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贯札糜
7 years ago
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1 1 大肠杆菌和假单胞菌在猪背最长肌上混合预测模型的建立 * 金鑫, 禹迎迎, 吴菊清, 徐幸莲, 周光宏 ( 南京农业大学, 教育部肉品加工与质量控制重点实验, 江苏南京 ) 摘要 : 将大肠杆菌和假单胞菌混合接种到猪背最长肌上, 分别贮藏在和 25 下, 并做 13 和 22 两个验证温度结果表明 : 修正的 Gompertz 方程能很好地拟合大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线 ; 采用 Belehradek 模型能很好地描述温度对 μ ( 最大比生长速率 ) 和 Lag( 延滞时间 ) 的影响 ; 采用 13 和 22 两个验证温度验证模型的可靠性, 表明模型是可靠性的关键词 : 大肠杆菌 ; 假单胞菌 ; 混合 ; 预测 ; 模型中图分类号 :TS 文献标识码 :A 文章编号 : Establishment of mixed predictive model of Escherichia coli and Pseudomonas spp. in longissimus dorsi muscle JIN Xin,YU Ying-ying,Wu Ju-qing,XU Xing-lian,ZHOU Guang-hong * (Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing , China) Abstract:The longissimus dorsi muscle was inoculated by the mixture of Escherichia coli and Pseudomonas spp., and then packaged at 10, 15, 20 and 25 for storage. The test temperatures were 13 and 22. The results showed that growth curves of E. coli and Pseudomonas spp.at different temperatures could be well described by Gompertz model. The influence of temperature on growth rate (μ ) and lag phase (Lag) was well described by Belehradek model. Application the temperature of 13 and 22 tested the reliability of the model, the result showed that the model was reliable. Key words:escherichia coli; Pseudomonas; mixed; predictive; model 预测食品微生物学 (predictive food microbiology, PFM) 是一门建立在食品微生物学数学统计学和计算机科学基础上的新兴学科, 通过计算机技术对食品中微生物的延迟生长残存和死亡进行数量化的预测, 为食品行业提供数据库和软件包, 目的是在不进行传统微生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预测, 实现从原料到生产流通整个过程的计算机智能化管理和监控, 保证食品的质量和安全 [1-3] 传统的微生物检测技术一直依赖于对原材料及最终产品的微生物检验 [4], 不能很好的监测肉品在整个生产流通过程中的微生物变化规律微生物预测技术通过建立数学模型, 可以在不进行传统微生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预测可以高效的监测肉品在生产流通过程中的微生物安全问题, 保障肉品的质量和安全 [5] 肉类的菌相复杂, 且细菌之间存在复杂的群体感应现象, 单一优势腐败菌模型不能很好地反映肉 [6, 类真实的腐败情况目前, 国外已有很多混合预测模型的研究 7], 而国内大部分的预测模型主要还 [8] 是选用一种优势腐败菌或致病菌来建立预测模型李苗云等通过选用四种冷却肉的优势腐败菌建立动力学生长预测模型本研究选择鲜猪肉的主要优势腐败菌大肠杆菌和假单胞菌, 建立混合预测模型, 以期为将来的混合预测模型研究提供理论支持收稿日期 : 基金项目 : 国际合作项目食品质量安全控制技术研究 (2009DFA31770) 作者简介 : 金鑫 (1985 ), 男, 硕士研究生, 研究方向为肉类加工与安全 @qq.com * 通信作者 : 周光宏 (1960 ), 男, 教授, 博士, 主要从事肉品科学研究 ghzhou@njau.edu.cn 1

响 ; 采用 13 和 22 两个验证温度验证模型的可靠性, 表明模型是可靠性的关键词 : 大肠杆菌 ; 假单胞菌 ; 混合 ; 预测 ; 模型中图分类号 :TS251.

