性 事实上, 胰岛素对近端肾小管多种其它离子转运体也具有刺激作用, 包括上皮细胞顶膜的 NHE3 基底膜的钠钾泵 (Na + -K + pump, 也叫 Na + - K + [37] -ATPase) 等 此外, 在近端肾小管上皮细胞中, Ang II 对 NBCe1 的活性具有增强效应, 而且 Ang II [39] 的作用依赖于 G 蛋白偶联的受体途径 4 NBCe1 结构与功能的关系 4.1 NBCe1 的拓扑结构目前依然没有任何 SLC4 家族成员的蛋白晶体结构的报道, 因此 SLC4 家族成员的结构功能研究依然受到很大限制 基于对 AE1(SLC4A1) 的拓扑 [40, 41] [42] 研究结果,Romero 等对 NCBT 的拓扑结构进行了预测, 认为 NCBT 的结构包括一个比较大的胞内 Nt 结构域 跨膜结构域 (transmembrane domain, TMD) 和一个较小的胞内 Ct 结构域 ( 参见图 2) 在 Romero 的模型中, 跨膜结构域 TMD 包括 14 次

5 刘颖等 :Na + /HCO 3 共转运体 NBCe1 733 跨膜区 (TM114), 其中 13 个 (TM112 和 TM14) 为跨膜的 alpha 螺旋, 而 TM13 为一个非 alpha 螺旋的跨膜结构 最近,Zhu 等通过半胱氨酸扫描突变技术对 NBCe1 的拓扑结构进行进一步研究, 并提出了新的 [43] NBCe1 的拓扑模型 在这个新的模型中,NBCe1 的跨膜结构域 TMD 也有 14 个跨膜区, 这 14 个跨膜区均为 alpha 螺旋结构 比较 Zhu 等的模型及 Romero 等的模型, 可以发现他们对于 TM1TM9 的确定是基本一致的, 这两个模型的主要差别在于 TM10TM14 部分序列的确定 前面已经提到了 NBCe1 具有对 DIDS 敏感的特性 NBCe1 的 TM5 胞外末端有一个 KKMIK 序列, 研究表明这个富含正电荷的序列是抑制剂 [44] DIDS 的结合位点 4.2 决定 NBCe1 生电性的结构基础离子共转运体有一个非常重要的生物物理学特性, 就是阴离子与阳离子共转运的比例, 我们将其称为离子化学计量比 (ion stoichiometry) 共转运体的离子化学计量比具有非常重要的生物学意义, 离 子化学计量比决定离子转运活动对膜电位的影响, 甚至影响离子转运的方向是向胞内还是向胞外 NCBT 包括生电性的 NBCe1 和 NBCe2, 以及电中性的 NBCn1 NBCn2 和 NDCBE 决定这些蛋白的转运模式为生电性或者是电中性的结构基础是什么呢? 阐明这个问题对于认识 NCBT 离子转运 [45] 的分子机制是非常重要的 Choi 等通过构建大鼠 NBCe1-A 和 NBCn1 的杂合体并研究其电生理学特性后发现, 决定 NBCe1 生电性的结构元件在跨 [46] 膜区 TMD, 而与其 Nt 和 Ct 无关 Chen 等通过进一步研究后发现,NBCe1 的第四个胞外环 (4 th extracellular loop, EL4) 是决定其离子转运模式为生电性的关键结构元件 他们用 NBCn1 的 EL4 替换 NBCe1 相对应的序列, 可以将 NBCe1 转变为电中性的 ; 反之, 用 NBCe1 的 EL4 替换 NBCn1 相应的序列, 可以将一个电中性的 NBCe1/n1 的杂合体转化为生电性的 NCBT [47] Chen 等进一步的研究表明,NBCe1 的 TM6 和 TM12 在结构上很可能具有密切的相互作用, 形成一个功能模块, 这个模块包含有使转运体蛋白有 图 2. 预测的 NBCe1 拓扑结构示意图 Fig. 2. The putative topology model of NBCe1. The model shown here is based upon the topology proposed by Romero et al [42]. NBCe1-A/D contain a unique short Nt, and NBCe1-C contains a unique long Ct. The extreme Nt of NBCe1-B/C/E can interact with IRBIT, an inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) receptor-binding protein released with IP3. The extreme Ct of NBCe1-C contains an ETTL motif, enabling the transporter to interact with PDZ-scaffold proteins. The blue box represents cassette I that is omitted in NBCe1-D/E [12]. At the extracellular end of TM5 is the KKMIK motif, which is the binding site of inhibitor DIDS [44]. The fourth extracellular loop (EL4) plays a critical role in determining the electrogenicity of NBCe1 [46]. The orange circles indicate the three potential N-glycosylation sites in the third extracellular loop (EL3) [89]. The purple circles indicate the mutations identified in SLC4A4 that are associated with a series of severe pathophysiological conditions in human (see Table 1).

