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约终
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1 冷藏秋刀鱼的菌相分析及其优势腐败菌的分离鉴定董文霞, 王欣 ( 上海理工大学食品质量与安全研究所, 上海 ) 摘要 : 冷藏秋刀鱼优势腐败菌的研究可为靶向抑菌, 延长货架期提供一定的参考论文利用传统培养的方法研究了冷藏 (4 ) 秋刀鱼的菌相变化分离与鉴定优势腐败菌并验证了其腐败能力结果表明, 秋刀鱼冷藏 6 d 后达到其货架期终点, 冷藏过程中共分离鉴定出 13 株细菌, 革兰氏阳性菌 7 株, 革兰氏阴性菌 6 株, 分属 7 个菌属根据各菌株在菌相中的比例变化及对灭菌鱼汁 TVB-N 值的影响, 可以确定菌株 13( 肠杆菌 ),12( 希瓦氏菌 ),7 9( 不动杆菌 ) 为冷藏秋刀鱼的优势腐败菌各株优势腐败菌对秋刀鱼挥发性盐基氮 (total volatile base nitrogen,tvb-n) 三甲胺(trimethylamine,TMA) 硫代巴比妥酸(the 2-2-thiobarbituric acid,tba) 的影响不同,12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 会加速样品 TMA 的产生,13 号菌株 ( 肠杆菌 ) 对样品的 TVB-N 值影响最大,7 号菌株 ( 不动杆菌 ) 则会促使样品的 TBA 值显著增大,9 号菌株 ( 不动杆菌 ) 对以上各指标也均具有一定的影响, 证明所确定的 4 株菌对冷藏秋刀鱼具有较强的腐败能力关键词 : 秋刀鱼 ; 冷藏 ; 菌相分析 ; 优势腐败菌 ; 腐败能力文章篇号 : (2016) DOI: /j.mfst Microflora Analysis and Preliminary Identification of Dominant Spoilage Bacteria in Refrigerated Cololabis saira DONG Wen-xia, WANG Xin (Institute of Food Safety and Quality, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai , China) Abstract: A deeper understanding of the dominant spoilage bacteria during storage will help develop methods to inhibit target bacteria, thus extending the shelf life of Cololabis saira. Changes in the bacterial phase of the bacteria causing spoilage of Cololabis saira stored at 4 C were investigated, the dominant spoilage bacteria were isolated and identified, and their spoilage potential was verified. The results showed that the shelf life of refrigerated Cololabis saira was six days. A total of 13 strains that belonged to seven genera, were isolated during refrigerated storage, including seven gram-positive and six gram-negative bacteria. Furthermore, according to the change in the proportion of each strain in the bacterial phase and their effects on the total volatile basic nitrogen (TVB-N) value of sterilized fish juice, Strains 13 (Enterobacter sp.), 12 (Shewanella sp.), 7, and 9 (Acinetobacter sp.) were identified. These bacteria had different influences