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容宇廉
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1 23, Vol.3, No. 大肠杆菌和假单胞菌在猪背最长肌上混合预测模型的建立金鑫禹迎迎吴菊清徐幸莲周光宏* (南京农业大学教育部肉品加工与质量控制重点实验江苏南京摘 295) 要将大肠杆菌和假单胞菌混合接种到猪背最长肌上分别贮藏在 5 2 条件下并做3 和22 两个验证温度结果表明修正的Gompertz方程能很好地拟合大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线采用Belehradek模型能很好地描述温度对最大比生长速率(μmax)和延滞时间(Lag)的影响采用3 和22 两个验证温度验证模型的可靠性表明模型是可靠性的关键词大肠杆菌假单胞菌混合预测模型 Predictive Modeling of Simultaneous Growth of Escherichia coli and Pseudomonas spp. in Inoculated Pork longissimus dorsi Muscle JIN Xin YU Ying-ying WU Ju-qing XU Xing-lian ZHOU Guang-hong* (Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 295, China) Abstract Pork longissimus dorsi muscle was inoculated with both Escherichia coli and Pseudomonas spp., and then stored at, 5, 2 or. The results showed that growth curves of E. coli and Pseudomonas spp. at different temperatures could be well described by a modified Gompertz model. The influence of temperature on growth rate (μmax) and lag phase (Lag) was well described by Belehradek model. The model developed in this study was conﬁrmed to be reliable by validation experiments at 3 and 22. Key words Escherichia coli Pseudomonas mixed strains predictive modeling 中图分类号 TS.5 文献标志码 A 文章编号 -3(23)--5 doi:.5/spkx 预测食品微生物学(predictive food microbiology PFM)是一门建立在食品微生物学数学统计学和计算现象单一优势腐败菌模型不能很好地反映肉类真实的腐机科学基础上的新兴学科通过计算机技术对食品中微败情况目前国外已有很多混合预测模型的研究[-] 生物的延迟生长残存和死亡进行数量化的预测为而国内大部分的预测模型主要还是选用一种优势腐败菌食品行业提供数据库和软件包目的是在不进行传统微或致病菌来建立预测模型李苗云等[]通过选用种冷却生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预肉的优势腐败菌建立动力学生长预测模型本研究选择测实现从原料到生产流通整个过程的计算机智能化管鲜猪肉的主要优势腐败菌大肠杆菌和假单胞菌建立混理和监控保证食品的质量和安全[-3] 合预测模型以期为将来的混合预测模型研究提供理论传统的微生物检测技术一直依赖于对原材料及最终肉类的菌相复杂且细菌之间存在复杂的群体感应支持产品的微生物检验[] 不能很好的监测肉品在整个生产流通过程中的微生物变化规律微生物预测技术通过建立材料与方法数学模型可以在不进行传统微生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预测可以高效的监测肉品在生产流通过程中的微生物安全问题保障肉品的质量和安全[5]. 材料与仪器取宰后h内 ph值为5..2的第根肋骨处的三元猪猪背最长肌大肠杆菌和假单胞菌菌种均分离于收稿日期基金项目国家国际科技合作项目(29DFA3) 作者简介金鑫(95 ) 男硕士研究生研究方向为肉类加工与安全 29@qq.com *通信作者周光宏(9 ) 男教授博士研究方向为肉品科学 ghzhou@njau.edu.cn

2 23, Vol.3, No. 猪肉营养琼脂北京陆桥技术有限公司所用常规化学试剂均为分析纯 SterilGARD生物安全柜 = blagh(t TminLag) Lag 美国Baker公司低温生化培养箱(控温精度±. 温度均匀度± ) 上海 (3) 式中 T是培养温度/ T min 是一个假设概念指微生物没有代谢活动时的温度此时最大比生长速率为 Stik设备有限公司零 b是方程的常数.2 将公式()求得的μmax Lag和对应的温度代入方程式 (2)和(3) 求得bmaxμ Tminμ blag TminLag这个参数值建菌种活化菌种在实验时分别接种活化3次以上得到活化的大肠杆菌和假单胞菌菌液.3 立二级模型实验数据采用SPSS 3.