生物工程食品科学 20, Vol. 31, No 新的思路 [4] 郭全友等对冷藏东海暖水海域养殖大黄鱼进行研究, 货架期终点时腐败希瓦氏菌比例达 86%, 其次是假单胞菌, 表明腐败希瓦氏菌和假单胞菌是低温贮藏大黄鱼的优势腐败菌李学英等对大黄鱼腐败希瓦氏菌腐败能力进行了初步分析

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帽顾
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1 118 20, Vol. 31, No. 23 食品科学生物工程许振伟 1,2, 许钟 1, 杨宪时 1, *, 郭全友 1, 李学英 1 (1. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 ;2. 上海海洋大学食品学院, 上海 ) : 通过分析接种腐败菌的大黄鱼无菌鱼块在贮藏中的感官腐败代谢产物和腐败菌的变化, 以腐败菌生长动力学参数和腐败代谢产物产量因子 (YTVB-N/CFU 和 YTMA/CFU) 为指标, 探讨冷藏大黄鱼优势腐败菌 ( 腐败希瓦氏菌假单胞菌以及这两种菌的复合菌 ) 的腐败能力结果表明, 接种腐败希瓦氏菌假单胞菌和复合菌的无菌鱼块的货架期分别为 h, 说明接种假单胞菌的货架期较长腐败希瓦氏菌假单胞菌和复合菌的 Y TVB-N/CFU 基本一致, 腐败希瓦氏菌的 YTMA/CFU 明显大于假单胞菌和复合菌, 腐败希瓦氏菌的腐败能力较假单胞菌和复合菌强假单胞菌对腐败希瓦氏菌的生长有一定的拮抗作用, 但仅在较高数量时才有明显作用, 腐败希瓦氏菌是有氧冷藏养殖大黄鱼的特定腐败菌 : 大黄鱼 ; 优势腐败菌 ; 腐败能力 ; 腐败希瓦氏菌 ; 假单胞菌 Analysis of Spoilage Ability of Single and Mixed Spoilage Bacteria in Pseudosciaena crocea XU Zhen-wei 1,2,XU Zhong 1,YANG Xian-shi 1, *,GUO Quan-you 1,LI Xue-ying 1 (1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai , China; 2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai , China) Abstract:Sensory quality, metabolic products of spoilage bacteria and change of spoilage bacteria were assayed on sterile Pseudosciaena crocea tissue blocks inoculated with spoilage bacteria, with YTVB-N/CFU and YTMA/CFU, the growth kinetic parameters of the spoilage bacteria and the yield factor of microbial metabolites, respectively, used as the index. Spoilage ability of two spoilage bacteria Shewanella putrefaciens and Pseudomonas spp., as well as the mixing of the two spoilage bacteria were analyzed on Pseudosciaena crocea stored aerobically at chilled condition. The results showed that shelf life was 168 h, 174 h, and 168 h, respectively, for sterile tissue blocks inoculated with Shewanella putrefaciens, Pseudomonas spp. and their mixture, while it was relatively longer with Pseudomonas spp. The YTVB-N/CFU for Shewanella putrefaciens, Pseudomonas spp. and mixed bacteria was basically