6 734 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 效地表达至细胞膜上的重要结构信息 5 NBCe1 的生理及病理学作用 5.1 NBCe1 在中枢神经系统中的作用酸碱平衡对神经元的兴奋性具有很重要的影响,pH 调控对于维持中枢神经系统的正常生理功能具有极其重要的意义, 酸碱稳态失衡会导致神经 [1, 48] 系统的功能紊乱 ( 参见综述 ) 神经系统微环境与神经元的活动具有复杂的关系, 一方面, 神经元细胞内外微环境的 ph 可影响离子通道的激活 ( 很多离子通道是 ph 敏感的 ) 及神经递质的释放, 从而影响神经元的兴奋性 ; 另一方面, 神经细胞的活动 包括神经递质的释放 神经递质受体 ( 如 GABA 受体及 Glycine 受体 ) 的活动 也会对胞内外微环境的 ph 产生影响 有关这方面的深入讨 [1, 48] 论, 可参见综述 NCBT 在中枢系统具有重要作用, 关于各种 NCBT 在中枢系统中表达 分布及其作用,Majumdar 和 Bevensee 最近进行了非常全面的总结, 详情 [49] 可参阅他们的综述 这里就有关 NBCe1 在中枢系统中作用的研究进展进行综述 NBCe1 在中枢神经系统中具有非常丰富的表达 原位杂交显示 NBCe1 的 mnra 在整个中枢系统中均有广泛的表达, 在以下这些区域的表达尤其很强 : 包括海马 大脑嗅球 小脑 纹状体 (striatum) [50] [19] 上丘 (superior colliculus) 等 Majumdar 等对 NBCe1 不同剪接体在大鼠中枢系统中的特异性表达分布进行了研究 他们利用针对 NBCe1-A/B/D/E 的 Ct 特异的抗体进行免疫荧光染色, 得到的信号主要分布在神经元细胞中, 而利用针对 NBCe1-C 的 Ct 特异的抗体进行免疫荧光实验, 得到的信号主要分布在神经胶质细胞中 进一步结合利用剪接体特异的探针进行原位杂交所获得的结果,Majumdar 等得出结论, 认为在大鼠的中枢系统中, [19] NBCe1-B 和 NBCe1-C 是主要表达的剪接体,NBCe1- B 主要分布在神经元中, 而 NBCe1-C 表达在神经胶质细胞中 因此,NBCe1 不同剪接体在中枢系统中的表达具有细胞特异性 NBCe1 在中枢系统中具有重要生理学作用 人类遗传学研究发现多个 SLC4A4 突变都与偏头疼有 [51] 关 ( 表 1) Suzuki 等发现这些 NBCe1 的突变都有一个共同特点 : 这些突变均可影响 NBCe1 在细胞中的分选与膜定位 他们将这些 NBCe1 突变体 在神经胶质瘤细胞中进行表达, 结果发现这些突变体 NBCe1 均分布在细胞质中而不能准确定位至细胞膜 上文提到了 NBCe1 在多种眼组织 ( 包括视网膜 ) 中具有表达 人类的 SLC4A4 基因突变可以对视觉功能产生严重的影响 在目前发现的多种 SLC4A4 突变中, 绝大部分患者都表现出白内障 青光眼等疾病 ( 表 1) 5.2 NBCe1 与心脏 ph 是一个非常重要的心血管系统功能的调节因素, 可影响心肌的收缩 兴奋以及电生理节律等 早在约 300 年以前, 牛顿发现用醋酸处理会使鳝鱼的心脏停止跳动 1880 年,Gaskell 发现用酸性溶 [1] 液灌流离体心肌, 会极大地降低心肌的收缩力 正常心肌的胞内 ph (ph i ) 约在 7.1~7.3 之间, 心律增加会导致 ph i 轻微下降 心肌缺血会引起 ph i 显著下降, 引起酸中毒 (acidosis), 酸中毒是导致心衰 [63, 64] 的重要原因 ph i 影响心肌功能的分子机制当然是多方面且非常复杂的, 至少其中之一与 troponin 有非常密切的关系 ph i 下降会促进心肌收缩 - 舒张的开关蛋白 troponin 亚单位 troponin C 的 Ca 2+ 结合部位的 H + -Ca 2+ 交换, 同时改变 troponin C 与另一个亚单位 troponin I 的相互作用, 从而降低心肌纤维对 Ca 2+ [6567] 的敏感性 心肌纤维对 Ca 2+ 敏感性的改变已被公认为是遗传性心肌病等严重心脏疾病的最主要 [68] 致病机制之一 心肌具有两种排酸 (acid extrusion) 机制 : 钠氢 [69] 交换体 (NHE) 和 NCBT 共转运体 利用向内的 Na + 梯度, 通过离子交换将胞内 H + 排出胞外 (NHE), 或者驱动 Na + 和 HCO 3 