统计分析软件进行回归分析样品处理在无菌生物安全柜内用燃烧的酒精棉球擦拭整..3 块鲜肉表面两次再用紫外线杀菌min 用无菌手模型的验证为了评价模型的可靠性采用建立的生长动力学模术刀剔除表面的肉将内部的肉分割成g(大小约型求得3 和22 的预测值与实际贮藏实验值比较 cm cm cm)的肉样放入无菌培养皿内将肉样采用准确因子(A f)和偏差因子(b f)来验证所建预测模型的 cm cm的两面再用紫外线各杀菌min 平板计数法可靠性[] Af和Bf分别表示为稀释倍检测肉样上的微生物未发现微生物生长. Af = 接种接种前使用生理盐水分别稀释大肠杆菌和假单胞菌 lg(npre/nobs) n () lg(npre/nobs) n (5) 的菌液混合菌液使大肠杆菌与假单胞菌的数量之比 Bf = 约为: 移液枪吸取2µL接种液在肉样cm cm的式中 N obs是实验实测值 N pre是采用预测模型得到两个面各均匀取9个点滴加µL接种液使肉样的细菌的与Nobs同一时间所对应的预测值 n是实验次数数约为(lg(CFU/g)).5 2 肉样贮藏和微生物计数结果与分析将盛有接种肉样的平皿表面包一层保鲜膜(氧气透过率.3cm3/(m2 h Pa) 水蒸气透过量 5g/(m2 h)) 2. 一级模型的构建选取中间温度3 和22 两个验证温度适时取出肉样用无菌剪刀剪碎倾入装有2mL无菌生理盐水的锥形瓶内摇床上充分振荡5min 梯度稀释平板计数法计数(营养琼脂培养基培养温度3 培养时间分别贮藏在 5 2 的低温生化培养箱内并 h) 每个温度做3个重复每个重复做3个平行数学模型的建立和验证一级模型的建立采用修正的Gompertz函数[9]拟合一级模型 N(t)=N (N max N ) exp{ exp[2.μ max/(n max N) (Lag t)] } () 式中 t为时间/h N(t)为t时所对应的微生物数量 (lg(cfu/g)) Nmax N为最大和初始微生物量(lg(CFU/g)) μmax为细菌的最大比生长速率/h Lag为细菌生长延滞时迭代法(Gauss iterative) 进行回归分析二级模型的建立为了描述温度对一级模型的生长动力学参数的影 [] 响采用Belehradek(平方根)模型描述实验数据采用Statistica.2统计分析软件采用高斯 c (2) 间/h µmax = bmaxµh(t Tminµ). b a 9.

3 . d 图 5 2 䌂㮣 ᑺ/ć (a) 5 (b) 2 (c)和 (d)条件下大肠杆菌和图2 假单胞菌的生长曲线 Fig. 9. μmax 23, Vol.3, No. 温度与最大比生长速率的关系 Temperature dependence of µmax Fig.2 Grown curves of Escherichia coli and Pseudomonas at, 5, 2 or 根据在 5 2 贮藏条件下大肠杆菌 /Lag 和假单胞菌在肉样上生长实验的实测值采用修正的 Gompertz函数拟合得到图生长曲线和如下方程式 Y = exp { exp[.59 (3. t )+ ]} 5 Y = exp { exp [.9 (3.2 t )+ ]} 2 Y =. +.9 exp { exp[. (.99 t )+ ]} Y = exp{ exp [.9 (.9 t )+ ]} 图3 表 2 䌂㮣 ᑺ/ć 5 2 贮藏条件下大肠杆菌和假单胞菌在温度与延滞期的关系 Temperature dependence of Lag Fig.3 猪背最长肌上的生长动力学参数 Table Kinetic parameters of Escherichia coli and Pseudomonas grown in longissimus dorsi muscle at, 5, 2 or 温度/ N(lg(CFU/g)) Nmax(lg(CFU/g)) Lag/h R 模型验证根据公式()和() 可分别求出3 和22 条件下大 μmax/h 由表可知修正的Gompertz方程能较好的拟合本研究中大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线在 5 2 贮藏条件下所得到的回归相关系数(R 2 )分别肠杆菌和假单胞菌在热鲜猪肉上的生长动力学参数μ max 和Lag 再将μ max和lag代入公式()中可得到大肠杆菌和假单胞菌在3 和22 条件下的生长预测曲线并由公式()和(5)得出Af分别为.23. Bf分别为.92.3(表2) 图 5分别为预测生长曲线和实测生长曲线的对比图可以直观的看出预测模型可以很好的预测大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线为和. 说明拟合效果较好表2 在 5 2 贮藏条件下的μ max 分别为.9 Table h Lag分别为 h 说明贮藏温度升高 μmax越大微生物生长速率越快同时Lag越小微生物生长的延滞时间越短和22 条件下大肠杆菌和假单胞菌生长预测值的Af和Bf Af and Bf of predicted values of Pseudomonas and Escherichia coli grown in pork at 3 or 22 验证温度/ 3 22 实验次数(n) Bf Af 二级模型的构建 9 µmax =.h(t +.3) () =.3h(T.3) Lag () 二级模型描述温度对一级模型的生长动力学参数的影响采用Belehradek(平方根)模型描述 [] 得到 Belehradek模型如下 ᅲ 乘由图2 3可知采用Belehradek模型能很好地描述温度对μmax和Lag的影响方程呈现良好的线性关系两个方程的回归相关系数(R2)值分别为.9和.923 图 Fig. 3 条件下的预测值与实测值 Growth curves predicted and observed at 3

