疾病监测 年 月 日第 卷第 期! #% #% 李斯特菌分离培养方法及推荐的培养基 目前国际上公认的从样品中分离李斯特菌的方法主要包括 美国食品药品监督管理局 4 的方法 美国分析化学家协会 8 的方法 欧洲标准委员会 8 的方法 美国农业部食品安全检验署 4 的方法 以及北欧食品分析委员会 的方法

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1 疾病监测 年 月 日第 卷第 期! #% #% 综 述 李斯特菌选择性培养基的研究 刘东鑫 叶长芸 摘要 单增李斯特菌是一种重要的食源性致病菌 目前李斯特菌受到了越来越多的关注 虽然近些年来应用分子生物学方法对李斯特菌进行诊断的技术不断增多 但传统的细菌分离培养仍然是李斯特菌实验室检测的金标准 本文对各种李斯特菌选择培养基的原理进行阐述 并且比较其分离效果及不足之处 为发展新的分离培养方法和研制新的选择培养基提供了基础 关键词 李斯特菌 分离方法 选择性 培养基中图分类号 % 文献标志码 文章编号 3#(# -, ( %!.,#, ((,+% ((,+ % % - - #!. #?% # - (,.- # % # # # - # # %# # #+ - # % # #! #! # # - % 6,#- # ( ##., #., (.,(, ( %,6 ( (.## #,%( 6 李斯特菌! 是兼性细胞内生长的革兰阳性菌 最常见的李斯特菌有 种 即单增李斯特菌!! #! 伊氏李斯特菌 # 英诺克李斯特菌 # 威尔斯李斯特菌 #. 西尔李斯特菌 # 和与它们关系较远的格氏李斯特菌 # 其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌具有致病性 伊氏李斯特菌仅引起动物发病 在极少数情况下能够引起人类发病 单增李斯特菌致病能力较强 是一种重要的人兽共患食源性致 基金项目 国家传染病防治重大专项课题 #< 传染病预防控制国家重点实验室创新基金课题 #< 作者单位 < 南华大学医学院 湖南衡阳 < 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室 北京 作者简介 刘东鑫 男 河北省黄骅市人 硕士研究生 主要从事病原生物学研究通信作者 叶长芸,!.!? <! 收稿日期 病菌 单增李斯特菌可以引起婴儿 孕妇 老年人以及免疫功能不全者发病 其主要临床表现为败血 症 脑炎 脑膜炎 死产等 李斯特菌病的临床病死率较高 可达 李斯特菌广泛存在于肉类 水产 牛奶等产品中 能在高盐 低温 干燥 以及 3% % 等多种 较严酷的条件下生存繁殖 该菌主要通过食源性传播 随着肉制品 奶制品等消费的增多 越来越多的李斯特菌病在各国暴发或者流行 这也引起了世界各国对该菌的高度关注 将其列为重点监测的食源性致病菌 尽管目前已有多种分子生物学方法和免疫学方法被用于检测李斯特菌的存在 但传统的分离培养方法仍是判断李斯特菌存在与否的 金标准 传统培养方法需要经过在液体培养基中进行两步增菌 以及在固体选择培养基上的选择鉴别方可得到李斯特菌的纯培养 用于后续的实验研究 本研究对李斯特菌分离所使用的方法 李斯特菌选择性培养基的原理 分离效果以及现有培养基的不足之处进行了阐述!# %

