2016,32(6) 许芳芳等 : 人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展 31 紊乱为特征, 包括 β 细胞功能下降, 外周胰岛素抵抗 (insulin resistance,ir) 等, 最终导致 β 细胞功能丧失或去分化 [1] 对于 II 型糖尿病高血糖的成因, 除了过去人们熟知的胰岛

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碗霈渡戚
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1 生物技术通报综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):30-37 人胰高血糖素样肽-1 的研究与应用进展许芳芳王楠李刚强刘德虎中国农业科学院生物技术研究所北京摘要糖尿病的成因非常复杂迄今为止人们仍没有找到根治糖尿病的有效方法尽管市面上销售和治疗糖尿病的化药不断涌现但这些化药在降糖的同时不可避免带来许多毒副作用同时也并不能延缓一些糖尿病并发症的发展人体自身分泌的胰高血糖素样肽 -1 GLP-1 是一种小分子的多肽长度仅有 30 个氨基酸它属于葡萄糖浓度依赖型的既可以特异性有效降低血糖浓度又不会产生任何不良反应加上 GLP-1 多重功效的发挥使其成为 II 型糖尿病治疗的一个研究热点要将 GLP-1 应用于临床亟待解决它在体内的半衰期非常短的难题因此综述国内外对 GLP-1 的研究探索与应用的最新进展情况旨在为研究人员和医务工作者在 GLP-1 相关药物研发上提供借鉴关键词糖尿病胰高血糖素样肽 -1 降血糖药物研发临床应用 DOI /j.cnki.biotech.bull Research and Application Progress on Human Glucagon-like Peptide-1 XU Fang-fang WANG Nan LI Gang-qiang LIU De-hu Institute of Biotechnology Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing Abstract: The cause of Diabetes mellitus is very complex so far the effective measures to completely cure diabetes have not been found yet. The chemical drugs for the treatment of diabetes in market continuously emerge and these drugs may lower the blood sugar but concurrently they will inevitably lead to many toxic side effects and cannot delay the development of diabetes complications. Human glucagon-likeppeptide -1 GLP-1 is a small polypeptide with 30 amino acids which is potent to reduce blood sugar in a glucose-dependent manner without any adverse reactions in addition to the multiple functions of GLP-1 it becomes a research hotspot in curing the diabetes II. However to realize its clinical application it is urgent to solve the problem of its short half-life in vivo. Hence the reviews of the latest progress on the research and clinical application of GLP-1 in China and abroad on the basis of previous studies will provide reference for the researchers and medical workers in the development of GLP-1 relevant drugs. Key words: Diabetes mellitus glucagon-like peptide-1 lowering blood sugar drug development clinical application 糖尿病现已经成为威胁全球人类健康和生活质万到 2035 