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1 17 1, Vol.37, No.3 食品科学生物工程冷藏海鲈鱼优势腐败菌的筛选和鉴定唐文静, 王楚文, 柳云龙, 宁喜斌 * ( 上海海洋大学食品学院, 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 13) 摘要 : 分离鉴定冷藏条件下海鲈鱼的优势腐败菌, 通过选择性培养基筛选获得单一菌株, 对各菌株进行致腐能力的测定, 确定冷藏海鲈鱼的优势腐败菌对冷藏海鲈鱼的优势腐败菌进行菌落形态观察及部分生理生化实验 1S rdna 分子鉴定结果表明, 有株冷藏海鲈鱼优势腐败菌, 其中 1 株为草莓假单胞菌 (Pseudomonas fragi), 1 株为腐败希瓦氏菌 (Shewanella putrefaciens), 其余株为假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 在冷藏条件下, 草莓假单胞菌的致腐能力最强, 其次是腐败希瓦氏菌和假单胞菌关键词 : 海鲈鱼 ; 冷藏 ; 优势腐败菌 ; 分离 ; 鉴定 Isolation and Identification of Specific Spoilage Organisms in Chilled Sea Bass TANG Wenjing, WANG Chuwen, LIU Yunlong, NING Xibin* (Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 13, China) Abstract: The specific spoilage organisms (SSOs) were isolated and identified from chilled sea bass under refrigerated condition. These SSOs were individually isolated using selective medium and their spoilage ability was analyzed. These isolates were identified based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 1S rdna sequence analyses. The results showed there were SSOs present in chilled sea bass, including one Pseudomonas fragi, one Shewanella putrefaciens, and two Pseudomonas sp.. In refrigerated condition at, the spoilage ability of Pseudomonas fragi was the highest, followed by Shewanella putrefaciens and Pseudomonas sp.. Key words: sea bass; chilled; specific spoilage organism; isolation; identification DOI:1.75/spkx 中图分类号 :TS5. 文献标志码 :A 文章编号 :1-3(1) 引文格式 : 唐文静, 王楚文, 柳云龙, 等. 冷藏海鲈鱼优势腐败菌的筛选和鉴定 [J]. 食品科学, 1, 37(3): DOI:1.75/ spkx TANG Wenjing, WANG Chuwen, LIU Yunlong, et al. Isolation and identification of specific spoilage organisms in chilled sea bass[j]. Food Science, 1, 37(3): (in Chinese with English abstract) DOI:1.75/spkx 鱼类在栖息捕捞贮运加工等过程中受到微生物的污染, 腐败微生物在鱼体上生长繁殖是引起鱼肉腐败变质的主要原因, 鱼类的货架期受此影响而大大缩短 [1] 为了抑制腐败微生物的活动, 目前应用较为广泛的保鲜方法是冷藏但是, 