on the TVB-N, trimethylamine (TMA) and 2-2-thiobarbituric acid (TBA) content of Cololabis saira. Strain 12 (Shewanella sp.) accelerated TMA generation, Strain 13 (Enterobacter sp.) showed significant influence on TVB-N value, Strain 7 (Acinetobacter sp.) significantly increased TBA content, while Strain 9 (Acinetobacter sp.) affected all three indicators. The results demonstrated that the four identified strains showed strong spoilage potential for Cololabis saira during refrigerated storage. Key words: Cololabis saira; refrigerated storage; analysis of bacterial phase; dominant spoilage bacteria; spoilage potential 秋刀鱼 (Cololabis saira) 又称作竹刀鱼, 主要洄游于西北太平洋中上层海域, 是一种重要的经济鱼类秋刀鱼肉质肥腻味道鲜美, 蛋白质和脂肪含量高于许多经济鱼类, 其中二十碳五烯酸 (Eicosapentaenoic 收稿日期 : 基金项目 : 国家科技支撑计划 (2013BAD13B00) 作者简介 : 董文霞 (1990-), 女, 在读硕士研究生, 研究方向 : 食品安全控制与检测通讯作者 : 王欣 (1975-), 女, 博士, 副教授, 研究方向 : 食品安全控制与检测 Acid,EPA) 二十二碳六烯酸(DryDocosahexaenoic Acid,DHA) 必需氨基酸和单不饱和脂肪酸含量丰富 [1], 是补充人体营养物质的理想食物来源, 近年来正越来越受到消费者的青睐但作为一种远洋捕捞鱼类, 秋刀鱼从捕捞到加工或直接销售都需要经过一段时间的贮藏, 在此过程中其品质易受到温度微生物酶机械损伤与化学污染等多种因素的影响, 使鲜度显著下降甚至发生腐败变质有研究表明, 在冻结温度以上, 不同水产品的特定腐败菌 (specific spoilage organisms,sso) 的活动是 139

2 其品质劣变的主要原因之一 [2] [3] 如 Zhang 和 YM 等的研究发现,4 条件下真空包装的鲤鱼的优势腐败菌为假单胞菌, 而气调包装后优势腐败菌则转变为肉 [4] 食杆菌和不动杆菌 Parlapani FF 等借助 16S rrna 分析了鲷鱼片经气调包装后在冷藏条件下的菌相变化, 发现莓实假单胞菌和铜绿假单胞菌是其优势腐败 [5] 菌 Mace S 等研究了冷藏条件下对虾的菌相变化, 发现对虾的 SSO 主要是希瓦氏菌和栖鱼肉杆菌 [6] Parlapani FF 等研究了熟制鲈鱼经空气和气调包装后在 2 冷藏时的菌相变化及挥发性物质的产生情况, 发现假单胞菌属和 H 2 S 产生菌是两种储藏方式中的 SSO 这些研究均说明, 分析水产品在特定贮藏条件下的菌相组成, 确定其 SSO, 可为采取针对性的保藏措施, 有效减缓其品质劣变, 延长其货架期提供一定的参考文献调研表明, 目前对于冷藏过程中秋刀鱼菌相变化的研究相对较少因此, 本文拟就 4 冷藏条件下秋刀鱼的菌相变化规律进行研究, 并对其优势腐败菌进行分离与鉴定, 为靶向抑制秋刀鱼的细菌性腐败变质, 延长货架期提供一定的依据 1 材料与方法 1.1 实验材料秋刀鱼捕获于西北太平洋, 体质量 (98.01±9.00) g, 体长 (24.97±0.96) cm 船上冻结后经-18 冷冻运输至实验室备用取 50 条秋刀鱼至 4 下自然解冻后去头去尾和去内脏, 所有实验用秋刀鱼取背部肌肉, 随机分装在保鲜袋中, 每袋约 20 g 培养基与试剂营养琼脂铁琼脂血琼脂 LB 培养基克氏双糖铁琼脂 (KIA) 革兰氏染液与氧化酶试纸, 购自青岛海博生物技术有限公司 ; 高氯酸氢氧化钠硼酸硅油消泡剂磷酸缓冲液三氯乙酸苦味酸盐酸三甲胺氧化镁硼酸和硫代硫酸钠均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司 ; 氧化三甲胺 Z- 半胱氨酸及 Z- 甲硫氨酸均为分析纯, 购于西格玛奥德里奇 ( 