2 疾病监测 年 月 日第 卷第 期! #% #% 李斯特菌分离培养方法及推荐的培养基 目前国际上公认的从样品中分离李斯特菌的方法主要包括 美国食品药品监督管理局 4 的方法 美国分析化学家协会 8 的方法 欧洲标准委员会 8 的方法 美国农业部食品安全检验署 4 的方法 以及北欧食品分析委员会 的方法 以上方法大同小异 都是经过两次 或一次 增菌后 将增菌液涂到选择性固体培养基上培养 观察是否有典型的单增李斯特菌或其他李斯特菌菌落存在 不同方法选择的增菌液与固体培养基不同 培养基中各种添加剂及其作用详见表 8 方法选择的一次增菌液为 3(( H 增菌 H, 二次增菌液为 4(( H 增菌 H, 3(( 与 4(( 中具有抑菌作用的物质都是氯化锂 盐酸吖啶黄以及萘啶酮酸 只不过 3(( 中添加剂的浓度是 4(( 中的一半 8 方法推荐的固体选择培养基为 8 平板或者其他固体选择培养基 86 #( 或者 - 8 平板中含的选择性物质有氯化锂 萘啶酮酸 头孢他啶 多粘菌素 和两性霉素 这些添加剂可 以有效地抑制革兰阴性菌和真菌的生长 4 的方法选用的一次增菌液为 表 李斯特菌选择培养基中各种添加剂及其作用. - #, ## -,.- 添加剂氯化锂 萘啶酮酸 环己酰亚胺 两性霉素 多粘菌素 磷霉素 氧氟沙星 盐酸吖啶黄 头孢他啶 作 用 与其他添加剂协同作用抑制革兰阴性菌 酵母菌 霉菌 对革兰阴性菌 大肠埃希菌 志贺菌 伤寒杆菌 有抑制作用 与氯化锂协作 对酵母菌 霉菌 原虫等有抑菌作用 与氯化锂协作抑制酵母菌 霉菌等真菌 对革兰阴性杆菌 如大肠埃希菌 绿脓杆菌 副大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 嗜酸杆菌 百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用 对葡萄球菌属 大肠埃希菌 沙雷菌属和志贺菌属等均有较高抗菌活性 主要抑制需氧型革兰阴性菌 如肠杆菌科大部分细菌 对梨形虫 附红细胞体 马巴贝斯虫 驽巴贝斯虫 牛双芽巴贝斯虫 牛巴贝斯虫 羊巴贝斯虫等均有抑制作用 对革兰阴性杆菌特别是肠杆菌科细菌有强大抗菌活性 其对金黄色葡萄球菌的 为. 二次增菌液为 8- 或者 4(( 中含有萘啶酮酸和吖啶黄 8- 为一种 3 缓冲剂 一些文献中提到用 8- 作为 3 缓冲剂时比用磷酸氢盐作为缓冲剂的增菌液稳定性及重现性更好 并且当磷酸氢盐浓度较高时 一些李斯特菌容易产生噬菌体 可以使细菌溶解或者自我溶解 中含有的选择性物质为盐酸吖啶黄 萘啶酮酸和环己酰亚胺 最后将二次增菌液涂于 8 平板上 8 平板是在 86 #( 基础上进行改良 改变了营养基础和一些添加剂 使其快速溶解 质量稳定 环保 其中含有氯化锂 粘菌素 拉氧头孢和磷霉素等选择性物质 的方法与 8 方法相似 选择的一次增菌液为 3(( 增菌, 二次增菌液为 4(( 增菌, 然后将一次和二次增菌液分别涂于 8 平板或者其他与 8 相似的固体选择性培养基 可疑菌落还需要进行生化鉴定 4 的方法与其他方法有所不同 首先将样品加入到含有磷酸二氢盐和丙酮酸的胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤 中 此时的培养基中不含有选择剂 在 条件下预增菌, 其中丙酮酸对损伤的李斯特菌具有恢复作用 然后加入选择剂盐酸吖啶黄. 萘啶酮酸. 环己酰亚胺. 