的内向共转运 (NCBT) NBCe1 和 NBCn1 在心肌中具有重要作用 在心肌肥大状态下,NBCe1 和 NBCn1 在心肌中的表 [70] 达上升 在大鼠中, 抑制 NBCe1 活性可以减少 [71] 心肌缺血对心肌造成的损伤 有意思的是,De Giusti 等发现血管紧张素 Ang II 可以增强心肌细胞中的 Na + [72] /HCO 3 共转运活性 而在随后的另一个研究中, 该研究组通过提高胞外 [K + ] 的策略研究生电性的 Na + /HCO 3 共转运活性, 结果表明 Ang II 可以抑制心肌细胞中生电性的 Na + /HCO 3 共转运活 [73] 性 综合这些研究, 在心肌细胞中 Ang II 似乎对生电性的 NBCe1 和电中性的 NBCn1 具有相反的调控效应 Ang II 调控心肌细胞中 NCBT 活性的分

7 刘颖等 :Na + /HCO 3 共转运体 NBCe1 735 表 1. 人类 SLC4A4 基因突变 表型及对 NBCe1 蛋白的影响 Table 1. Phenotypes and functional effects on NBCe1 of mutations in human SLC4A4 Mutation Phenotype Functional effects on NBCe1 Q 29 X Severe prta, [HCO 3 ] BL =9.4 a, ocular (G, no C/BK), MR b, SS [52]. Early termination of translation of NBCe1-A/D at codon 29 [52]. R 298 S Severe prta, [HCO 3 ] BL =8, SS, MR, ocular (C/G/BK) [53]. 40%55% active c in ECV304 and HEK293, LSE in C6 [51, 53]. S 427 L prta, [HCO 3 ] BL =11, SS, normal intelligence, dental defect, blind [54]. 10% active in XO [54]. T 485 S Severe prta, [HCO 3 ] BL =13, ocular (BK/C) [55]. 30% active in HEK293, surface expressed in C6 and MDCK, LSE in XO [51, 56]. G 486 R Severe prta, [HCO 3 ] BL =3, SS, ocular (C/BK, no G), LSE in XO, 40%50% active in normal intelligence [56]. HEK293 and ECV304, surface expressed in MDCK [51, 56]. R 510 H prta, [HCO 3 ] BL =5, SS, ocular (G/C/BK), MR, migraine [51, 53]. 55% active in ECV304, LSE in C6 [51, 53]. W 516 X prta, [HCO 3 ] BL =10, SS, ocular (C/G/BK), hypopotassemia, Early termination of translation in the front half muscle weakness, breath shortness [57]. of TMD. L 522 P prta, SS, ocular (C/G/BK), ataxia, migraine, dental defect, LSE in ECV304, MDCK, HEK293, and nephrocalcinosis [58]. XO [51, 56, 58]. Δ2311A prta, [HCO 3 ] BL =13.2, dental defects, osteopenia/bone Early termination in TMD, LSE in XO [59]. age delay, MR [59]. A 799 V Severe prta, [HCO 3 ] BL =6.3, SS, MR, ocular (C/G/BK), 35% active in HEK293, 10% active and Na + hypopotassemic paralysis, muscle