鱼类在冷藏过程中依然深受优势腐败菌 (specific spoilage organism,sso) 的影响, 鱼体上 SSO 的生长繁殖主导着鱼肉腐败变质的程度 [] 因此, 对冷藏鱼肉中 SSO 的确定, 并进行靶向抑制对研究鱼肉保鲜显得尤为重要 [3] 经研究发现, 鱼类的栖息环境和贮运条件影响着鱼体上 SSO 的组成和变化, 在有氧冷藏条件下贮藏的鲜鱼 SSO 主要为希瓦氏菌 (Shewanella) 和 ( 或 ) 假单胞菌 (Pseudomonas spp.) [] 海鲈鱼是我国沿海地区均产的一种重要的经济鱼类 [5], 不仅肉质细腻鲜美少有鱼骨, 且具有较高的营养价值 [] 随着海鲈鱼产量的逐年提升, 依靠活鱼销售的方式已经远远不能适应市场的需求, 因此海鲈鱼在保鲜方面的研究显得尤为重要, 然而目前相关研究还尚少 [7], 对冷藏海鲈鱼中 SSO 的研究也鲜有报道鱼类 SSO 的筛收稿日期 : 基金项目 : 上海市科委工程中心建设项目 (11DZ3) 作者简介 : 唐文静 (199 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品微生物 wenjing_@13.com * 通信作者 : 宁喜斌 (19 ), 男, 教授, 博士, 研究方向为食品微生物食品安全 xbning@shou.edu.cn

2 生物工程食品科学 1, Vol.37, No 选及鉴定的传统方法是使用各种选择性培养基筛选和生理生化实验的鉴定, 随着检测技术的发展, 研究人员开始使用分子检测技术检测鉴定鱼类的 SSO Lan Weiqing [] 等利用聚合酶链式反应 - 变性梯度凝胶电泳 (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,pcr- [9] DGGE) 检测了在有氧包装条件下带鱼的 SSO;Macé 等利用时间温度梯度凝胶电泳 (temporal temperature gradient gel electrophesis,ttge) 检测了在不同温度条件下使用气 [1] 调包装大马哈鱼的 SSO;Wilson 等使用了 PCR- 限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 检测了鳕鱼在不同季节不同水域里的 SSO 本研究通过使用选择性培养基和测定菌株的致腐能力确定冷藏海鲈鱼的优势腐败菌, 利用菌落形态观察及部分生理生化实验 1S rdna 分子鉴定对冷藏海鲈鱼优势腐败菌进行鉴定本实验可为冷藏海鲈鱼的腐败机理抑制冷藏海鲈鱼的腐败冷藏海鲈鱼的保鲜研究提供依据 1 材料与方法 1.1 材料与培养基海鲈鱼 (.~. kg/ 尾 ), 购于上海铜川路水产批发市场假单胞菌选择性 CFC 琼脂培养基铁琼脂培养基结晶紫胆盐葡萄糖中性红琼脂 (VRBGA) 培养基 MRS 琼脂培养基山东青岛海博生物技术有限公司 1. 试剂与仪器营养肉汤 MgO 硼酸盐酸( 均为分析纯 ) 国药集团化学试剂有限公司 ;Ezup 柱式基因组 DNA 抽提试剂盒生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 Kjeltec3 凯氏定氮仪丹麦 FOSS 公司 1.3 方法菌落的分离和纯化将鲜活海鲈鱼冰猝致死, 放置于条件下冷藏至腐败, 于无菌条件下称取 5. g 腐败鱼肉充分研磨, 加入 5 ml 无菌生理盐水中摇匀制成样品菌悬液, 进行梯度稀释, 选取适宜的稀释度吸取.1 ml 于各选择性培养基平板上均匀涂布, 假单胞菌选择性 CFC 琼脂培养基平板铁琼脂培养基平板和 VRBGA 培养基平板分别置于 3 37 条件下培养,MRS 琼脂培养基平板置于 37 条件下厌氧培养, 均培养 ~ h 挑选各典型菌落, 反复进行平板划线, 得到纯化的单菌落后保存 1.3. 优势腐败菌的筛选对各菌株进行致腐能力的测定以确定冷藏海鲈鱼的优势腐败菌, 致腐能力的测定由感官评定和挥发性盐基氮 (TVB-N) 含量的测定组成将保存的各菌株活化后分别制成菌悬液, 通过预实验涂平板确定菌浓度, 调整菌浓度为 1 5 ~1 CFU/mL 将无菌海鲈鱼块浸入各菌株的菌悬液中 1 s 后取出, 置于无菌培养皿中, 于条件下冷藏, 分别在 d 后进行感官评定, 确定疑似优势腐败菌将疑似优势腐败菌活化后分别制成菌悬液, 通过预实验涂平板确定菌浓度, 调整菌浓度为 1 5 ~ 1 CFU/mL 将无菌海鲈鱼块浸入各疑似优势腐败菌株的菌悬液中 1 s, 取出置于无菌培养皿中, 放于条件下冷藏, 在 d 时测定 TVB-N 含量, 确定优势腐败菌无菌鱼块的制备海鲈鱼去鳞去内脏清净后, 于无菌条件下, 用无菌水冲洗, 用 75% 酒精擦拭鱼体, 用无菌解剖刀切取背脊部内部无污染鱼肉, 保持鱼块大小厚度基本一致, 每块无菌鱼块为 5 g 左右 [11-1] 1.3. 