年中国的糖尿病患病人数将达到 1.43 量的一个主要慢性疾病随着人们生活水平的提高亿仍然居于全球首位短短 20 年间增速高达和生活节奏的加快糖尿病发病人数也在快速增加 30% 此外糖尿病的成因非常复杂糖类代谢功据国际糖尿病联盟 IDF 2013 年 11 月统计全世能紊乱造成胰岛素的相对缺乏并导致糖尿病的发生界糖尿病在岁成人中的患病率为 8.3% 患者长期存在的高血糖能够导致各种组织特别是眼人数已达 3.82 亿预计 2035 年全球将有近 5.92 亿肾心脏血管及神经等产生慢性损害及功能障人患糖尿病中国 2013 年糖尿病的患病人数为 984 碍 90% 的糖尿病患者均属于Ⅱ型以相关的代谢收稿日期作者简介许芳芳女博士研究生研究方向植物分子生物学与基因工程 xffxff0924@163.com 通讯作者刘德虎男研究员研究方向基因工程及植物生物反应器 liudehu2006@126.com

2 2016,32(6) 许芳芳等 : 人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展 31 紊乱为特征, 包括 β 细胞功能下降, 外周胰岛素抵抗 (insulin resistance,ir) 等, 最终导致 β 细胞功能丧失或去分化 [1] 对于 II 型糖尿病高血糖的成因, 除了过去人们熟知的胰岛 β 细胞的分泌缺陷肝糖原输出增加肌肉组织葡萄糖摄取减少之外, 还有更多的组织器官参与了糖尿病的病理生理过程, 包括 :(1) 脂代谢紊乱 ;(2) 肠促胰素效应减弱 ;(3) 胰岛 α 细胞分泌胰高血糖素增多 ;(4) 肾小管对葡萄糖的重吸收增加 ;(5) 下丘脑对血糖的调控紊乱这八重奏揭示了 II 型糖尿病病理生理的复杂性, 也为临床用药带来了新的思考 [2] 当前,II 型糖尿病的治疗面临着 3 大挑战 :(1) 如何阻止 β 细胞功能的进行性减退在 II 型糖尿病 [3] 的发生发展过程中,β 细胞功能呈 5 个阶段进行性降低在这 5 个阶段中,β 细胞的数量形态和功能发生着演变 β 细胞功能性减退在 II 型糖尿病发生发展中起关键作用保护胰岛 β 细胞功能在 II 型糖尿病治疗中至关重要 (2) 如何解决治疗达标和低血糖之间的矛盾血糖治疗达标无疑是延缓和降低糖尿病大血管和微血管并发症的重要手段但随着血糖治疗达标率的提高, 低血糖的发生率也随之增加低血糖一直是糖尿病治疗中困扰医患的难题, 可能导致严重心脑血管意外乃至危及生命 [4] (3) 如何全面控制危险因素使糖尿病患者更多受益随着糖尿病治疗方案的日益优化, 糖尿病患者生存期逐渐延长, 由糖代谢异常所致的靶器官损害成为了影响患者预后的主要因素众所周知, 除糖代谢异常外, 还有很多危险因素与心脑血管事件独立相关, 包括超重高血压血脂异常等面对这些挑战, 人们一直在不断探索一种既可以保护 β 细胞功能, 又能在有效降糖的同时针对其他病理生理缺陷, 改善其他代谢紊乱, 甚至保护心血管的 II 型糖尿病治疗新思路胰高血糖素样肽 -1 自发现以来的研究及应用探索, 正反映了人们寻求糖尿病治疗新思路的这一趋势 1 GLP-1 的发现及结构特点继 1902 年,Bayliss 和 Starling 发现第一个胃肠多肽激素胰泌素 (Secretin) 后,1929 年, 我国学者冯德培侯祥川和林可胜教授在国际上率先发现并命名了肠抑胃素 (Enterogastrone) 同年,Zunz 等和 La Barre [5] 发现缺少该组分的肠分泌物具有升血糖效果, 于是 La Barre 首次引入了 incretin 这个词来描述这种可能具有促胰岛内分泌素分泌的物 [6] 质到了 20 世纪 60 年代,Mcintyre 等发现, 口服葡萄糖对胰岛素分泌的促进作用明显高于静脉注射葡萄糖, 这种额外的效应被称作肠促胰素效应 ; [7] Perley 等证实肠促胰素效应产生的胰岛素占进食后胰岛素分泌总量的 50% 以上 80 年代的生理学研究表明, 小肠内分泌细胞产生的一种激素可以调节胰岛对进餐的反应, 该激素在餐后会促进胰岛素的适量分泌, 因而被命名为肠促胰素 (Incretin); [8] 1986 年,Nauck 等发现 II 型糖尿病患者的肠促胰素效应减弱, 提示肠促胰素系统异常可能是 II 型糖尿病的发病机制之一随着细胞和分子生物学的快速发展, 现在人们知道肠促胰素是人体内的一种肠源性激素, 进食以后能够促进胰岛素的分泌, 从而发挥葡萄糖依赖性的降血糖作用, 主要由胰高血糖素样肽 -1(glucagon-like peptide-1,glp-1) 和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽 (glucose-dependent Insulintropic polypeptide,gip) 组成, 其中,GLP-1 在 II 型糖尿病的发生发展中起着更为重要的作用胰高血糖素样肽 -1, 顾名思义, 同胰高血糖素一样, 都源于胰高血糖素原基因在胰岛 α 细胞中, 胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰高血糖素 ; 但在肠黏膜的 L 细胞 ( 主要由末端空肠回肠和结肠的朗罕氏细胞所分泌 ) 和大脑, 胰高血糖素原 160 个氨基酸残基序列经过前激素转换酶 (PC1) 介导的翻译后加工, 被剪切变成其羧基端的含有 37 个氨基酸残基肽链序列, 之后再被酶解切除其 N 端的 6 个氨基酸 ( 图 1) [9] 在人体内,GLP-1 有两种 GLUCAGON: GLP : GLP NH2: 图 1 活性 GLP-1 与胰高血糖素氨基酸序列比对 : 29 : 31 : 30