2 1 材料与方法 1.1 材料与仪器取宰后 4 h 内,pH 值为 5.8~6.2 的第 6~11 根肋骨处的三元猪猪背最长肌 ; 大肠杆菌和假单胞菌菌种均分离于猪肉 ; 营养琼脂, 北京陆桥技术有限公司 ; 所用常规化学试剂均为分析纯生物安全柜,SterilGARD 公司 ; 低温生化培养箱 ( 控温精度 ±0.1, 温度均匀度 ±1 ), 上海 STIK 设备有限公司 ; 1.2 菌种活化菌种在试验时分别接种活化三次以上, 得到活化的大肠杆菌和假单胞菌菌液 1.3 样品处理在无菌生物安全柜内用燃烧的酒精棉球擦拭整块鲜肉表面两次, 再用紫外线杀菌 25 min 用无菌手术刀剔除表面的肉, 将内部的肉分割成 25 g( 大小约 4 cm 4 cm 1 cm) 的肉样, 放入无菌培养皿内, 将肉样 4 cm 4 cm 的两面再用紫外线各杀菌 25 min, 平板计数法检测肉样上的微生物总数小于 1 lg (CFU/g) 1.4 接种接种前使用生理盐水分别稀释大肠杆菌和假单胞菌的菌液, 混合菌液, 使大肠杆菌与假单胞菌的数量之比约为 1:1, 移液枪吸取 200 µl 接种液, 在肉样 4 cm 4 cm 的两个面各均匀取 9 个点滴加 100 µl 接种液, 使肉样的细菌数约为 4 lg (CFU/g) 1.5 肉样贮藏和微生物计数将盛有接种肉样的平皿表面包一层保鲜膜 ( 氧气透过率 :14483 cm 3 /(m 2.24 h.atm), 水蒸气透过量 :54 g/(m 2.24 h)), 分别贮藏在和 25 的低温生化培养箱内, 并做 13 和 22 两个验证温度适时取出肉样, 用无菌剪刀剪碎, 倾入装有 225 ml 无菌生理盐水的锥形瓶内, 摇床上充分震荡 15 min, 梯度稀释, 平板计数法计数 ( 培养基 : 营养琼脂, 培养温度 :30, 培养时间 48 h) 每个温度做三个重复, 每个重复做三个平行 1.6 数学模型的建立和验证一级模型的建立 [9] 采用修正的 Gompertz 函数拟合一级模型 : N t N 0 N N 0 Exp Exp / N N 0 Lag t 1 (1) 式中 :t 为时间 (h);n(t) 为 t 时所对应的微生物数量 (lg CFU/g);N N 0 为最大和初始微生物量 (lg CFU/g);μ 为细菌的最大比生长速率 (h -1 );Lag 为细菌生长延滞时间 (h) 实验数据采用 Statistica 8.2 统计分析软件, 采用高斯迭代法 (Gauss iterative), 进行回归分析二级模型的建立 [10] 为了描述温度对一级模型的生长动力学参数的影响, 采用 Belehradek( 平方根 ) 模型描述 : b T T min (2) 1 blag T Tmin L (3) Lag 式中 :T 是培养温度 ( );T min 是一个假设概念, 指微生物没有代谢活动时的温度, 此时最大比生长速率为零 ;b 是方程的常数将公式 (1) 求得的 μ Lag 和对应的温度代入方程式 (2) 和 (3), 求得 bμ T min μ b Lag T minl 四个参数值, 建立二级模型实验数据采用 SPASS 13.0 统计分析软件, 进行回归分析模型的验证为了评价模型的可靠性, 采用建立的生长动力学模型求得 13 和 22 的预测值, 与实际贮藏试验值比较, 采用准确度 (Accuracy factor, A f ) 和偏差度 (Bias factor, B f ) 来验证所建预测模型的可靠 2

1, 温度均匀度 ±1 ), 上海 STIK 设备有限公司 ; 1.2 菌种活化菌种在试验时分别接种活化三次以上, 得到活化的大肠杆菌和假单胞菌菌液 1.

3 性 [11] A f 和 B f 分别表示为 : lg( N pre / N 0 bs ) A 10 n (4) f lg( N pre / N 0bs ) B 10 n (5) f 式中 :N obs 是试验实测值 ;N pre 是采用预测模型得到的与 N obs 同一时间所对应的预测值 ;n 是试验次数 2 结果与分析 2.1 一级模型的构建根据和 25 贮藏下, 大肠杆菌和假单胞菌在肉样上生长试验的实测值, 采用修正的 Gompertz 函数拟合大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线拟合的曲线如下 : N(t) 20 3