similar, meanwhile YTMA/CFU for Shewanella putrefaciens was higher than for Pseudomonas spp. and mixed bacteria. The spoilage ability of Shewanella putrefaciens was more significant than Pseudomonas spp. and mixed bacteria. Pseudomonas spp. had inhibitory effect on he growth of Shewanella putrefaciens to some extent, however it was not significant until it reached high counts. Shewanella putrefaciens was specific spoilage organism in Pseudosciaena crocea stored at chilled temperature aerobically. Key words:pseudosciaena crocea;dominant spoilage bacteria;spoilage ability;shewanella putrefaciens;pseudomonas spp. 中图分类号 :S983 文献标识码 :A 文章编号 : (20) 微生物活动是引起鲜鱼腐败变质的主要原因, 已有研究表明, 鱼体所含微生物中只有部分参与腐败过程, 这些适合生存和繁殖并产生强烈异臭味腐败代谢产物的微生物, 就是该鱼的特定腐败菌 (specific spoilage organisms,sso) [1] 特定腐败菌比其他微生物生长快, [2] 并且腐败能力强, 因此可采用抑制或降低特定腐败菌生长的处理和加工方法, 即使不影响其他微生物群落, [3] 也会延长产品货架期, 这为开发鱼类保鲜技术提供了收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 科技部农业科技成果转化资金项目 (2007GB ); 科技部中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 (2007M05) 作者简介 : 许振伟 (1986 ), 男, 硕士研究生, 主要从事食品微生物安全与质量控制研究 xuzhenweixu@163.com * 通信作者 : 杨宪时 (1954 ), 男, 研究员, 本科, 主要从事水产品贮藏加工与品质控制研究 xianshiyang@126.com

2 生物工程食品科学 20, Vol. 31, No 新的思路 [4] 郭全友等对冷藏东海暖水海域养殖大黄鱼进行研究, 货架期终点时腐败希瓦氏菌比例达 86%, 其次是假单胞菌, 表明腐败希瓦氏菌和假单胞菌是低温贮藏大黄鱼的优势腐败菌李学英等对大黄鱼腐败希瓦氏菌腐败能力进行了初步分析, 表明腐败希瓦氏菌具有很强的腐败潜力, 但腐败活性低, 需要较高浓度才能引起腐败鱼类特定腐败菌的鉴别必须分析比较优势腐败菌的腐败能力本实验将有氧冷藏大黄鱼在货架期终点分离纯化鉴定得到的优势腐败菌腐败希瓦氏菌和假单胞菌, 分别接种到无菌鱼块中, 比较这两种菌单一的腐败能力, 并将这两种腐败菌按比例混合, 分析对无菌鱼块的腐败能力, 探讨两种优势腐败菌在参与腐败 [6] 的过程中是拮抗协同或是共生作用, 旨在分析复合菌大黄鱼优势腐败菌的腐败能力, 为鱼类特定腐败菌的研究提供参考 1 材料与方法 1.1 材料与仪器活大黄鱼购于上海铜川路水产批发市场, 个体大小 600~700g/ 尾, 充氧保活运送到实验室立即冰水休克致死, 用自来水冲洗鱼体, 去头去鳞去内脏去鳍, 清洗干净, 用于制备无菌鱼块半微量定氮仪国药集团化学试剂有限公司 ;721 型分光光度计上海菁华科技仪器有限公司 ;Sanyo MIR 553 低温培养箱日本三洋电器集团 ;DS-1 高速组织捣碎机上海精科实业有限公司 ;SEX-TJ 净化工作台上海整新电子设备公司 ;L550/L530 低速台式离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司 1.2 培养基 CM 559 假单胞菌专用培养基 (supplemented with SR 3) 英国 OXOID Basingstoke 公司 ; 铁琼脂培养基上海中科昆虫生物技术开发有限公司 1.3 无菌鱼块的制备 [7] 根据 Herbert 等的方法, 