4 9 23, Vol.3, No. 研究的µmax明显高于姜英杰等[]的实验结果而低于李苗云 9 等[]的结果呈现接种菌种种类越多 µmax越大的现象这可能主要与实验接种的混合菌种产生的群体感应有 5 3 ᅲ 乘关群体感应是指细菌通过分泌自诱导物信号分子进行胞表面或者细胞内的受体结合调节基因的表达协调交流当信号分子达到一定的浓度时可以与群体中细 2 图5 Fig.5 群体中所有细菌细胞的行为从而使细菌群体表现出单 22 条件下的预测值与实测值个细菌无法具有的生理功能或行为[] 细菌中常见的自 Growth curves predicted and observed at 22 诱导物信号分子有多肽(oligopeptide) 酰基高丝氨酸内酯 (acylated homoserine lactone AHL)和LuxS/Autoinducer-2 3 讨论 (AI-2) 它们介导的信号传递系统分别存在于革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌以及两类细菌之间[] 上述建模的鲜肉微生物行为是导致鲜肉腐败的主要原因之一温度是影响鲜肉腐败最重要的因素 [] 优势腐败菌之间的群体感应可能相互促进了生长[9-2] 有研究表明在不同的随着贮藏温度的升高细菌的延滞时间(Lag)从温度范围内鲜肉的优势腐败菌是不同的低温下假单 3.h下降到.9h 说明贮藏温度越高细菌生长胞菌是主要的优势腐败菌当温度超过时则是由其他细菌占据优势地位如大肠杆菌 [3] 同时国内已有大量关于大肠杆菌和假单胞菌预测模型的研究所以本研究选择假单胞菌及大肠杆菌作为研究对象建立大肠杆菌和假单胞菌混合预测模型一级模型使用修正的Gompertz模型函数[9] 能很好地拟合混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线在 5 2 条件下所得到的回归相关系数R 2 分别为和. 拟合效果非常好二级模型描述温度对μmax和Lag的影响采用Belehradek模型[]描述呈现良好的线性关系两个方程的回归相关系数(R2)值分别为.9和.923 的延滞时间越短对比姜英杰 []和李苗云 []等的实验结果前者建立的假单胞菌的生长预测模型显示 T= 时 Lag=2.22h T= 时 Lag=3.5h 大肠杆菌的生长预测模型显示 T= 时 Lag=29.9h T= 时 Lag=5.h 后者建立的预测模型显示 T= 时 Lag=.h T=2 时 Lag=.5h 而本研究的混合预测模型结果显示 T= 时 Lag=3.h T=5 时 Lag=3.2h T=2 时 Lag =.99h 本研究的Lag 明显比姜英杰等[]的实验结果短而比李苗云等[]的实验结果长基本呈现接种菌种种类越多 Lag越短的现象这可能主要与实验接种的混合菌种有关单一的优势腐模型的验证对于模型的建立和评价具有重要意义败菌不能快速适应周围的环境无法快速生长繁殖所为了验证模型的可靠性本研究采用建立的生长动力学以Lag较长在菌种种类较多的情况下鲜肉的优势定腐模型得到的预测值与实际在3 和22 条件下贮藏实败菌之间的群体感应可能促进了生长缩短了对外部环验值进行比较得到的动力学参数的A f 分别为.23. Bf分别为.92.3 表明采用Gompertz函数和境的适应时间所以Lag相对较短[2] Belehradek模型建立的优势腐败菌的预测模型具有较高的种来源和活性等实验条件和方法的差异也会导致µmax和可靠性和实用性 Lag存在一定的差异随着贮藏温度的升高细菌的µ max从.9h -上升到.h - 说明贮藏温度越高细菌生长速率越快在类似的实验方法下姜英杰等 [-5] 同时3组实验之间也存在初始接种量接种方式菌结论建立的单一的优势腐败菌假单胞菌及大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模型结果表明假单胞菌的生长预测模型显示 T= 时 µ max =.2h - T= 时 µ max =.5h - 大肠杆菌的生长预测模型显示 T= 时 µ max =.h - T= 时 µ max=.5h - 同时李苗云等 []建立的冷却肉的优势腐败菌的混合生长预测模型显示 T= 时 µmax=.3h- T=2 时 µmax=.h- 而本研究 - 中的混合预测模型结果显示 T= 时 µmax=.9h T=5 时 µmax=.h- T=2 时 µmax=.22h- 本采用修正的Gompertz函数拟合了 5 2 贮藏条件下的混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线回归相关系数(R 2 )分别为和. 拟合效果非常好采用Belehradek模型能很好地描述温度对μmax和Lag的影响两个方程的回归相关系数(R2)值分别为.9和.923 采用3 和22 两个验证温度下得到的实测值与预测值进行比较验证模型的可靠性 A f 分别为.23. Bf分别为.92.3 表明模型的可靠性较好

5 基础研究 23, Vol.3, No. 9 参考文献 : [] McDONALD K, SUN D W. Predictive food microbiology for the meat industry: a review[j]. International Journal of Food Microbiology, 999, 52(/2): -2. [2] MEMBR J M, LAMBERT R J W. Application of predictive modelling techniques in industry: from food design up to risk assessment[j]. International Journal of Food Microbiology, 2, (): -5. [3] MCMEEKIN T A, OLLEY J, RATKOWSKY D A, et al. Predictive microbiology: towards the interface and beyond[j]. International Journal of Food Microbiology, 