weakness [55, 60]. leaking in XO [51, 61]. R 881 C Severe prta, [HCO 3 ] BL =10.6, SS, ocular (C/G), migraine [51, 55]. Fully active in XO, LSE in MDCK [51, 62]. Δ65bp Mild prta, [HCO 3 ] BL =17.3, normal intelligence, Early termination at NBCe1-C Ct, fully active ocular (C/G/BK), hemiplegic migraine [51]. in XO, LSE in HEK293 and C6 [51]. a [HCO 3 ] BL : blood HCO 3 concentration (in mmol/l), [HCO 3 ] BL is approximately 24 mmol/l under physiological conditions. b Abbreviations: prta: proximal renal tubular acidosis; XO: Xenopus oocyte; C6: glioma cell line C6; MDCK: Madin-Darby canine kidney cells; HEK293: human embryonic kidney cell line 293; EVC304: human endothelial cell line; SS: short stature; MR: mental retardation; LSE: loss of surface expresssion; ocular (C/BK/G): ocular abnormalities cataract, band keratopathy, and glaucoma; TMD: transmembrane domain. c Fractional activity of wild-type human NBCe1-A. 子机制还需要进一步深入研究 小鼠基因敲除研究 [74, 75] 及人类遗传学研究 [76] 表明 NBCn1 与高血压也有密切关联 NBCn1 缺失 的小鼠表现出轻微的高血压, 并降低了 NO 介导的 血管舒张效应 [74, 75] 5.3 NBCe1 与肾脏 肾脏是机体中极其重要的过滤与重吸收器官, 肾小管上皮细胞表达各种离子转运体, 负责将肾小 管腔中的有用成分, 比如 Na + K + HCO 3 以及葡 萄糖等通过重吸收作用回收到血液中 肾脏在维 持机体全局的酸碱平衡中具有特别重要的作用 我们知道, 细胞通过新陈代谢不断产生 CO 2,CO 2 必须通过呼吸作用及时排出体外, 以防止 CO 2 积累 导致酸中毒 同时, 机体通过肾脏重吸收作用将 HCO 3 回收, 保持机体 CO 2 /HCO 3 的平衡 近端肾小管 (proximal renal tubule) 是主要的 HCO 3 [3] 重吸收部位, 负责 85% 以上的 HCO 3 的重吸收 肾小管中的 HCO 3 与 H + 结合, 在碳酸酐酶的催化下生成 H 2 O 和 CO 2 CO 2 通过扩散进入肾小管上皮细胞, 在碳酸酐酶的催化下 CO 2 与 H 2 O 结合生成 H 2 CO 3, 再次转化为 H + 和 HCO 3 细胞中的 HCO 3 通过基底膜的 NBCe1-A 外排至组织间隙,H + 通过顶膜的 NHE3 进入肾小管腔 关于 NBCe1-A 在近端肾小管上皮细胞中的表达及其作用模式, 参见 NBCe1 剪接体表达的组织特异性 一节的讨论 NBCe1-A 是肾小管基底膜最主要的 HCO 3 外 排机制, 因而对于肾小管的 HCO 3 重吸收作用极其 [8, 9, 27] 重要 NBCe1 发生功能异常, 会导致严重的 HCO 3 重吸收障碍 参见表 1, 目前发现的许多 NBCe1 突变均导致严重的近端肾小管性酸中毒