无菌操作制备无菌鱼块 1.4 纯菌液的制备与接种贮藏实验接种纯菌液的制备挑取实验室保存的有氧冷藏大黄鱼货架期终点分离纯化鉴定得到的腐败希瓦氏菌 ( Shewanella putrefaciens) 和荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 纯菌株, 制备腐败希瓦氏菌和假单胞菌纯菌液接种与贮藏实验参照文献中的接种方法, 进行纯菌液的接种与接种后的贮藏实验其中复合菌以腐败希瓦氏菌和假单胞菌菌液体积比 1:1 接种取浓度为 8 CFU/mL 的各菌液 5mL, 加入 45mL 灭菌生理盐水中, 将该 50mL 菌液加入 450mL 灭菌生理盐水中, 即稀释至 6 CFU/mL, 将两种菌液以 1:1 比例混匀用于接种将接种后的鱼块置于灭菌的瓷盘中, 覆盖有漏气孔保鲜膜, 放于高精度低温培养箱中, 控制贮藏温度 (5 ± 0.1) 每隔 6h 或 12h 对接种的鱼块进行感官评价, 挥发性盐基氮 (total volatile base nitrogen,tvb-n) 测定三甲胺 (trimethylamine,tma) 测定和腐败希瓦氏菌假单胞菌和两者的复合菌菌落计数 1.5 测定方法感官评价由 6 名经过训练的评价员组成感官评价小组, 采用 3 分法对贮藏过程的接种鱼块进行感官评价,0 分为最好品质,1 分为鱼块的鲜香味消失, 为高品质期 (high quality life,hql) 终点 ;2 分为明显出现异臭味, 为货 [8] 架期 (shelf life,sl) 终点即感官拒绝点 TVB-N 测定参照 GB/T 肉与肉制品卫生标准的分析方法中半微量定氮法测定 TMA 测定参照 GB/T 火腿中三甲胺氮的测 [9] 定和许龙福等的修订方法, 采用苦味酸法测定细菌计数与培养基称取打碎鱼肉 25g, 加入 225mL 质量分数 0.1% 蛋白胨无菌生理盐水, 高速振荡, 以倍梯度稀释后, 取合适浓度稀释液 0.1mL, 涂布于培养基表面, 每个稀释液做两个平行复合菌 : 营养琼脂培养基,25 有氧培养 24h, 全部菌落计数腐败希瓦氏菌 : 铁琼脂培养基,25 有氧培养 24h, 黑色菌落计数假单胞菌 : 假单胞菌专用培养基,25 有氧培养 24h, 全部菌落计数 1.6 微生物生长动力学模型 [] 用修正的 Gompertz 方程描述微生物的生长动态修正的 Gompertz 方程如下所示 : Nmax μmax lgn(t)=lgn0+lg exp{- exp[ (Lag - t)+1]} (1) N0 lg(nmax/n0) 式中 :N(t) 为 t 时间的腐败菌数量 /(CFU/g);N Nmax 为初始菌数和最大菌落数 /(CFU/g);μmax 为最大比生长速率 /h -1 ;Lag 为延滞时间 /h;t 为时间 /h 1.7 腐败能力的定量分析以单位腐败菌产生的腐败代谢产物, 作为腐败能力的定量指标, 腐败代谢产物产量因子 (YTVB-N/CFU 和 YTMA/CFU) 如下所示 :

3 120 20, Vol. 31, No. 23 食品科学生物工程 (TVB-N)s-(TVB-N)0 Y(TVB-N/CFU)= (2) Ns-N0 (TMA)s -(TMA)0 Y(TMA/CFU)= (3) Ns-N0 式中 : 产量因子 YTVB-N/CFU/(mg TVB-N/CFU);YTMA/CFU/ (mg TMA/CFU);N0 为初始菌落数 /(CFU/g);NS 为货架期终点时的腐败菌落数即最小腐败菌落数 /(CFU/g); (TVB-N)0 (TVB-N)S 为初始点和货架期终点时的 TVB-N 量 /(mg/0g);(tma)0 (TMA)S 为初始点和货架期终点时的 TMA 量 /(mg/0g) 1.8 数据处理感官评价和 TVB-N TMA 的变化用 Microsoft Excel 进行多项式回归分析, 腐败菌生长采用修正的 Gompertz 方程描述, 用 Statistica 6.5 进行非线性回归分析 2 结果与分析 2.1 贮藏中的感官变化由图 2 可知, 接种腐败希瓦氏菌假单胞菌和复合菌的鱼块初始 TVB-N 值分别为 mg/0g 贮藏初期 TVB-N 值变化不明显, 随着贮藏时间的延长,TVB-N 值增加明显在 120h 前, 三者的 TVB-N 值较接近, 曲线变化基本一致,150h 后接种腐败希瓦氏菌和假单胞菌鱼块的 TVB-N 值明显高于接种复合菌的 TVB-N 值 2.3 贮藏中 TMA 的变化 TMA 含量 /(mg/0g) 图 3 接种腐败菌的无菌鱼块在 5 贮藏 TMA 