上海 ) 贸易有限公司仪器与设备 GHP-9080 型隔水式恒温培养箱, 上海一恒科学仪器有限公司 ;HRLM-80 立式蒸汽灭菌锅, 青岛海尔有限公司 ;VD-850 型桌上式洁净工作台, 苏州沪净净化有限公司 ;XW-80A 微型旋涡混合仪, 沪西分析仪器有限公司 ;KA-1000 型高速离心机, 上海安亭科学仪器厂 ;TC-24/H(b) 型基因扩增仪, 杭州博日科技有限公司 ;DYY-7C 型电泳仪, 北京市六一仪器厂 ; BCD-251WBSV 型立式冰箱, 青岛海尔股份有限公司 ; XSP-BM-2CA 型电子显微镜, 上海上光实业有限公司 ; UD 9100D 型紫外分光光度计, 北京莱伯泰科仪器股份有限公司 ;KDH-CD 型凯氏定氮仪, 上海新家仪器有限公司 ;HHS 21-8 恒温槽, 金坛市科析仪器有限公司 1.2 实验方法试验设计首先, 分析 4 贮藏过程中秋刀鱼的感官评分和菌落总数, 获知其冷藏期间的感官变化和货架期信息冷藏过程中每 2 d( 共 8 d) 进行菌株的分离纯化, 并计算同类型的菌落数占当天的比重 ; 对分离出的细菌进行革兰氏染色氧化酶等基本的生理生化实验后再进行 16S rrna 鉴定 ; 另外, 根据菌相中各菌株的比例变化, 及各株细菌对冷藏灭菌鱼汁 TVB-N 值的影响, 初步确定秋刀鱼的特定腐败菌进一步将确定的几株 SSO 回接至无菌鱼块, 测定冷藏条件下样品的 TVB-N TMA 和 TBA 值的变化情况, 比较细菌对鱼肉的腐败能力各细菌对冷藏灭菌鱼汁 TVB-N 值的影响 : 参照 [7] 许振伟等的方法制备秋刀鱼灭菌鱼汁将秋刀鱼先用无菌水清洗, 沥干后取背部鱼肉搅碎称取 1000 g 鱼肉加入 500 ml 蒸馏水, 煮沸 5 min 后过滤, 滤液备用将所得滤液 4000 r/min 离心 30 min, 再次过滤, 向滤液中加入 mol/l K 2 HPO mol/l 的 KH 2 PO 4 缓冲液和 0.1 mol/l 磷酸盐, 调节 ph 值至 6.6 每升鱼汁中加入 1.6 g 氧化三甲胺 (TMAO) 40 mg Z- 半胱氨酸和 40 mg 的 Z- 甲硫氨酸,121 灭菌 15 min 后存放于 4 条件下备用无菌吸取 0.05 ml 各菌株菌液 ( 浓度 10 6 CFU/mL) 加入到 100 ml 灭菌鱼汁中, 4 冷藏, 在 h 测定其 TVB-N 值, 以灭菌鱼汁为对照秋刀鱼 SSO 腐败能力的验证 : 秋刀鱼解冻后立即用 75% 的酒精进行表面杀菌, 去尾头及内脏, 取 20 g 背部肌肉, 并将其在浓度为 10 6 CFU/mL 的各确定的优势腐败菌的菌液中浸泡 10 s, 在无菌环境中沥干并分装在保鲜袋中所有样品 4 冷藏, 分别在 h 测定其 TVB-N TMA 和 TBA 值对照组为经表面杀菌后的鱼块分析方法感官评分 [8] 以 GB/T 冻鱼及 GB/T 鲜 [9] 海水鱼标准为参照, 综合考虑建立如表 1 所示的秋刀鱼的感官评定方法, 由 10 名感官评定人员从肌肉形态 140

3 色泽组织与气味等 4 个方面进行评分, 并根据各指标在秋刀鱼感官评价中的作用, 确定其权重分别为, 形态 0.20, 色泽 0.25, 组织 0.25, 气味 0.30, 总和为 1, 即权重集 X={a 1,a 2,a 3,a 4 }, 秋刀鱼感官评分指标综合评判集 Y=XR, 其中 X 为权重集,R 为模糊矩阵将评价结果的等级好较好一般和较差依次赋予分值和 4, 分别乘以模糊变换后综合评判结果的各个量, 并进行加和, 以此得出每个样品的总得分其中, 总得分 :8~10 分为一级鲜度 ;6~8 分为二级鲜度,6 分以下为不新鲜表 1 秋刀鱼感官评分方法 Table 1 Sensory evaluation of Cololabis saira 指标评价好 /10 分较好 /8 分一般 /6 分较差 /4 分形态肌肉切面微干, 有光泽肌肉切面稍湿, 略有光泽肌肉切面无光泽, 较湿肌肉切面无光泽, 很湿色泽色泽鲜亮, 秋刀鱼固有色, 微红色泽变暗, 从微红变成暗红色泽暗红, 周围有黄色汁液鱼块边缘部分肉质变黄组织致密完整, 富有弹性致密完整, 弹性略差不紧密, 但不松散肉质松散, 弹性基本消失气味鱼肉固有香味固有香味清淡出现轻微氨味腥臭味严重菌落总数测定参照 GB/T 食品微生物学检验: 菌落总数测定标准进行先称取 10 g 秋刀鱼样品置于 90 ml 无菌生理盐水中, 匀浆 3 min, 制成 1:10 的样品匀液, 继续以 10 倍梯度稀释, 根据前期预实验选择 3 个适宜稀释度的样品匀液, 吸取 0.1 ml 涂布于营养琼脂中,3 个平行 35 培养 2 d 