3 32 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6 生物活性形式, 分别为 31 个氨基酸的 GLP-1(7-37) 和 30 个氨基酸的 GLP-1(7-36) 酰胺, 两者只有一个氨基酸残基不同, 并且 GLP-1 约 80% 的循环活性来自 GLP-1(7-36) 酰胺 [1,2] 形式 [10] GLP-1 属于肽类激素中胰高血糖素超家族, 胰高血糖素和源自沙漠毒蜥蜴唾液的 Exendin-4 都属于该家族序列分析表明该原基因含有 4 个外显子, 分别编码 mrna 的 5' 非翻译区信号肽激素及 3' 非翻译区 GLP-1 序列在动物进化中高度保守, 表明它在调控生理过程的重要性此外, 研究还表明 His 1 Gly 4 Phe 6 Thr 7 Asp 9 Phe 22 和 Ile 23 这些位置的氨基酸残基对于 GLP-1 的亲和能力和生物活性至关重要 2 GLP-1 作用机制及功能多样性 GLP-1 的降糖作用具有葡萄糖浓度依赖性, 即 GLP-1 作为一种肠源性激素, 只有在营养物质特别是碳水化合物造成血糖水平升高的情况下, 才发挥降糖作用, 而在血糖水平正常时, 则不会使其进一步降低研究证实,Incretin 以葡萄糖浓度依赖性的方式促进胰岛 β 细胞分泌胰岛素, 并减少胰岛 α 细胞分泌胰高血糖素, 从而降低血糖也就是说, 正常人在进餐后, 促使肠促胰素分泌, 进而促进胰岛素的分泌, 从而减少餐后血糖波动然而,II 型糖尿病患者肠促胰素效应受损, 表现在进餐后 GLP-1 浓度升高幅度较正常人有所减小, 但其促进胰岛素分泌来降血糖的作用并无明显受损 GLP-1 的这种葡萄糖浓度依赖性降糖特性免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心, 因此,GLP-1 及其类似物可以作为 II 型糖尿病治疗的一个重要选择此外, 越来越多的研究发现,GLP-1 是一个多功能的降血糖激素, 多重功效主要表现在 :(1) 促进胰岛素的生物合成和分泌 GLP-1 通过直接途径和间接途径来促进胰岛素分泌在直接途径中, GLP-1 对糖代谢的影响是通过与胰腺 β 细胞上特异的受体相互作用产生的, 从而使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增强在间接途径中,GLP-1 通过激活 β 细胞上的敏感神经和葡萄糖感受器来起作用 [11] 不管是间接途径还是直接途径,GLP-1 的作用都是血糖浓度依赖性的, 即血糖越高, 作用越强, 血糖下降作用便减弱, 直至血糖浓度小于 3.6 mmol/l 时,GLP-1 不再发挥刺激胰岛素分泌的作用因此, GLP-1 的这种作用特性不会引起严重的低血糖 ;(2) 抑制胰高血糖素的分泌 GLP-1 作用于胰岛 α 细胞, 强烈地抑制胰高血糖素的释放 [12] ; 作用于胰岛 δ 细胞, 促进生长抑素的分泌, 而生长抑素可作为旁泌素抑制胰高血糖素的分泌上述作用也是血糖浓度依赖的, 当血糖降到一定的水平后,GLP-1 将不再抑制胰高血糖素的分泌 ;(3) 保护胰岛 β 细胞可刺激胰岛 β 细胞的增殖和分化 [12], 促进胰岛 β 细胞的再生和修复, 许多研究表明,GLP-1 可诱导胰腺细胞小肠表皮细胞和胰腺中胰岛来源的前体细胞分化成为 β 细胞或具有分泌胰岛素功能的细胞来增加 β 细胞的数量 [13] ; 抑制胰岛 β 细胞凋亡, 主要是通过保持 β 细胞形态抑制前凋亡基因的表达来保护 β 细胞研究表明,GLP-1 通过上调抗凋亡蛋白 Bcl-2 抑制 caspase3 的活性, 并激活核因子 KappaB (NF-κB) 启动子的活性来促进 β 细胞的存活 ( 图 2); (4) 改善胰岛素敏感性 ( 胰外作用 ), 从而减少 I 型糖尿病患者对胰岛素的需求量 [14] ;(5) 抑制胃排空和胃酸分泌, 通过多种途径降低体重 [15] 这些作用都是通过迷走神经调节来实现的, 并且这种抑制作用强度依赖于血清中 GLP-1 的剂量 ;(6) 作用于中枢神经系统, 特别是下丘脑, 从而使人体产生饱胀感和食欲下降 [16] ;(7) 在胰岛素作用的靶器官肝脏骨骼肌和脂肪组织上亦存在高亲和力的 GLP-1 结合位点,GLP-1 