的变化 Fig.3 Trimethylamine change in sterile fish blocks inoculated with 感官评分由图 3 可知, 在贮藏初期 TMA 值几乎接近于零, 60h 后接种腐败希瓦氏菌和接种复合菌的鱼块 TMA 值随着贮藏时间开始快速增加, 其中接种腐败希瓦氏菌鱼块的 TMA 值高于接种复合菌的 TMA 值 ; 而接种假单胞菌鱼块的 TMA 值明显较低, 腐败终点时 TMA 含量也很低 2.4 贮藏中腐败菌菌落数的变化图 1 接种腐败菌的无菌鱼块在 5 贮藏的感官变化 Fig.1 Sensory quality change of sterile fish blocks inoculated with 由图 1 可知, 接种腐败希瓦氏菌假单胞菌复合菌的鱼块分别在 h 达到高品质期终点, 分别在 h 达到感官拒绝点 2.2 贮藏中 TVB-N 的变化腐败菌落数 [lg(cfu/g)] TVB-N 含量 /(mg/0g) 图 2 接种腐败菌的无菌鱼块在 5 贮藏 TVB-N 的变化 Fig.2 Total volatile base nitrogen change of sterile fish blocks inoculated with 图 4 接种腐败菌的无菌鱼块在 5 贮藏腐败菌菌落数的变化 Fig. 4 Microbial counts change of sterile fish blocks inoculated with 采用修正 Gompertz 方程描述接种腐败希瓦氏菌假单胞菌和复合菌的生长动态是典型的 S 型曲线, 所得回归相关系数值均较高 (R 2 分别为 ) 由图 4 可知, 假单胞菌和复合菌的延滞时间较接近, 二者明显比腐败希瓦氏菌的延滞时间短, 这与李学英等的研究相符在贮藏初期鱼块营养物质丰富, 腐败希

4 生物工程食品科学 20, Vol. 31, No 瓦氏菌和假单胞菌的生长互不影响, 此时属于微生物生长中的共生作用, 但随着贮藏时间的延长和鱼块营养物质的不断被消耗, 两种腐败菌的生长出现竞争作用, 假单胞菌对腐败希瓦氏菌有一定的抑制作用, 但抑制作用不明显 2.5 腐败菌的生长动力学参数表 1 无菌鱼块 5 贮藏腐败菌生长动力学参数 Table 1 Microbial growth kinetic parameters of sterile fish blocks inoculated with 腐败菌类型 μmax/h -1 Lag/h lgnmax/[lg(cfu/g)] lgns /[lg(cfu/g)] 腐败希瓦氏菌假单胞菌复合菌表 1 是腐败菌生长动力学参数通过比较可知, 腐败希瓦氏菌假单胞菌和复合菌的最大腐败菌数 (Nmax) 都大于最小腐败菌数 ( N s), 表明三者都能引起大黄鱼的腐败三者的最大比生长速率 (μmax) 分别为 h -1 和 h -1, 其中腐败希瓦氏菌的最大比生长速率明显大于假单胞菌和复合菌, 假单胞菌与复合菌的最大比生长率基本相一致三者的延滞时间分别为 h, 假单胞菌和复合菌的生长延滞时间明显较腐败希瓦氏菌短 2.6 腐败菌腐败能力的定量分析表 2 接种腐败菌的无菌鱼块在 5 贮藏腐败菌的产量因子 Table 2 Yield factors of TVBN and TMA production of spoilage bacteria inoculated sterile fish blocks stored at 5 腐败菌类型 YTVB-N/CFU/(mg TVB-N/CFU) YTMA/CFU/(mg TMA/CFU) 腐败希瓦氏菌假单胞菌复合菌由表 2 可知, 三者的 Y TVB-N/CFU 基本一致, 腐败希瓦氏菌的 YTMA/CFU 明显大于假单胞菌的通过比较接种腐败菌的无菌鱼块贮藏初始点和出现明显腐臭味时的感官评价 TVB-N TMA 值和腐败菌数, 腐败菌的生长动力学参数腐败代谢产物的产量因子 (YTVB-N/CFU 和 YTMA/CFU), 大黄鱼有氧低温贮藏的两种优势腐败菌中腐败希瓦氏菌的腐败能力较假单胞菌强复合菌强 3 讨论 TMAO(trimethylamine oxide, 氧化三甲胺 ) 广泛分布于海产硬骨鱼类的肌肉中, 是海产硬骨鱼类具有的一种特殊鲜味物质海水鱼每 0g 鱼肉组织中含 1~0mg TMAO, 而淡水鱼肉一般仅含有 5~20mg TMAO [11] 腐败希瓦氏菌能将 TMAO 还原为 TMA, 而假单胞菌 [12] [13] 不能或还原 TMAO 能力非常弱 Miller 等将荧光假单胞菌接种到无菌美洲平鲉鱼块中, 腐败点时测得 