后计数菌相分析在冷藏过程中, 每隔 2 d 选取菌落数在 30~300 的平板, 并观察菌落形态和镜检形态, 挑取单菌落平板划线, 同时对细菌进行分组和归类计数, 计算所分离细菌所占当天菌落总数的比例对分离出的细菌进行革兰氏染色氧化酶接触酶葡萄糖氧化发酵试验 S rrna 序列测定将分离纯化的细菌, 用基因组 DNA 提取试剂盒提取细菌 DNA, 细菌扩增的通用引物为 27f : 5 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3,1492r:5 -TAC GGYTACCTTGTTACGACTT-3 PCR 扩增条件 :95 预变性 5 min 后持续变性 30 s,45 退火 30 s,72 延伸 30 s, 共 30 个循环, 最后 72 延伸 30 s 纯化后的 16S rdna 序列由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序, 登陆 NCBI 网站进行同源性分析, 用 MEGA 6.0 构建系统发育树挥发性盐基氮 (total volatile base nitrogen, TVB-N) 的测定参照 GB/T 肉与肉制品卫生标准的分析方法中半微量定氮法测定结果表示为 10-2 mg/ml 鱼汁或 10-2 mg/g 鱼肉三甲胺 (trimethylamine,tma) 的测定参照 GB/T 火腿中三甲胺氮的测定结果表示为 10-2 mg/g 鱼肉硫代巴比妥酸值 (the 2-2-thiobarbituric acid, TBA) 的测定 [10] 参照谢晶等的方法称取 5.00 g 秋刀鱼背部肉切碎于离心管中, 加入质量分数为 20% 的三氯乙酸溶液 25 ml 和 20 ml 蒸馏水, 匀浆后静置 1 h 4000 r/min 离心 10 min 后过滤, 双蒸水定容至 50 ml 混匀取 5 ml 滤液加入同体积的硫代巴比妥酸溶液 (0.02 mol/l), 水浴 20 min 后流动水冷却, 再使用紫外分光光度计在 532 nm 处测吸光度值 A 空白样为蒸馏水, TBA 值 =A mg/g 数据处理与分析应用 SPSS 16.0 软件进行数据处理, 其中显著性分析分别用 t 检验和新复极差法检验 (p<0.05,p<0.01) 用 Origin 8.0 软件进行图形绘制, 应用 MEGA 6.0 进行细菌系统发育树的构建 2 结果与讨论图 1 秋刀鱼冷藏条件下感官评分和菌落总数的变化 (4 ) Fig.1 Sensory evaluation and aerobic bacterial count of Cololabis saira during refrigerated storage at 4 141

4 注 : 图中 * 表示差异显著 (p<0.05);** 表示差异极显著 (p<0.01) 2.1 秋刀鱼冷藏过程中感官评分和菌落总数的变化菌落总数和感官评分是评价秋刀鱼鲜度的重要指标秋刀鱼在冷藏过程中感官评分和菌落总数的变化如图 1 所示由图 1 可知, 秋刀鱼的感官评分总体呈下降趋势, 而菌落总数呈升高趋势, 说明在冷藏过程中样品的新鲜度不断下降具体而言, 秋刀鱼的初始菌落总数为 3.15 lg(cfu/g), 在冷藏的前 4 d, 秋刀鱼的菌落总数缓慢增长, 冷藏第 3 d 样品的菌落总数为 3.89 lg (CFU/g), 此时对应的感官评分为 8.20, 相对较高, 按照鲜海水鱼标准 [9], 当菌落总数 <4.00 lg(cfu/g) 时, 鱼肉为一级鲜度, 因此, 可认为冷藏第三天样品仍可达一级鲜度此后菌落总数显著增加 (p<0.05), 感官品质劣变亦明显加快, 冷藏第 6 d 时, 其菌落总数高达 7.77 lg(cfu/g), 感官评分为 5.50(p<0.01), 可 [11] 认为此时样品已达到货架期终点这与郭全友等研究中发现的大黄鱼在冷藏条件下货架期终点时菌落总数为 7.60 lg(cfu/g) 的结果相似 2.2 菌相分析初步分离及鉴定表 2 秋刀鱼中所分离的各菌株的基本特征 Table 2 Properties of the bacterial strains isolated from Cololabis saira 菌种编号菌落形态菌落颜色细菌形态革兰氏染色氧化酶接触酶葡萄糖 1 梭状土黄短杆圆形, 平滑淡黄球状圆形奶白细杆圆形奶白球状圆形, 凸起土黄色球状圆形微黄球状扁平奶白细杆圆形奶白球状圆形微红杆状圆形, 凸起浅黄球状圆形浅黄色短杆圆形, 湿润灰白色短杆圆形奶白色杆状在秋刀鱼的冷藏过程中, 各类微生物会表现出不同的生长特点在本研究 0~8 d 的冷藏过程中, 