感官评定选择 5 名经培训的感官评定员, 对鱼块的外观和气味进行评价, 感官评定标准如表 1 所示 [13-1] 表 1 感官评定标准 Table 1 Sensory analysis standards 指标新鲜 (1 分 ) 不新鲜 ( 分 ) 腐败 (3 分 ) 严重腐败 ( 分 ) 外观气味黏液稀薄而透明, 色泽鲜亮有鱼腥味, 蒸后有鱼香味黏液增多并稍显混浊, 色泽暗淡无鱼腥味, 蒸后无鱼香味黏液浓稠并混浊, 色泽消失有酸腐味, 蒸后有腐臭味黏液变稀薄但严重混浊, 无色泽有浓重的酸腐味, 蒸后有浓重的腐臭味 TVB-N 含量的测定使用 Kjeltec3 凯氏定氮仪进行测定, 方法参考 FOSS 应用子报 [15] 以 g/l 硼酸为吸收液,.1 mol/l 盐酸滴定, 精确称取 5 g 左右碾碎样品于到 75 ml 的蒸馏管中, 加入 1 g MgO 和少许去离子水, 连接到定氮仪进行测定 [1] 1.3. 优势腐败菌的形态特征和生理生化特征鉴定对优势腐败菌的单菌落进行形态特征观察和生理生化特征鉴定生理生化实验根据伯杰氏系统细菌学手册 [17] 和常见细菌系统鉴定手册 [1] 选择鉴定项目具体生理生化实验方法参照现代细菌学培养基和生化试验手册 [19] 优势腐败菌的分子生物学鉴定将各优势腐败菌培养至对数期, 使用 Ezup 柱式基因组 DNA 抽提试剂盒提取各菌株的总 DNA, 作为 1S rdna 序列扩增反应模板 PCR 扩增细菌的 1S rdna 基因,PCR 体系为引物 7f (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 19r (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ) 和模板各 1 μl, Master Mix 1.5 μl,ddh O 9.5 μl PCR 反应程序 :

3 17 1, Vol.37, No.3 食品科学生物工程 9 预变性5 min 9 变性1 min 55 退火1 min 将冷藏海鲈鱼疑似优势腐败菌制 7 延伸 min 完成3 个循环最后7 延伸5 min 成菌悬液接种于无菌海鲈鱼块上研究冷藏时间对接种保存取5 μl 1S rdna 扩增产物进行1%的琼脂糖疑似优势腐败菌的海鲈鱼块TVB-N含量的影响结果凝胶电泳检验将PCR扩增产物送至生工生物工程上见图根据GB/T 11 鲜海水鱼 []规定海股份有限公司测序使用美国国家生物技术信息中心 National Center for Biotechnology Information 鲜海水鱼的TVB-N含量 15 mg N/1 g为一级品 TVB-N含量 mg N/1 g为二级品 TVB-N含量 NCBI 中的BLAST对各菌株序列分析比对选取同源性 3 mg N/1 g为三级品在99%以上的菌株序列利用MEGA.5软件进行多重序.1 TVB-Nਜ਼䟿/ mg N/1 g 列对比并构建Neighbor-Joining系统发育树[-1] 结果与分析优势腐败菌的分离样品通过稀释涂布平板和平板划线分离方法在假单胞菌选择性CFC琼脂培养基平板上依据菌落形态不同分离出5 株菌编号为P1 P5 铁琼脂培养基平板上依图 ሩ ߧ㯿䰤/d 冷藏时间对接种疑似优势腐败菌的海鲈鱼块TVB-N含量的影响 Fig. Effect of refrigeration time on TVB-N value of sea bass piece 据菌落形态不同分离出1 株菌编号为结晶紫胆盐 inoculated with suspected dominant spoilage bacteria 葡萄糖中性红琼脂培养基平板上依据菌落形态不同分离出菌落形态各异的株菌编号为V1 V MRS琼脂培由图可知冷藏第天时接种菌株鱼块的TVB-N含量极显著 P.1 大于对照鱼养基平板上依据菌落形态不同分离出菌落形态各异的株块分别为 mg N/1 g 菌编号为L1 L 冷藏第天时接种菌株鱼块的TVB-N含量迅速上. 