TMA 含量仅为 0.5mg/0g 本研究中接种假单胞菌的鱼块测定的 TMA 含量也很低, 腐败点时含量仅为 1.16mg/0g 无菌鱼块可作为腐败菌腐败能力研究的基质, 但无菌鱼块的无菌是相对而言的, 无菌鱼块制备后菌落总数应小于 2 CFU/g [7] [14] Gram 等研究尼罗河新鲜和腐败着的鲈鱼细菌学时, 将细菌接种到杀菌过的鲈鱼和杀菌过的鳕鱼肉汤中, 通过其腐败气味, 以确定其腐败能力, 用 TMAO 培养基来测试产生 TMA 和 H 2S 的能力 Dalgaard [15] 研究了包装鳕鱼的特定腐败菌, 得出磷发光杆菌 (Photobacterium phosphoreum) 的产量因子 (YTMA/CFU) 明显大于腐败希瓦氏菌的产量因子, 磷发光杆菌是包装鳕鱼的特定腐败菌 [16] 郭全友等对养殖大黄鱼低温有氧贮藏货架期终点的腐败菌进行鉴定, 假单胞菌和腐败希瓦氏菌是有氧冷藏海水鱼的优势腐败菌假单胞菌在海水鱼的腐败中没有很大的重要性, 这可能是由于其数量相对较少, 同 [17] [18] 高数量的腐败希瓦氏菌竞争能力低 Gram 等研究了荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌在鲈鱼鱼块中的相互作用, 得出荧光假单胞菌会抑制腐败希瓦氏菌的生长, 但这一相互作用仅在含较高浓度时才会影响腐败希瓦氏菌生长这与本研究的接种腐败希瓦氏菌和假单胞菌两种腐败菌的复合菌的生长相一致, 腐败希瓦氏菌是冷藏大黄鱼的特定腐败菌, 其腐败能力强参考文献 : [1] JOS H J, HUIS I V. Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview[j]. International Journal of Food Microbiolog, 1996, 33(2): [2] LUND B M, BAIRD-PARKER T C, GOULD G W. The microbiological safety and quality of food[m]. Gaithersburg Maryland USA: Aspen Publishers Inc, 2000: [3] 杨宪时, 许钟, 肖琳琳. 水产食品特定腐败菌与货架期的预测和延长 [J]. 水产学报, 2004, 28(1): [4] 郭全友, 许钟, 杨宪时. 冷藏养殖大黄鱼品质变化特征及细菌相分析 [J]. 上海水产大学学报, 2006, 15(6): 李学英, 杨宪时, 郭全友, 等. 大黄鱼腐败菌腐败能力的初步分析 [J]. 食品工业科技, 2009, 30(6): [6] 胡国臣, 张清敏. 环境微生物学 [M]. 天津 : 天津科技翻译出版社, 2002: [7] HERBERT R A, HENDRIE M S, GIBSON D M, et al. Bacteria active in the spoilage of certain sea foods[j]. Journal of Applied Bacteriology, 1971, 34(3): [8] TAOUKIS P S, KOUTSOUMANIS K, NYCHAS G J E. Use of time

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1398 微生物学通报 2009, Vol.36, No.9 ) [2], 25% [3],,,,, ,,,,, 1 预报微生物学 1.1 预报微生物学概况 (Predictive Microbiology) [4] 80,,, 1.2 预报微生物学模型的建立与研究现状,,,

1398 微生物学通报 2009, Vol.36, No.9 ) [2], 25% [3],,,,, ,,,,, 1 预报微生物学 1.1 预报微生物学概况 (Predictive Microbiology) [4] 80,,, 1.2 预报微生物学模型的建立与研究现状,,, 微生物学通报 SEP 20, 2009, 36(9): 1397~1403 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2009 by Institute of Microbiology, CAS 专论与综述预报微生物学在食品安全风险评估中的作用 * 胡洁云欧杰李柏林 ( 201306) 摘要 : 随着中国食品工业的发展, 食品安全问题日益凸显, 建立一种准确及时的食品安全风险评估是产品市场对食品安全体系提出的挑战