可促进肝脏骨骼肌和脂肪组织的糖原合成和脂肪生成, 可能发挥降脂降压作用, 从而对心血管系统产生保护作用 [17] ;(8) 通过作用于中枢增强学习和记忆功能, 保护神经 ( 图 3) GLP-1 的功能由 GLP-1 受体介导 GLP-1 受体属于 7 次跨膜 G 蛋白耦联受体 B 家族中的胰高血糖素受体亚家族, 含 463 个氨基酸, 广泛分布在人的胰岛心脏肾脏肺, 以及中枢和周围神经系统的多个区域当人体受到营养激素神经输入等就会刺激肠道 L 细胞分泌 GLP-1, 循环活性的 GLP-1 通过与其受体结合后, 通过多向性传导途径激活 camp/pka/creb,camp/akt/pkb 和 MAPK 等信号途径来发挥其多重生物学作用一方面,GLP-1

4 许芳芳等人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展 2016,32(6) 33 MEK 丝裂原激活蛋白激酶的激酶 ERK 细胞外信号调节激酶 β-catenin β联蛋白 TCF7L2 转录因子 7 类似物 2 Caspase3 胱天蛋白酶 3 Pdx1 胰腺十二指肠同源框 1 胰岛素分泌细胞特异性转录因子 FoxO1 叉头转录因子 O1 图2 GLP-1 发挥多重功效的调控信号通路 19 与胰岛 β 细胞表面的受体 GLP-1R 相结合活化 Gα 亚图3 基激活腺苷酸环化酶 AC 增加 AC 水平引起胞内环腺苷酸 camp 浓度的增加 camp 进一步激活下游的效应蛋白蛋白激酶 A PKA 和直接被 camp 活化的鸟苷酸交换因子 EPAC2 激活的 PKA 促使下游 K-ATP 通道关闭线粒体膜电位去极化激活 Ca2+ 信号通路 Ca2+ 通道打开并内流增加 camp 应答元件结合蛋白 CREB 的转录活性上调胰岛素受体底物 2 IRS2 的表达或者 GLP-1 与胰岛 β 细胞表面的 GLP-1R 相结合活化 Gβγ 亚基经由表皮生长因子 β 细胞素 beta-cellulin 或者基质金属蛋白酶 9 MMP9 反式激活表皮生长因子 GLP-1 对周边组织作用降低血糖 18 综上所述 GLP-1 在糖尿病患者体内的降血糖作用不会造成任何机体损伤还免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心并且不存在口服降糖药物不可避免的副作用再加上多重作用功效为 II 型糖尿病的治疗提供了一个广阔的应用前景利用肠促胰素来治疗 II 型糖尿病已经成为今后糖尿病药物研究的重要发展方向 3 GLP-1 应用于临床现面临的挑战前景虽好然而要将 GLP-1 应用于临床目前受体 EGFR 进而激活磷脂酰肌醇 3 激酶 PI3K 却面临着一个极大地挑战人体自身产生的 GLP- 以及下游的 PKB/Akt 和丝裂原活化蛋白激酶 P38 1 极易被体内广泛存在的二肽基肽酶Ⅳ DPP- Ⅳ P38MAPK 图 2 从 N 端 His7-Ala8 处降解产生 GLP NH2 另外当血糖降至一定水平分泌出来的胰岛或 GLP 形式而失活导致其血浆半衰期素的浓度反过来抑制 GLP-1 的释放负反馈机制的不足 2 min 此外 GLP-1 分子量不足 4 kd 如此存在调控了 GLP-1 的分泌这也从一定角度解释了小的分子量使其很容易在代谢中被肾小球滤过因 GLP-1 降血糖作用对人体葡萄糖浓度的依赖性此必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗

5 34 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6 效, 这极大地限制了 GLP-1 的临床应用因此, 如何延长 GLP-1 在人体内的作用成为临床制药的关键如何科学地利用 GLP-1 的生理特性来积极寻找长效的新型类似物成为缓解或治疗 II 型糖尿病的关键问题为解决这一难题, 目前研究人员集中致力于 3 种解决方案 :(1) 开发 GLP-1 类似物, 让其既保有 GLP-1 的功效但同时又能抵抗二肽基肽酶 Ⅳ 的降解 ; (2) 开发 DPP- Ⅳ 抑制剂, 通过抑制其活性, 使体内自身分泌的 GLP-1 不被降解 ;(3) 利用重组的方法, 将 GLP-1 基因前后串联起来形成多聚体蛋白, 不仅可以提高其表达量, 而且进而通过基因修饰和改造增加重组表达产物的稳定性 GLP-1 给药方式的研究目前也多种多样, 但一般集中在口服或腹腔注射上迄今为止, 这些研究都已经取得了一定的进展 4 GLP-1 类似物的研究与应用进展 4.1 采用化学合成法制备 GLP-1 类似物药物国外现在多采用化学合成的方法得到 GLP-1 或其类似物自 2005 年国际上第一个肠促胰素类药物上市以来, 此类药物的研究和临床应用均有了较快发展截至目前, 在我国已经上市包括 2 种 GLP-1 受体激动剂和 5 种 DPP-VI 抑制剂 GLP-1 受体激动剂通过模拟天然 GLP-1 来激活受体从而发挥作用, 并且不易被 