将上述1 株菌活化后制成菌悬液分别接种到无菌海升为11.19 mg N/1 g 冷藏第天时接种菌株鱼块的TVB-N含量极显著 P.1 鲈鱼块上研究冷藏时间对接种各菌株的海鲈鱼块感官高于对照鱼块远远超过标准规定且接种菌株鱼块评定的影响结果见图1 实验组的感官评定分值均比对的TVB-N含量最高其次是接种菌株的鱼优势腐败菌的腐败特性照组低其中接种菌株鱼块的感官评分均极显著 P.1 低于接种其他株菌的鱼块冷藏第天时接种菌株和的鱼块的感官评分均极显著 P.1 下降冷藏第天时接种菌株块经对比分析确定菌株为冷藏海鲈鱼的优势腐败菌.3 优势腐败菌的鉴定.3.1 优势腐败菌的形态特征及生理生化鉴定观察冷藏海鲈鱼的株优势腐败菌的形态特征并和的鱼块的感官评分均极显著 P.1 低于进行生理生化实验根据伯杰氏系统细菌学手册 [17]和其他接种菌株的鱼块接种菌株的鱼块的感官评分最常见细菌系统鉴定手册 [1]判定结果结果见表低为.7 分其次是接种菌株的鱼块为.7 分经对比分析确定菌株为冷藏海鲈鱼的表 Table 冷藏海鲈鱼的优势腐败菌的形态特征及生理生化特征 Morphological and physiological characteristics of dominant 疑似优势腐败菌 ሩ P1 ᝏᇈ䇴 spoilage bacteria in chilled sea bass 图1 Fig.1 ߧ㯿䰤/d P5 V1 V L1 L 冷藏时间对接种各菌株的海鲈鱼块感官评定的影响 Effect of refrigeration time on sensory analysis of sea bass piece inoculated with various bacteria 特征铜绿假单胞菌腐败希瓦氏菌革兰氏染色细菌形状芽孢染色氧化酶实验接触酶实验精氨酸双水解酶鸟氨酸脱羧酶阿拉伯糖山梨糖醇产HS实验明胶液化杆状杆状注. 结果为阳性. 结果为阴性

4 食品科学生物工程.3. 3 优势腐败菌的分子鉴定利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测株冷藏海鲈鱼优势腐败菌的1S rdna扩增产物均得到特异性条带片段大小为1 5 bp左右电泳图谱如图3所示 Marker 1, Vol.37, No 结论与讨论本研究得出冷藏海鲈鱼的优势腐败菌主要为假单胞菌和腐败希瓦氏菌与其他相关研究结果相似蓝蔚青等 [3]对冷藏鲳鱼贮藏期间的细菌种群变化进行了研究研究发现荧光假单胞菌与腐败希瓦氏菌为鲳鱼冷藏期间的优势腐败菌崔正翠等[]研究了冷藏大菱鲆细菌组成 bp 变化和优势腐败菌结果表明在 1 冷藏过程中大菱 1 bp 鲆的优势腐败菌是腐败希瓦氏菌其次是假单胞菌郭 75 bp 全友等 [5]对冷藏罗非鱼优势腐败菌进行了鉴定确定了 5 bp 假单胞菌为 1 贮藏罗非鱼的优势腐败菌本课题组将对冷藏海鲈鱼分离出的优势腐败菌进行深入研究探索各优势腐败菌的特征及抑制生长方法为冷藏海鲈鱼图3 Fig.3 株冷藏海鲈鱼优势腐败菌的1S rdna电泳图谱的保鲜作参考本研究从腐败冷藏海鲈鱼肉中获得1 株形态各异的 Electropherogram of 1S rdna genes from four dominant spoilage bacteria in chilled sea bass 菌株经过菌株致腐能力测定确定菌株为将冷藏海鲈鱼的株优势腐败菌未纯化1S rdna扩冷藏海鲈鱼的优势腐败菌在冷藏条件下优势腐败增产物送检测序后使用NCBI的BLAST分析选取同源性在99%以上的菌株序列利用MEGA.5软件进行多重菌的致腐能力最强其次是优势腐败菌优势腐败菌的致腐能力最弱对冷藏海鲈鱼的优势腐败菌序列对比构建Neighbor-Joining系统发育树细菌系统发育树见图菌株与Pseudomonas sp.亲缘关系最进行1S rdna分子鉴定菌落形态观察及部近菌株与Pseudomonas fragi亲缘关系最近菌株与Shewanella sp.亲缘关系最近假单胞菌 1 株草莓假单胞菌和1 株腐败希瓦氏菌分生理生化实验鉴别得到株优势腐败菌分别为株参考文献 9 Pseudomonas sp. HC- JF [1] Pseudomonas fragi JCM 51 AB533.1 Pseudomonas fragi strain CPO. KF j.issn [] Shewanella putrefaciens NBRC 399 AB1.1 1 Shewanella baltica strain KJ-W19 JQ Shewanella sp. Mac KC 图 Fig. 