22, 3: [] ROBERTS T A. Microbial growth and survival: developments in predictive modelling[j]. Food Technology, 99, 5: -9. [5] MCMEEKIN T A. Predictive microbiology: quantitative science delivering quantifiable benefits to the meat industry and other food industries[j]. Meat Science, 2, : -2. [] KAREN M V, ELS J D, JAN F V I. Predictive modeling of mixed microbial populations in food products: evaluation of two-species models[j]. Journal of Theory Biology, 2, : [] LEBERT I, ROBLES V O, LEBERT A. Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp. and Listeria in meat[j]. International Journal of Food Microbiology, 2, : [] 李苗云, 孙灵霞, 周光宏, 等. 冷却猪肉不同贮藏温度的货架期预测模型 [J]. 农业工程学报, 2, (): [9] ZWIETERING M H, JONGENBERGER I, ROMBOUTS F M, et al. Modeling of the bacterial growth curve[j]. Apply Environment Microbiology, 99, 5: 5-. [] RATKOWSKY D A, OLLEY J, McMEEKIN T A, et al. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures[j]. Journal of Bacteriology, 92, 9: -5. [] ROSS T. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[j]. Journal of Apply Bacteriology, 99, : 5-5. [] KOUTSOUMANIS K P, TAOUKIS P. Meat safety, refrigerated storage and transport: modeling and management[m]. UK: Wood Head/Publishing Ltd., : [3] KOUTSOUMANIS K P, SKANDAMIS P, NYCHAS G J E, et al. Development of a microbial model for the combined effect of temperature and ph on spoilage of ground meat, and validation of the model under dynamic temperature conditions[j]. Apply Environment Microbiology, 2, 2(): -3. [] 姜英杰. 假单胞菌和大肠杆菌在冷却猪肉中生长预测模型的建立 [D]. 南京 : 南京农业大学,. [5] 姜英杰, 邹晓葵, 彭增起. 大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模型的建立 [J]., 2, 29(): 5-9. [] 李苗云. 冷却猪肉中微生物生态分析及货架期预测模型的研究 [D]. 南京 : 南京农业大学, 2. [] WATERS C M, BASSLER B L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria[j]. Annu Rev Cell Dev Biol,, 2(): [] 陈林, 杨亮, 段康民. 从进化谈细菌细胞间的群体感应信号传递 [J]. 遗传, 2, 3(): 33-. [9] RAVN L, CHRISTENSEN A B, MOLIN S, et al. Methods for detecting acylated homoserine lactones produced by Gram-negative bacteria and their application in studies of AHL-production kinetics[j]. Journal of Microbiological Methods, 2, : [2] GRAM L, CHRISTENSEN A B, RAVN L, et al. Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods[j]. Apply Environment Microbiology, 999, 5: [2] 扈麟. 冷却猪肉腐败的细菌群体感应研究 [D]. 长沙 : 湖南农业大学, 2.

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Microsoft Word - 20120527-205_editing 1 大肠杆菌和假单胞菌在猪背最长肌上混合预测模型的建立 * 金鑫, 禹迎迎, 吴菊清, 徐幸莲, 周光宏 ( 南京农业大学, 教育部肉品加工与质量控制重点实验, 江苏南京 210095) 摘要 : 将大肠杆菌和假单胞菌混合接种到猪背最长肌上, 分