共从样品中分离出 120 株细菌, 根据菌落形态和显微镜检结果可将其归为 13 种, 其具体的菌落形态及生理生化检测结果见表 2 由表 2 可知, 所获得的 13 株菌株中,7 株为球菌 ( 菌株编号分别和 10 号 ), 其余均为杆菌 ; 革兰氏染色结果表明,7 株为革兰氏阳性菌 ( 和 10 号 ), 其余 6 株为革兰氏阴性菌 ( 及 13 号 ) 此外,1 11 和 12 号菌株氧化酶实验阳性, 其他均为阴性而除 4 和 10 号菌外, 其他菌株接触酶实验阳性, 说明这些菌株中均存在过氧化氢酶和 13 号为葡萄糖试验阳性, 说明其具备利用葡萄糖的能力 S rrna 鉴定结果将 13 株细菌的基因序列与 NCBI 中的基因总库进行比对, 选取其中最相似的序列构建系统发育树进行相似性分析, 结果如图 2 所示由图 2 可知, 所有序列与已知菌株序列的相似度均 98%, 说明鉴定结果可靠经分子生物学鉴定后 13 株菌株归属 7 大菌属 : 分别为, 不动杆菌属 ( Acinetobater sp, 菌株 7 和 9 ), 葡萄球菌属 (Stapylococus sp, 菌株 5 6 和 10), 罗氏菌属 (Rothia sp, 菌株 2 4 和 8), 希瓦氏菌属 (Shewanella sp, 菌株 12 和 11), 假单胞菌属 (Pseudomonas sp, 菌株 1), 芽孢杆菌属 (Bacillus sp, 菌株 3) 和肠杆菌属 (Enterobacter sp, 菌株 13) 有研究表明, 低温冷藏鱼类的主要菌相有不动杆菌腐败希瓦氏菌假单胞菌肠杆菌芽孢杆菌和乳酸菌等 [12], 本研究结果与该结论相符 142

5 图 2 13 株细菌的 16S rrna 序列系统发育分析 Fig.2 Phylogenetic analysis of 13 bacterial strains, based on 16S-rRNA sequence 2.3 冷藏过程中秋刀鱼的菌相变化及 SSO 的确定冷藏过程中秋刀鱼的菌相变化在秋刀鱼的冷藏过程中, 分别对细菌进行分组归类, 并计算得到特定菌株占菌落总数的比例, 具体菌相组成和变化情况如图 3 所示 (p<0.05), 菌相中比例较高的菌株分别为 12( 希瓦氏菌属,26.40%),13( 肠杆菌属,26.70%) 及不动杆菌属的 7 号 (11.50%) 和 9 号 (11.30%) 菌株总体来看, 在秋刀鱼的冷藏过程中, 革兰氏阴性菌对样品的腐败变质的影响相对较大 12 号菌株 ( 希瓦氏菌属 ) 在秋刀鱼整个冷藏过程中的菌相中比例相对较高, 而 13 号菌株 ( 肠杆菌属 ) 的比例则在冷藏过程中的增幅最大, 说明这两株菌均为秋刀鱼冷藏过程中的优势腐败菌, 而菌株 7 9 可称之为次优势腐败菌虽然有研究表明, 在有氧冷藏中, 寒带和温带海域捕获的鱼类优势腐败菌多为革兰氏阴性菌, 包括假单胞菌希瓦氏菌或肠杆菌等 [12], 但在本研究中, 假单胞菌属 ( 菌株 1) 在菌相中的比例却随着冷藏时间的延长而减少, 这说明假单胞菌不是导致冷藏秋刀鱼腐败的优势腐败菌不同菌株对冷藏灭菌鱼汁 TVB-N 的影响 TVB-N 是评价水产品新鲜度的重要指标, 为了进一步比较各菌株的致腐能力, 将获得的 13 株细菌分别接种至灭菌鱼汁中, 其在不同冷藏时间的 TVB-N 结果如图 4 所示图 4 不同菌株对冷藏灭菌鱼汁 TVB-N 的影响 (4 ) Fig.4 Changes in TVB-N value of sterilized fish juice during storage at 4 图 3 冷藏过程中秋刀鱼菌相的变化 (4 ) Fig.3 Changes in bacterial composition of Cololabis saira during refrigerated storage at 4 由图 3 可知, 冷藏初期革兰氏阴性菌占 75.10%, 革兰氏阳性菌占 24.90%, 此时比例相对较大的菌株为 12( 希瓦氏菌属,24.00%) 和 1( 假单胞菌属,18.12%), 次优势菌株为 13( 肠杆菌属,10.53%) 11( 希瓦氏菌属,7.52%) 和 7( 不动杆菌属,8.00%); 随冷藏时间的延长, 菌相组成逐渐发生改变, 菌株的比例逐渐上升, 而其余菌株的比例均逐渐下降 ; 至货架期终点 ( 第 6 d) 时, 革兰氏阴性菌比例升高至 87.70%, 而革兰氏阳性菌则显著降低至 12.30% 注 : 图中 * 表示差异显著 (p<0.05) 由图 4 可知, 不同菌株对灭菌鱼汁 TVB-N 值的影响有一定差异, 具体而言, 冷藏 48 h 时, 对照组 ( 灭菌鱼汁 ) 的 TVB-N 值仅为 2.17 mg/100 ml, 接种 7 9 ( 不动杆菌 ) 12( 希瓦氏菌 ) 和 13 号 ( 肠杆菌 ) 菌株的样品的 TVB-N 值则分别显著升高至 mg/ml(p<0.05), 而接种其余菌株的样品的 TVB-N 值与对照组无显著差异 (p>0.05); 冷藏 96 h 后, 对照组的 TVB-N 值达 mg/ml, 接种 13 号 ( 肠杆菌 ) 菌株的样品的 TVB-N 值已高达 mg/ml, 其次为 12 号 ( 希瓦氏菌 ) 菌株, 其相应的 TVB-N 值为