DPP-VI 降解, 半衰期一定程度的延长增加了活性 GLP-1 在人体内的浓度, 降糖效果明显 2005 年, 由 Lily 公司和 Amylin 公司合作的第一个 GLP-1 类似物药物艾塞那肽 exenatide(byetta, 商品名百泌达 ), 就是一种短效 GLP-1 受体激动剂, 现已上市 Exenatide 是美洲毒蜥蜴唾液中多肽 exendin-4 的人工合成多肽, 如前文所述,exendin-4 虽与 GLP-1 具有 53% 的同源性, 但由于其活性形式具有不同于 GLP-1(His-Ala) 的 His-Gly, 而能有效抵抗 DPP-VI 降解另外一种已经在中国上市的是 Novo Nordisk 公司研制的长效 GLP-1 受体激动剂 GLP-1 类似物利拉鲁肽 (1iraglutide, 商品名诺和力 ), 是对人 GLP-1 分子结构局部进行修饰加工而成, 与 GLP-1 有 97% 的同源性, 只是将 GLP-l 的 Lys 28 转变为 Arg 28, 同时在多肽 C 末端增加一个 Gly, 在 Lys 20 侧链上增加了一个 C16 的脂肪酸侧链, 该侧链通过与人血清白蛋白结合, 从而增加 GLP-1 在体内的半衰期 [20] DPP-IV 抑制剂通过阻止 DPP-IV 酶解体内 GLP- 1, 使得 GLP-1 的生理浓度在一定程度上升高, 以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛素释放, 并降低胰高血糖素的水平来治疗糖尿病目前在中国已上市的 DPP-4 抑制剂类药物有 5 种 : 西格列汀 (sitagliptin, 商品名捷诺维 ) 沙格列汀(saxagliptin, 商品名安立泽 ) 维格列汀 (vildagliptin, 商品名佳维乐 ) 利格列汀 (1inagliptin, 商品名欧唐宁 ) 和阿格列汀 (alogliptin, 商品名尼欣那 ) 这些 GLP-1 类似物药物现在都已上市, 适用于成人 II 型糖尿病患者,GLP-1 受体激动剂服用方式同胰岛素一样, 需要通过皮下注射才能发挥功效 ; DPP-IV 抑制剂均为口服制剂两者都伴有轻微低血糖症状发生, 而且存在潜在的不良作用并且价格昂贵, 这无疑令糖尿病患者悲喜交加 4.2 采用基因工程方法制备 GLP-1 类似物药物国内由于受到化学合成成本技术等原因的限制, 多采用基因工程的方法获取重组 hglp-1, 首选 [21] 的蛋白表达系统是大肠杆菌左翼等于 2006 年将 hglp-1 cdna 基因插入 pet-32a(+) 载体中, 构建成一个含硫氧还蛋白 (thioredoxin) 六聚组氨酸 (hexahistidine) 与 rhglp-1 的融合表达载体 pet32- GLP-1, 在此基础上将该融合基因序列进行同向串联, 获得二串和三串的表达载体 pet32-glp-1-2 和 pet32-glp-1-3, 含多个 hglp-1 基因的串联体, 可以提高 GLP-1 的产量利用上述 3 种表达载体分别转化大肠杆菌 BL21(DE3) 后获得相应的基因工程菌, 经发酵和 IPTG 诱导后,3 个工程菌均能正确表达目的蛋白, 且目标蛋白的表达量随着基因串数的增加而得到一定提高重组蛋白经分离纯化后, 腹腔注射小鼠进行生物学活性测试, 结果发现它们具有明显的降血糖作用 [22] 2007 年,Hou 等在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达 hglp-1 八联体类似物, 即将 Ala 8 突变 Ser 8, 将 Lys 26,34 分别突变成 Gln 26 和 Asp 34, 然后 His 标签融合蛋白纯化后经 20 mg/kg 剂量给经链脲佐菌素 (STZ) 诱导的 II 型糖尿病大鼠口服,10 d 后发现, 大鼠的血糖明显下降, 高血糖症状得到显著缓解

6 2016,32(6) 许芳芳等 : 人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展 35 [23] 2008 年, 窦文芳等将 hglp-1 DPP-IV 作用位点突变后进行串联, 与谷胱甘肽 -S 转移酶 (glutathione S-transferase,GST) 标签融合, 在大肠杆菌 BL21(DE3) 基因工程菌中获得表达, 经发酵和 IPTG 诱导后, 获得正确表达的目的蛋白重组蛋白经分离纯化后, 通过尾静脉注射小鼠进行口服葡萄糖耐受实验 (OGTT) 测定, 结果显示目的蛋白不仅显著降血糖活性, 且能有效抵抗 DPP-IV 的降解与此同时, 也有人用酵母表达系统来制备重组 GLP-1, 并取得了很好的结果酵母蛋白表达系统属于真核表达系统, 相对大肠杆菌原核表达系统具有 [24] 一定的优势陈其亮等于 2008 年采用基因串联的方法, 将 GLP-1 序列上 DPP-IV 水解部位进行突变, 克隆到毕赤酵母中, 表达和纯化后得到的 