基于1S rdna序列同源性的株优势腐败细菌系统发育树 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria based on 1S rdna sequences 结合株优势腐败菌的菌落形态及部分生理生化 DOI:1.11/S95-19()39-9. [3] [] 许振伟, 许钟, 杨宪时, 等. 鱼类腐败菌腐败能力测定方法[J]. 食品科学, 1, 31(): [5] 王慧敏, 王庆丽, 朱军莉. 鲈鱼在微冻贮藏下品质及优势腐败菌的变化[J]. 食品工业科技, 13, 3(): [] 邓锦锋, 王安利, 周初霞, 等. 鲈鱼的营养研究进展[J]. 饲料工业,, 7(1): 59-. DOI:1.399/j.issn X [7] 曾名勇, 黄海. 鲈鱼在微冻保鲜过程中的质量变化[J]. 中国水产科学, 1, (): 7-7. DOI:1.331/j.issn: [] LAN Weiqing, XIE Jing. Characterization of the dynamic changes of microorganisms in cutlassfish (Trichiurus haumela) under the cold storage with composite natural preservatives based on culturedependent and 1S rrna-dgge technology[j]. Advanced Materials 菌属 Pseudomonas sp. 其中菌株为草莓假单 Shewanella putrefaciens 故株优势腐败菌分别为 Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas fragi Shewanella putrefaciens 章志超, 桂萌, 李平兰. 鱼源特定腐败菌及其应用研究进展[J]. 肉类研究, 1, (3): 5-3. DOI:1.399/j.issn 实验和分子鉴定可判定菌株为假单胞胞菌 Pseudomonas fragi 菌株为腐败希瓦氏菌 GRAM L, DALGAARD P. Fish spoilage bacteria: problems and solutions[j]. Current Opinion in Biotechnology,, 13(3): -. Pseudomonas sp. HKF-3 AB 李颖畅, 王亚丽, 齐凤元, 等. 紫菜多糖提取物对冷藏鲈鱼品质的影响[J]. 食品工业科技, 1, 35(): ; 3. DOI:1.133/ Research, 1, 55: [9] MACÉ S, JOFFRAUD J J, CARDINAL M, et al. Evaluation of the spoilage potential of bacteria isolated from spoiled raw salmon (Salmo salar) fillets stored under modified atmosphere packaging[j]. International Journal of Food Microbiology, 13, 1(3): 7-3. DOI:1.11/j.ijfoodmicro

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Microsoft Word tb 唐文静ys-研究报告.doc 微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Mar. 20, 2016, 43(3): 559 566 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150597 研究报告复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块的保鲜效果 * 唐文静宁喜斌王楚文柳云龙 ( 上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海