8 736 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): (proximal renal tubule acidosis, 简称 prta) 这些 患者的血液中 HCO 3 浓度严重偏低, 导致血液的 ph 偏酸性 5.4 NBCe1 与胰腺胰腺的分泌液中含有非常丰富的 HCO 3, 这些 HCO 3 对维持胰液合适的 ph, 从而对于维持胰液中各种酶的活性非常重要 NBCe1( 具体地说是剪接体 NBCe1-B) 在胰腺导管上皮细胞中具有丰富的表达 NBCe1 分布于胰导管上皮细胞的基底膜 ( 参见 NBCe1 剪接体表达的组织特异性 一节中的相 关讨论 ), 在胰导管上皮细胞 HCO 3 的分泌过程中 [77] 起着重要作用 此外,NBCe1 在胰岛细胞以及 [78] 一种可以分泌胰岛素的细胞系中均有表达 用 NBCe1 的抑制剂 Tenidap 处理大鼠胰岛细胞, 可以 [77] 抑制胰岛素的分泌 这些研究提示 NBCe1 在胰岛细胞分泌胰岛素的过程具有重要作用 5.5 NBCe1 与牙釉质的形成牙釉质的主要成分是羟基磷灰石, 牙釉质的形成是一个复杂的生物矿化过程 (biomineralization) 牙齿发育过程中, 首先通过两层成釉质上皮细胞 (ameloblast) 形成一个空腔, 这些成釉质上皮细胞分泌成釉质液 (enamel fluid) 至该空腔中 成釉质液是一种过饱和的溶液, 釉质在这种过饱和的条件下逐渐结晶与沉积, 生成牙釉质 在这个反应过程中, 成釉质液的 ph 必须受到严格的控制 釉质形成的过程会释放 H +, 这些 H + 必须被及时中和, 否则过度酸化的釉质液会使釉质晶体溶解, 从而损害牙齿 [79] 的发育与形成 在牙釉质形成过程中的 ph 调控中,HCO 3 起着非常重要的作用 研究发现, 在成釉质上皮细胞 中有两种 HCO 3 转运体的表达 :NBCe1 (NBCe1-B) 和 AE2 (SLC4A2) [16] NBCe1-B 表达在成釉质上皮 细胞的基底膜, 负责将 HCO 3 转运至上皮细胞中, 然后顶膜的 AE2 再将 HCO 3 分泌至釉质液中 AE2 和 NBCe1 在牙釉质的生成过程都起着必不可少的作用 人类遗传学研究结果表明, 部分 SLC4A4 突变患者表现出牙齿发育异常 ( 表 1) 与人类遗传学研究结果一致,Slc4a4 基因敲除也导致小鼠的牙齿发育异常, 牙齿中的矿物成分显著下降, [15, 80, 81] 不能正常形成牙釉质 类似地,Slc4a2 基因 [82] 敲除亦导致小鼠牙齿发育异常 5.6 NBCe1 在生殖中的作用 ph 和 HCO 3 几乎影响着生殖中的所有过程, 包括精子的生成与成熟 精子获能 受精以及受精 [7, 83] 卵着床与胚胎早期发育等 ( 参见综述 ) 为了保证精子的正常发生 成熟与储存, 雄性生殖道腔内 必须维持低浓度 HCO 3 的状态以保持雄性生殖道腔中酸性的 ph 环境 成熟的精子储存于附睾中, 酸性环境可以使成熟精子处于一种所谓的静默状态 (quiescent status), 处于这种状态的精子运动能力很弱, 没有受精能力 精子进入雌性生殖道后, 必须经过一个活化过程, 才能获得受精的能力, 这个活化过程叫做精子获能 (sperm capacitation) [84, 85] HCO 3 是精子获能的必须因子, 具有激活精子特异的腺苷 [86] 酸环化酶 (sac) 的作用 在雌性生殖道中, 子宫及输卵管上皮细胞能够分泌高浓度的 HCO 3, 可保 [7] 证精子获能的顺利进行 免疫细胞荧光研究表明,NBCe1 在雄性大鼠附 [26] 睾的上皮细胞基底膜中具有丰富的表达 通过 [87] RT-PCR 等技术,Wang 等发现 NBCe1 在雌性生殖道组织中具有表达,NBCe1 在这里可能参与子宫 内膜上皮细胞 HCO 3 的分泌 Liu 等研究发现 NBCe1 在雄性生殖道及雌性生殖道组织中具有多种不同的表达形式, 提示 NBCe1 对于生殖道组织中起着复 [12] 杂的作用 除了 NBCe1 以外, 雄性及雌性生殖道上皮细胞中含有许多其它的酸碱离子跨膜转运体, 这一系列的离子转运体协同运作以维持生殖道腔中的 ph 稳态 关于生殖道上皮细胞酸碱离子跨 [7] 膜转运分子机制, 最新的综述对此进行了详细深入的讨论 在小鼠附睾中,NBCe1 的表达可能受到雌激素受体信号通路的调控 在小鼠中, 雌激素受体基因敲除极大地降低了附睾中 NBCe1 以及 NHE3 和碳酸酐酶 CA14 的蛋白表达水平 与正常小鼠相比, [88] 雌激素受体缺失的小鼠附睾液的 ph 显著升高 这些研究表明 NBCe1 等在附睾液的 ph 调控中起着重要作用 6 总结与展望过去十多年来, 人类遗传学研究及以小鼠为模型进行的基因敲除研究, 已充分证明了 NBCe1 的生理及病理学重要性 人们关于 NBCe1 结构与功能的研究取得了许多重要的进展, 这些研究为我们了解 NBCe1 离子转运的分子机制 NBCe1 的生理学作用及解释 NBCe1 的病理学机理奠定了基础 NBCe1 相关的功能调控网络应是今后研究的一