4 N(t) 图和 25 下大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线 Fig 1 Grown curves of Escherichia coli and Pseudomonas at 10, 15, 20 and 25 根据和 25 贮藏下, 大肠杆菌和假单胞菌在肉样上生长试验的实测值, 采用修正的 Gompertz 函数拟合得到如下方程式 : t 1 Y Exp Exp Y Exp Exp t 1 15 Y Exp Exp t 1 20 Y Exp Exp t 1 25 由表 1 可知, 修正的 Gompertz 方程能较好的拟合本研究中大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线, 在和 25 贮藏下所得到的回归相关系数 R 2 分别为和 1.000, 说明拟合效果较好在和 25 贮藏下的 μ 分别为和 (h -1 ),Lag 分别为和 1.490(h), 说明贮藏温度升高,μ 越大, 微生物生长速度越快, 同时 Lag 越小, 微生物生长的延滞时间越短表和 25 下大肠杆菌和假单胞菌在猪背最长肌上的生长动力学参数 Table 1 Kinetic parameter of Escherichia coli and Pseudomonas grown on longissimus dorsi muscle at 10, 15, 20 and 25 温度 ( ) N 0 (lg CFU/g) N (lg CFU/g) μ (h -1 ) Lag(h) R 二级模型的构建二级模型描述温度对一级模型的生长动力学参数的影响, 采用 Belehradek( 平方根 ) 模型描述 [10], 得到 Belehradek 模型如下 : T (6) 1 Lag T 由图 2 3 可以看出, 采用 Belehradek 模型能很好地描述温度对 μ 和 Lag 的影响, 方程呈现良好的线性关系, 两个方程的回归相关系数 R 2 值分别为和 (7) 4

023 Exp Exp 0.198 1.490 t 1 25 由表 1 可知, 修正的 Gompertz 方程能较好的拟合本研究中大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线, 在 10 15 20 和 25 贮藏下所得到的回归相关系数 R 2 分别为 0.998 0.999 0.995 和 1.

5 图 2 温度与最大比生长速率的关系 Fig 2 Temperature dependence of µ 图 3 温度与延滞期的关系 Fig 3 Temperature dependence of Lag 2.3 模型验证根据公式 (6) 和 (7), 可分别求出 13 和 22 下大肠杆菌和假单胞菌在热鲜猪肉上的生长动力学参数 μ 和 Lag, 再将 μ 和 Lag 代入公式 (1) 中可得到大肠杆菌和假单胞菌在 13 和 22 下的生长预测曲线, 并由公式 (4) 和 (5) 得出 A f 分别为 ,B f 分别为 ( 表 2) 图 4 5 分别为预测生长曲线和实测生长曲线的对比图, 可以直观的看出预测模型可以很好的预测大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线表 2 13 和 22 下大肠杆菌和假单胞菌生长预测值的准确因子和偏差因子 Table 2 A f and B f of predicted values of Pseudomonas and Escherichia coli grown on pork at 13 and 22 验证温度 ( ) 试验次数 (n) 偏差因子 (B f ) 准确因子 (A f )

公式 (4) 和 (5) 得出 A f 分别为 1.237 1.068,B f 分别为 0.926 1.

6 图 4 13 下的预测值与实测值 Fig 4 Grown curves of predicted and observed at 13 3 讨论图 5 22 下的预测值与实测值 Fig 5 Grown curves of predicted and observed at 22 微生物行为是导致鲜肉腐败的主要原因之一, 温度是影响鲜肉腐败最重要的因素 [12] 有研究表明在不同的温度范围内, 鲜肉的优势腐败菌是不同的, 低温下假单胞菌是主要的优势腐败菌, 当温度超过 25 时, 则是由其他细菌占据优势地位, 如大肠杆菌 [13], 同时, 国内已有大量关于大肠杆菌和假单胞菌预测模型的研究, 所以本研究选择假单胞菌及大肠杆菌作为研究对象, 建立大肠杆菌和假单胞菌混合预测模型一级模型使用修正的 Gompertz 模型函数 [9], 能很好地拟合混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线, 在和 25 下所得到的回归相关系数 R 2 分别为和 1.000, 拟合 [10] 效果非常好 ( 表 1) 二级模型描述温度对 μ 和 Lag 的影响, 采用 Belehradek 模型描述呈现良好的线性关系, 两个方程的回归相关系数 R 2 值分别为和模型的验证对于模型的建立和评价具有重要意义为了验证模型的可靠性, 本研究采用建立的生长动力学模型得到的预测值, 与实际在 13 和 22 下贮藏试验值进行比较, 得到的动力学参数的准确度分别为 , 偏差度分别为 ( 表 2), 表明采用 Gompertz 函数和 Belehradek 模型建立的优势腐败菌的预测模型具有较高的可靠性和实用性随着贮藏温度的升高, 细菌的最大比生长速率 (µ ) 从 h -1 上升到 h -1, 说明贮藏温度 [14, 15] 越高, 细菌生长速度越快在类似的试验方法下, 姜英杰等建立的单一的优势腐败菌假单胞菌及大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模型, 结果表明 : 假单胞菌的生长预测模型显示,T=10 时, µ =0.062,T=16 时,µ =0.154; 大肠杆菌的生长预测模型显示,T=10 时,µ =0.068,T=16 [16] 时,µ =0.154; 同时, 李苗云等建立的冷却肉的优势腐败菌的混合生长预测模型显示 :T=10 时, 6