GLP-1 在小鼠体外胰岛 β 细胞增殖实验中检测到有促细胞增殖活性 [25] 2010 年, 李现丽等继续陈其亮等人的工作, 将突变串联后的 GLP-1 序列同人血清白蛋白 (HAS) 融合, 转化毕赤酵母进行表达, 融合蛋白经纯化后在 C57BL/6 小鼠体内进行 OGTT, 结果表明融合蛋白经皮下给药 8 h 后仍能发挥显著的降糖活性 [26] 吴日等在酿酒酵母中组成型表达 10 GLP- 1, 将表达成功的长效促胰岛素降糖酵母 (long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast,lhy) 作为益生菌口服灌胃给经 STZ 诱导和高脂高糖饮食联合诱导的 II 型糖尿病小鼠模型, 结果表明,LHY 口服灌胃治疗具有较好疗效, 可以明显降低血糖水平此外, 在植物中表达 hglp-1 方面, 也取得了不少喜人的成果最值得关注的是,2008 年日本人 [27] Jomori 等首先对人 GLP-1 即 GLP-1(7-36) 进行了修饰, 将 Ala 8 突变 Ser 8, 将 Lys 26,34 分别突变成 Gln 26 和 Asn 34, 然后将改造后 GLP-1 基因头尾串联, 获得了 5 个 GPL-1 基因的串联体 5 mhglp-1( 图 4 ), 这种设计赋予 GLP-1 对 DPP-IV 和 trypsin 蛋白酶较高的抗性将改造后的 5 mhglp-1 基因导入水稻中进行表达发现,5 mhglp-1 重组蛋白在水稻胚乳中大量积累将该转基因水稻种子研磨成粉经胰蛋白酶处理后饲喂糖尿病小鼠, 结果发现, 转基因水稻可显著降低小鼠血液中的葡萄糖含量该研究成果现已申报了国际发明专利 [26] 图 4 hglp-1 抗蛋白酶结构设计在此基础上, 也有人将原始 GLP-1 肽链进行了改变, 分别将 Ala 8 Ser 8,Lys 26 Gln 26 和 Lys 34 Asp 34, 保留了 Arg 36, 原因是它是体内 GLP-1 酰胺化所必需的, 而酰胺化可以延长 GLP-1 在体内的半衰期, 并在多肽 C 末端添加一个 Cys 残基, 以增加 GLP-l 的稳定性 [28] Cys 残基可能促使 GLP-1 形成双体或者多聚体, 降低水溶性, 以更好地抵抗酶的降解, 同时在注入体内之后可能继续保持双体或者多聚体形态, 降低可溶性以达到缓释作用即便 Cys 解链, 它也可以与人血清白蛋白 (HAS) 结合, [29] 改善药物代谢动力学性质金明飞等在随后的体内实验中验证了改构之后的 GLP-1 显著的长效的降血糖活性 [30] Yasuda 等于 2005 年在水稻种子中表达由谷蛋白 (glutelin) 信号肽融合的 GLP-1 单体时失败, 此发现证实 GLP-1 单体在转录后被 sirna 沉默掉, 也有可能由于短肽的不稳定性而被蛋白酶水解了一年后, 他们研究由 glutelin 或几丁质酶 (chitinase) 信号肽融合的 GLP-1 五聚体同样在水稻种子中表达时也失败了, 由此证实工程植物信号肽不能从成熟融合蛋白正确切除因而影响目标蛋白的活性 [31] 在 [32] 此研究基础上,Brandsma 等将 10 GLP-1 串联重复转化烟草并在烟草叶片中获得表达量较为可观的可溶性蛋白, 经纯化后在体外胰岛素分泌实验中证明,135 min 后 ELISA 仍可检测到上清胰岛素 5 展望 GLP-1 作为一种新型的生物药物, 与当前市售与使用的化学类药物相比, 优势显著, 它能够调动人体多器官组织参与, 多重调节人体血糖平衡, 达到综合治疗糖尿病的效果此外, 它还能促进胰腺 β 细胞的增殖与分化, 抑制 β 细胞的凋亡, 恢复胰腺功能, 标本兼治因此, 针对 GLP-1 研发能改善

7 36 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6 β 细胞的功能服用方便控制血糖持久的药物意义重大, 也引起了国内外研究的热点目前, 采用分子生物学及生物工程技术手段对延长 GLP-1 半衰期的研究经验比较丰富, 但在临床应用上的步伐远跟不上化学合成类似物的方法, 它在节约成本方面的优势显而易见, 而且, 对于口服 GLP-1 降糖药物的研究仍有很长远的路要走当前, 本实验室工作聚焦在采用分子生物学方法及生物工程技术对延长 hglp-1 半衰期和类似物的口服药效方面进行研究经过前期对影响 hglp-1 半衰期的结构修饰, 截至目前, 已经在大肠杆菌和毕赤酵母中成功表达 hglp-1 突变体融合蛋白, 并正着手体外细胞实验以及动物实验进行突变体的活性鉴定相信随着人们对 GLP-1 应用探索的深入, 针对其半衰期的延长会提出更为巧妙的新思路, 从而开发出更多有效的治疗糖尿病的新型药物, 亲民的价格, 简单的口服, 便可以攻克糖尿病参考文献 [1]Talchai C, Xuan S, Lin HV, et al. Pancreatic β cell dedifferentiation as