9 刘颖等 :Na + /HCO 3 共转运体 NBCe1 737 个重要方向 虽然目前这方面已经有了一些可喜的进展, 但是有关 NBCe1 的功能调控的信号传导通路, 以及 NBCe1 与其它离子转运体在功能上的联系, 在很大程度还是未知 不同 NBCe1 剪接体在不同组织或细胞中的生理学作用机制是什么? 它们的功能调控机制有何异同? 这些问题值得进一步予以研究阐明 此外,NBCe1 的三维结构还没有解析出来, 目前也没有任何 SLC4 家族其它成员的蛋白晶体结构 今后研究人员的一个非常紧迫的课题就是需要解析出 NBCe1 或者与其同源的 SLC4 家族其它蛋白的三维结构 NBCe1 蛋白三维结构的解析将大大促进人们对于 NBCe1 结构功能的关系及其离子转运分子机制的认识, 比如决定 NBCe1 转运的离子化学计量比的分子机理 Na + 和 HCO 3 协同转运的能量偶联机制等 随着 NBCe1 的生理及病理机制的逐步阐明, 应开展围绕 NBCe1 及其相关通路的靶向药物的研究与开发, 开展针对 NBCe1 相关的遗传疾病的干预和治疗, 以使基础研究的成果服务于人类健康 基于 NBCe1 的药物开发研究也有赖于对 NBCe1 结构功能关系的认识, 因此 NBCe1 三维晶体结构的解析将极大地促进针对 NBCe1 的靶向药物研究与开发 参考文献 1 Roos A, Boron WF. Intracellular ph. Physiol Rev 1981; 61: Boron WF. Evaluating the role of carbonic anhydrases in the transport of HCO 3 -related species. Biochim Biophys Acta 2010; 1804: Romero MF, Boron WF. Electrogenic Na + /HCO 3 cotransporters: cloning and physiology. Annu Rev Physiol 1999; 61: Boron WF, Chen L, Parker MD. Modular structure of sodium-coupled bicarbonate transporters. J Exp Biol 2009; 212: Alper SL. Molecular physiology and genetics of Na + -independent SLC4 anion exchangers. J Exp Biol 2009; 212: Sinđić A, Chang MH, Mount DB, Romero MF. Renal physiology of SLC26 anion exchangers. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: Liu Y, Wang DK, Chen LM. The physiology of bicarbonate transporters in mammalian reproduction. Biol Reprod 2012; 86: 99, Boron WF, Boulpaep EL. Intracellular ph regulation in the renal proximal tubule of the salamander: basolateral HCO 3 transport. J Gen Physiol 1983; 81: Romero MF, Hediger MA, Boulpaep EL, Boron WF. Expression cloning and characterization of a renal electrogenic Na + / HCO 3 cotransporter. Nature 1997; 387: Abuladze N, Song M, Pushkin A, Newman D, Lee I, Nicholas S, Kurtz I. Structural organization of the human NBC1 gene: knbc1 is transcribed from an alternative promoter