大肠杆菌和假单胞菌预测模型的研究, 所以本研究选择假单胞菌及大肠杆菌作为研究对象, 建立大肠杆菌和假单胞菌混合预测模型一级模型使用修正的 Gompertz 模型函数 [9], 能很好地拟合混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲

7 µ =0.131,T=20 时,µ =0.486; 而本研究中的混合预测模型结果显示 :T=10 时,µ =0.119, T=15 时,µ =0.188,T=20 时,µ =0.228( 表 1) 本研究的 µ 明显高于姜英杰的试验结果而低于李苗云的试验结果, 呈现接种菌种种类越多,µ 越大的现象这可能主要与试验接种的混合菌种产生的群体感应有关群体感应是指细菌通过分泌自诱导物信号分子进行交流, 当信号分子达到一定的浓度时, 可以与群体中细胞表面或者细胞内的受体结合, 调节基因的表达, 协调群体中所有细菌细胞的行为, 从而使细菌群体表现出单个细菌无法具有的生理功能或行为 [17] 细菌中常见的自诱导物信号分子有多肽 (Oligopeptide) 酰基高丝氨酸内酯 (Acylated homoserine lactone, AHL) 和 LuxS/Autoinducer-2(AI-2), 它们介导的信号传递系统分别存在于革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌以及两类细菌之间 [18] [19, 上述建模的鲜肉优势腐败菌之间的群体感应可能相互促进了生长 20] 随着贮藏温度的升高, 细菌的延滞时间 (Lag) 从 h 下降到 h, 说明贮藏温度越高, 细 [14, 菌生长的延滞时间越短对比姜英杰和李苗云的试验结果 16], 姜英杰建立的假单胞菌的生长预测模型显示 :T=10 时,Lag=20.221,T=16 时,Lag=13.51; 大肠杆菌的生长预测模型显示 :T=10 时,Lag=29.189,T=16 时,Lag=5.607; 李苗云建立的预测模型显示 :T=10 时,Lag=7.640,T=20 时,Lag=1.750; 而本研究的混合预测模型结果显示 :T=10 时,Lag=13.871,T=15 时,Lag=3.662, T=20 时,Lag =1.991( 表 1) 本研究的 Lag 明显比姜英杰的试验结果短, 而比李苗云的试验结果长, 基本呈现接种菌种种类越多,Lag 越短的现象这可能主要与试验接种的混合菌种有关, 单一的优势腐败菌不能快速适应周围的环境, 无法快速生长繁殖, 所以 Lag 较长 ; 在菌种种类较多的情况下, 鲜肉的优势定腐败菌之间的群体感应可能促进了生长, 缩短了对外部环境的适应时间, 所以 Lag 相对较短 [21] 同时三组试验之间也存在初始接种量接种方式菌种来源和活性等试验条件和方法的差异, 也会导致 µ 和 Lag 存在一定的差异 4 结论采用修正的 Gompertz 函数拟合了和 25 下的混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线, 回归相关系数 R 2 分别为和 1.000, 拟合效果非常好采用 Belehradek 模型能很好地描述温度对 μ 和 Lag 的影响, 两个方程的回归相关系数 R 2 值分别为和采用 13 和 22 两个验证温度下得到的实测值与预测值进行比较, 验证模型的可靠性,A f 分别为 ,B f 分别为 , 表明模型的可靠性较好参考文献 : [1] MCDONALD K, SUN D-W. Predictive food microbiology for the meat industry: a review [J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 52(1-2): [2] MEMBR J M, LAMBERT R J W. Application of predictive modelling techniques in industry: From food design up to risk assessment [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 128(1): [3] MCMEEKIN T A, OLLEY J, RATKOWSKY D A, et al. Predictive microbiology: towards the interface and beyond [J]. International Journal of Food Microbiology, 2002, (73): [4] ROBERTS T A. Microbial growth and survival: developments in predictive modelling [J]. Food Technology, 1997(51): [5] MCMEEKIN T A. Predictive microbiology: Quantitative science delivering quantifiable benefits to the meat industry and other food industries [J]. Meat Science, 2007(77): [6] KAREN M V, ELS J D, JAN F V I. Predictive Modeling of Mixed Microbial Populations in Food Products: Evaluation of 7

号分子达到一定的浓度时, 可以与群体中细胞表面或者细胞内的受体结合, 调节基因的表达, 协调群体中所有细菌细胞的行为, 从而使细菌群体表现出单个细菌无法具有的生理功能或行为 [17] 细菌中常见的自诱导物信号分子有多肽

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