a mechanism of diabetic β cell failure[j]. Cell, 2012, 150(6): [2]DeFronzo RA. From the triumvirate to the ominous octet :a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus[j]. Diabetes, 2009, 58(4): [3]Weir GC, Bonner-Weir S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes[j]. Diabetes, 2004, 53 (suppl 3): [4]Cryer P E, Davis SN, Shamoon H. Hypoglycemia in diabetes[j]. Diabetes Care, 2003, 26(6): [5]Zunz E, La Barre J. Contributions à l'étude des variations physiologiques de la sécrétion interne du pancréas[j]. Arch Physiol Biochem, 1929, 31(2): [6]Mcintyre N, Holdsworth C, Turner D. Intestinal factors in the control of insulin secretion[j]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1965, 25(10): [7]Perley MJ, Kipnis DM. Plasma insulin responses to oral and intravenous glucose :studies in normal and diabetic subjects[j]. Journal of Clinical Investigation, 1967, 46(12):1954. [8]Nauck M, Stöckmann F, Ebert R, et al. Reduced incretin effect in type 2(non-insulin-dependent)diabetes[J]. Diabetologia, 1986, 29(1): [9]Darleen AS, David AD. Physiology of proglucagon peptides :role of glucagon and GLP-1 in health and disease[j]. Physiological Reviews, 2015, 95(2): [10]Wu TZ, Rayner CK, Horowitz M. Incretins[J]. Handbook of Experimental Pharmacology, 2015, 233 : [11]Ahrén B. Sensory nerves contribute to insulin secretion by glucagon-like peptide-1 in mice[j]. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 2004, 286(2): [12]Flamez D, Van Breusegem A, Scrocchi LA, et al. Mouse pancreatic beta-cells exhibit preserved glucose competence after disruption of the glucagon-like peptide-1 receptor gene[j]. Diabetes, 1998, 47(4): [13]Drucker DJ. The biology of incretin hormones[j]. Cell Metab, 2006, 3(3): [14]Suzuki A, Nakauchi H, Taniguchi H. Glucagon-like peptide 1 (1-37)converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(9): [15] 单忠艳. GLP-1 类似物在糖尿病治疗中的作用 [J]. 