in intron 3. Gene 2000; 251: Bevensee MO, Schmitt BM, Choi I, Romero MF, Boron WF. An electrogenic Na/HCO 3 cotransporter (NBC) with a novel C terminus, cloned from rat brain. Am J Physiol Cell Physiol 2000; 278: C1200C Liu Y, Xu JY, Wang DK, Wang L, Chen LM. Cloning and identification of two novel NBCe1 splice variants from mouse reproductive tract tissues: A comparative study of NCBT genes. Genomics 2011; 98: Marino CR, Jeanes V, Boron WF, Schmitt BM. Expression and distribution of the Na + -HCO 3 cotransporter in human pancreas. Am J Physiol 1999; 277: G487G Abuladze N, Lee I, Newman D, Hwang J, Boorer K, Pushkin A, Kurtz I. Molecular cloning, chromosomal localization, tissue distribution, and functional expression of the human pancreatic sodium bicarbonate cotransporter. J Biol Chem 1998; 273: Lacruz RS, Nanci A, White SN, Wen X, Wang H, Zalzal SF, Luong VQ, Schuetter VL, Conti PS, Kurtz I, Paine ML. The sodium bicarbonate cotransporter (NBCe1) is essential for normal development of mouse dentition. J Biol Chem 2010; 285: Paine ML, Snead ML, Wang HJ, Abuladze N, Pushkin A, Liu W, Kao LY, Wall SM, Kim YH, Kurtz I. Role of NBCe1 and AE2 in secretory ameloblasts. J Dent Res 2008; 87: Choi I, Romero MF, Khandoudi N, Bril A, Boron WF. Cloning and characterization of a human electrogenic Na + -HCO 3 cotransporter isoform (hhnbc). Am J Physiol 1999; 276: C576C Kristensen JM, Kristensen M, Juel C. Expression of Na + / HCO 3 co-transporter proteins (NBCs) in rat and human skeletal muscle. Acta Physiol Scand 2004; 182: Majumdar D, Maunsbach AB, Shacka JJ, Williams JB, Berger UV, Schultz KP, Harkins LE, Boron WF, Roth KA, Bevensee MO. Localization of electrogenic Na/bicarbonate cotransporter NBCe1 variants in rat brain. Neuroscience 2008; 155: Bok D, Schibler MJ, Pushkin A, Sassani P, Abuladze N, Naser Z, Kurtz I. Immunolocalization of electrogenic sodi-

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