6 mg/ml, 接种 7 9( 不动杆菌 ) 的样品的 TVB-N 值也显著增大至 mg/ml, 均与对照组差异显著 (p<0.05) 这与中菌相变化情况相符, 说明对冷藏秋刀鱼而言,13( 肠杆菌 ) 和 12( 希瓦氏菌 ) 号菌株生长活跃且具有较强的腐败能力,7 9( 不动杆菌 ) 号菌株腐败能力次之 2.4 秋刀鱼 SSO 腐败能力验证优势腐败菌对冷藏鱼肉 TVB-N 的影响进一步分析冷藏秋刀鱼的优势腐败菌株 ( 和 9 号菌株 ) 对冷藏秋刀鱼肉 TVB-N 值的影响, 结果如图 5 所示优势腐败菌对冷藏鱼肉 TMA 的影响某些特定微生物会将鱼肉中的氧化三甲胺 (Trimethylaminen-oxide,TMAO) 还原成为 TMA, 使鱼肉产生腐臭味 TMA 值亦可指示鱼肉的新鲜程度 4 株优势腐败菌对冷藏秋刀鱼肉 TMA 值的影响如图 6 所示图 6 各优势腐败菌对冷藏鱼肉 TMA 值的影响 (4 ) Fig.6 Effect of the dominant spoilage bacteria on TMA content of Cololabis saira during storage at 4 注 : 图中不同字母间表示差异显著 (p<0.05) 图 5 各优势腐败菌对冷藏鱼肉 TVB-N 值的影响 (4 ) Fig.5 Effect of the dominant spoilage bacteria on TVB-N value of Cololabis saira during storage at 4 注 : 图中不同字母间表示差异显著 (p<0.05) 图 5 表明,4 株优势腐败菌均对冷藏秋刀鱼肉的 TVB-N 值有一定影响, 具体而言, 冷藏 48 h 时, 接种 4 株优势腐败菌的样品的 TVB-N 值均较对照组 ( mg/g) 显著增大 (p<0.05), 其中接种 13 号菌株 ( 肠杆菌 ) 的样品的 TVB-N 值最高, 为 mg/g, 而 7 号菌株 ( 不动杆菌 ) 与 12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 对样品的 TVB-N 值影响无显著区别 (p>0.05), 接种 9 号菌株 ( 不动杆菌 ) 对样品的 TVB-N 值影响小, 为 mg/g; 冷藏至 96 h 时, 各组样品的 TVB-N 值均相对升高, 规律与 48 h 时类似, 仍以 13 号菌株对样品的 TVB-N 值影响最大, 达到 mg/g,7 及 12 号菌株次之 TVB-N 值是由于水产品在微生物作用下, 导致蛋白质分解产生的氨及胺类等碱性含氮挥发性物质, 能够指示细菌对水产品中营养物质的代谢能 [5] 力如 MACE S 等的研究发现, 希瓦氏菌和栖鱼肉杆菌均可使冷藏对虾的 TVB-N 值显著升高本文中,4 株优势腐败菌均能促使鱼肉中蛋白质的分解, 使其 TVB-N 值升高, 且肠杆菌 (13 号 ) 对样品 TVB-N 值的影响最大,7( 不动杆菌 ) 和 12( 希瓦氏菌 ) 号次之, 9 号 ( 不动杆菌 ) 菌株的影响相对较弱由图 6 可知, 与对照组相比, 随时间延长,4 种优势腐败菌均使冷藏秋刀鱼肉的 TMA 值有一定升高 (p<0.05) 例如, 冷藏至 48 h 时, 对照组的 TMA 值为 mg/g, 而接种 12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 的样品的 TMA 值则已升至 mg/g, 其次是 7 和 9 号菌株 ( 不动杆菌 ), 相对而言,13 号菌株 ( 肠杆菌 ) 对样品 TMA 的影响最小, 为 mg/g; 冷藏至 96 h 时, 各组样品的 TMA 值继续增大, 希瓦氏菌 (12 号 ) 使秋刀鱼肉 TMA 值的增加最大, 结果说明这 4 株细菌均对鱼肉中 TMAO 还原成 TMA 有显著影响, 会加速鱼肉腐臭味的产生, 且 12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 