药品评价, 2009, 6(12): [16]Zander M, Madsbad S, Madsen JL, et al. Effect of 6-week course of glucagon-like peptide 1 on glycaemic control, insulin sensitivity, and β-cell function in type 2 diabetes :a parallel-group study[j]. The Lancet, 2002, 359(9309): [17]Yamamoto H, Kishi T, Lee CE, et al. Glucagon-like peptide- 1-responsive catecholamine neurons in the area postrema link peripheral glucagon-like peptide-1 with central autonomic control sites[j]. The Journal of Neuroscience, 2003, 23(7): [18]Baggio LL, Drucker DJ. Biology of incretins :GLP-1 and GIP[J]. Gastroenterology, 2007, 132(6): [19] 郭莉霞, 刘建辉, 陈刚, 等. 胰高血糖素样肽 1 类似物调节胰岛素分泌细胞增殖和功能的细胞信号通路研究进展 [J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2009, 23(4): [20] 蔡德海, 宋光明, 丁全福. 利拉鲁肽人 GLP-1 类似物 2 型糖尿病的新疗法 [J]. 河北医学, 2010, 16(2): [21] 左翼, 黄静, 卞慧芳, 等. 人胰高血糖素样肽 -1 串联体的克隆

8 2016,32(6) 许芳芳等 : 人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展 37 及其表达 [J]. 华东师范大学学报 : 自然科学版, 2006(4): [22]Hou JH, Yan RX, Ding DF, et al. Oral administration of a fusion protein containing eight GLP-1 analogues produced in Escherichia coli BL21(DE3)in streptozotocin-induced diabetic rats[j]. Biotechnol Lett, 2007, 29(10): [23] 窦文芳, 张莲芬, 雷楗勇, 等. 人胰高糖素样肽 -1 及其突变体在毕赤酵母中的表达与生物活性研究 [J]. 生物技术通报, 2008(6): [24] 陈其亮, 窦文芳, 雷楗勇, 等. 重组胰高糖素样肽 -1 融合蛋白的纯化及其活性测定 [J]. 生物技术通报, 2008(6): [25] 李现丽, 窦文芳, 张晓梅, 等. 融合蛋白 (GLP-1 A2G )2-HSA 的分离纯化及其活性评价 [J]. 药物生物技术, 2010, 17(6): [26] 吴日, 马超, 李晓丹, 等. 长效促胰岛素降糖酵母的构建及其对糖尿病模型小鼠的治疗效果 [J]. 遗传, 2015, 37(2): [27]Jomori T, Hayashi Y, Makino M, et al. GLP-1 derivative and use thereof[j]diabetes, 2008, 57 :409. [28]Wu YL, Huang J, Xu J, et al. Addition of a cysteine to glucagonlike peptide-1(glp-1)conjugates GLP-1 to albumin in serum and prolongs GLP-1 action in vivo[j]. Regul Pept, 2010, 164(2): [29] 金明飞. 口服胰高血糖素样肽 -1 的筛选和应用研究 [D]. 上海 : 华南师范大学, [30]Yasuda H, Tada Y, Hayashi Y, et al. Expression of the small peptide GLP-1 in transgenic plants[j]. Transgenic Research, 2005, 14 : [31]Yasuda H, Hayashi Y, Jomori T, et al. The correlation between expression and localization of a foreign gene product in rice endosperm[j]. Plant Cell Physiol, 2006, 47(6): [32]Brandsma M, Wang X, Diao H, et al. A proficient approach to the production of therapeutic Glucagon-Like Peptide-1(GLP-1)in transgenic plants[j]. The Open Biotechnology Journal, 2009, 3 : ( 责任编辑狄艳红 )

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