在此过程中作 [13] 用最大钱韻芳等的研究亦发现腐败希瓦氏菌能促进凡纳滨对虾中 TMA 的产生, 加快其腐败变质优势腐败菌对冷藏鱼肉 TBA 的影响秋刀鱼为高脂鱼类, 其中不饱和脂肪酸含量较高 [1], 极易被氧化 TBA 是水产品中不饱和脂肪酸氧化降解产物丙二醛与硫代巴比妥酸试剂反应生成的稳定红色化合物, 可以反映脂肪氧化的程度 4 株优势腐败菌对冷藏秋刀鱼肉 TBA 值的影响如图 7 所示由图 7 可知,4 种优势腐败菌均使冷藏秋刀鱼肉的 TBA 值相对增大具体而言, 冷藏 48 h 时, 接种 12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 的样品的 TBA 值最大, 为 mg/g, 与对照组 ( mg/g) 差异显著 (p<0.05), 7 号 ( 不动杆菌 ) 和 13 号 ( 肠杆菌 ) 的影响次之, 而 9 号菌的影响较小 ; 冷藏至 96 h 时, 接种 7 号菌株 ( 不动杆菌 ) 样品的 TBA 值则与对照组差异最显著 (p<0.05), 144

7 达到了 mg/g, 接种 12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 的 TBA 值的影响来看,12 号菌株 ( 希瓦氏菌 ) 对样品样品的 TBA 值仍相对较高, 为 mg/g, 另外两 TMA 的影响最大,13 号菌株 ( 肠杆菌 ) 对样品的 TVB-N 种菌株与 48 h 时的规律类似综合而言,7 号 ( 不动杆值影响最大,7 号菌株 ( 不动杆菌 ) 对样品的 TBA 值菌 ) 及 12 号细菌 ( 希瓦氏菌 ) 对冷藏秋刀鱼肉中脂肪影响最大,9 号菌株 ( 不动杆菌 ) 对以上各指标的影氧化的影响相对较大响稍小证明这 4 株菌是冷藏秋刀鱼的特定优势腐败菌 3.5 研究为后期靶向抑制冷藏秋刀鱼的优势腐败菌, 延长货架期可提供一定的理论基础参考文献 [1] 叶彬清, 陶宁萍, 王锡昌. 秋刀鱼肌肉营养成分分析及评价 [J]. 营养学报,2014,36(4): YE Bin-qing, TAO Ning-ping, WANG Xi-chang. Analysis and evaluation of nutritional composition of cololabis saira muscle 图 7 各优势腐败菌对冷藏鱼肉 TBA 值的影响 (4 ) Fig.7 Effect of the dominant spoilage bacteria on TBA content of Cololabis saira during storage at 4 注 : 图中不同字母间表示差异显著 (p<0.05) 3 结论本文分析了冷藏条件下秋刀鱼感官变化和菌落总数变化, 分离并鉴定了冷藏过程的各菌株, 分析了冷藏过程中菌相的变化及各菌株对灭菌鱼汁 TVB-N 值的影响, 确定了优势腐败菌 ; 进而比较了各优势腐败菌对秋刀鱼肉的腐败能力, 具体结论如下 : 冷藏条件下, 秋刀鱼的菌落总数逐渐增大而感官评分显著降低, 冷藏第 5 d 时, 菌落总数为 6.60 Lg (CFU/g), 感官评分为 6 分, 而冷藏第 6 d 时, 秋刀鱼菌落总数为 7.77 Lg(CFU/g), 感官评分为 5.5 分, 可认为 4 冷藏秋刀鱼在第 6 d 时达到货架期终点 3.2 冷藏过程中共分离鉴定出 13 种细菌, 革兰氏阳性菌 7 株, 革兰氏阴性菌 6 株 ; 分属 7 个菌属, 不动杆菌属 2 株 (Acinetobater sp, 菌株 7 和 9), 葡萄球菌属 3 株 (Stapylococus sp, 菌株 5 6 和 10), 罗氏菌属 3 株 (Rothia sp, 菌株 2 4 和 8); 希瓦氏菌属 2 株 (Shewanella sp, 菌株 12 和 11), 假单胞菌属 1 株 (Pseudomonas sp, 菌株 1) 芽孢杆菌属 1 株 (Bacillus sp, 菌株 3) 和肠杆菌属 1 株 (Enterobacter sp, 菌株 13) 3.3 在秋刀鱼冷藏期间, 菌株 13( 肠杆菌 ),12( 希瓦氏菌 ),7 和 9( 不动杆菌 ) 在微生物菌相中的比例逐渐增大, 且接种这四株菌可使灭菌鱼汁的 TVB-N 值显著增大, 说明这几个菌株生长活跃且具有较强的腐败能力, 是冷藏秋刀鱼的优势腐败菌 3.4 从 4 株优势腐败菌对秋刀鱼 TVB-N 值 TMA 值 [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 2014, 36(4): [2] Mace S, Cornet J, Chevalier F, et al. Characterisation of the spoilage microbiota in raw salmon (Salmo salar) steaks stored under vacuum or modified atmosphere packaging combining conventional methods and PCR-TTGE [J]. Food Microbiology, 2012, 30(1): [3] Zhang Y M, Li Q, Li D P, et al. Changes in the microbial communities of air-packaged and vacuum-packaged common carp (Cyprinus carpio) stored at 4 [J]. Food Microbiology, 2015, 52(5): [4] Parlapani F F, Kormas K A, Boziaris I S. Microbiological changes, shelf life and identification of initial and spoilage microbiota of sea bream fillets stored under various conditions using 16S rrna gene analysis [J]. J. Sci. Food Agr., 2015, 95(12): [5] Mace S, Cardinal M, Jaffres E, et al. Evaluation of the spoilage potential of bacteria isolated from spoiled cooked whole tropical shrimp (Penaeus vannamei) stored under modified atmosphere packaging [J]. Food Microbiology, 2014, 40(4): 9-17 [6] Parlapani F F, Haroutounian S A, Nychas G J, et al. Microbiological spoilage and volatiles production of gutted European sea bass stored under air and commercial modified atmosphere package at 2 [J]. Food Microbiology, 2015, 50(7): [7] 许振伟, 李学英, 杨宪时, 等. 冷藏鲤鱼和罗非鱼优势腐败菌腐败能力分析 [J]. 食品科学, 2012,33(4): XU Zhen-wei, LI Xue-ying, YANG Xian-shi, et al. Analysis of spoilage ability of dominant spoilage bacteria from stored chilled cyprinus carpio and oreochromis niloticus [J]. Food Science, 2012, 33(4):

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生物工程食品科学 20, Vol. 31, No 新的思路 [4] 郭全友等对冷藏东海暖水海域养殖大黄鱼进行研究, 货架期终点时腐败希瓦氏菌比例达 86%, 其次是假单胞菌, 表明腐败希瓦氏菌和假单胞菌是低温贮藏大黄鱼的优势腐败菌李学英等对大黄鱼腐败希瓦氏菌腐败能力进行了初步分析

生物工程食品科学 20, Vol. 31, No 新的思路 [4] 郭全友等对冷藏东海暖水海域养殖大黄鱼进行研究, 货架期终点时腐败希瓦氏菌比例达 86%, 其次是假单胞菌, 表明腐败希瓦氏菌和假单胞菌是低温贮藏大黄鱼的优势腐败菌李学英等对大黄鱼腐败希瓦氏菌腐败能力进行了初步分析 118 20, Vol. 31, No. 23 食品科学生物工程许振伟 1,2, 许钟 1, 杨宪时 1, *, 郭全友 1, 李学英 1 (1. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 200090;2. 上海海洋大学食品学院, 上海 201306) : 通过分析接种腐败菌的大黄鱼无菌鱼块在贮藏中的感官腐败代谢产物和腐败菌的变化, 以腐败菌生长动力学参数和腐败代谢产物产量因子 (YTVB-N/CFU