在 条件下继续培养直到, 根据 4 方法的规定分别将, 和, 的增菌液涂于 8 平板或者加入铁离子的 - 平板上进行菌落分离 - 平板中有氯化锂 苯乙醇 拉氧头孢 除上述国际公认的方法外 我国制定了针对李斯特菌检测的国标法 9% 国标法中一次增菌液为 二次增菌液为 它们的添加剂为萘啶酮酸和吖啶黄 然后将二次增菌液涂于 - 琼脂平板进行菌落分离 - 琼脂平板中包含的物质有 多粘菌素 吖啶黄 氯化锂 头孢他啶 七叶灵 甘露糖 各种培养基的生化原理及产生的菌落特征上述方法中提到的一些选择性固体培养基 如 86 #(- 8- 等 都是一些比较传统的选择性培养基 均是利用葡萄糖苷酶水解七叶灵产生葡萄糖和七叶苷原 而七叶苷原与铁离子结合呈现棕黑色 所以李斯特菌在这些培养基上都会呈现黑灰色 而 3 (C!! 培养基是一种显色培养基 但与新型显色培养基原理不同 它利用李斯特菌中的葡萄糖苷酶分解环己烯 七叶!# %

3 疾病监测 年 月 日第 卷第 期! #% #% 苷 吡喃葡萄糖苷产生黑色菌落 现在发展了很多新型的选择性显色培养基例如 < #!# 8 8!+. ( (! 8 (!! 等 其中 培养基是利用致病性李斯特菌中的磷酸酰肌醇 磷脂酶 - - 分解 溴 氯 吲哚酚 肌醇 磷酸 - 产生蓝绿色菌落 而非致病菌不会产生 - - 所以它们的菌落为白色 < #!# 培养基显色原理与 培养基相同 但该平板含有苯酚作为 3 指示剂 所以它的本底颜色为棕红色 伊氏李斯特菌可以利用 < #!# 培养基中的木糖产酸 因此在该平板上伊氏李斯特菌的菌落为蓝绿色周围有黄色环 这样可以与单增李斯特菌进行很好的区分 8 8!+. ( 培养基也是利用 - - 分解 - 产生蓝绿色菌落但其周围还会产生白色沉淀 这种沉淀环的形成是由于单增李斯特菌对该培养基中一些营养物的利用及磷脂混合物的添加所导致 (! 8 (!!. ( 培养基的原理相同 利用 葡萄糖苷酶分解显色物质 溴 氯 吲哚酚 吡喃葡萄糖苷使菌落呈现蓝绿色 还利用 - - 和 - - 分解 磷脂酰肌醇产生不溶于水的脂肪酸 使菌落周围形成了白色沉淀 在这种培养基上单增李斯特菌和伊氏李斯特菌呈现蓝绿色菌落周围有白色沉淀环 非致病性李斯特菌的菌落呈现蓝 绿色但没有白色沉淀环 还有一些新发展的但没有商品化的新型选择性培养基 例如左氟沙星卵磷脂培养基 培养基 培养基中含有大豆卵磷脂 单增李斯特菌会利用 - - 与 - - 的作用水解大豆卵磷脂产生晕环 左氧氟沙星会抑制除了李斯特菌以外的其他菌生长 在 培养基上 单增李斯特菌与伊氏李斯特菌的菌落为白色有晕环 而其他李斯特菌仅为白色菌落 另外 8 李斯特增菌液是一种新型的未普遍使用的 专门为环境样本中李斯特菌的分离而研发的一步法增菌液 对于环境样本它可以有效代替两步法增菌 不同培养基分离效果比较不同培养基对李斯特菌的选择效果不同 3 (C!! 培养基中反应产生的黑色色素会固定在菌落周边而不像 - 等传统的选择培养基产生的色素会扩散 如此一来对可疑菌落的筛 选更加简单 +, 等发现 3 (C!! 培养基比 86 #( 培养基中多发现 的阳性菌落 有人把 8 平板与传统的 86 #( 平板和 - 平板进行了比较 发现对自然污染的奶制品和肉制品检验时 8 平板能比 86 #( 平板多发现 % 的阳性样品 当样品中同时含有英诺克李斯特菌和单增李斯特菌时 在 8 平板上单增李斯特菌菌落周围有白色沉淀而英诺克李斯特菌的菌落周围没有白色沉淀环 从而将二者区分开来 86 #( 和 - 平板上单增李斯特菌与英诺克李斯特菌菌落完全相同无法区分 因此 8 平板的分离效果明显优于 86 #( 和 - 平板 < #!# 平板与 8 平板的分离效果相当 李斯特菌血平板 的分离效果也很好 但是鉴于血液来源批次与批次间不同 所以不推荐大规模使用 3,!! 发现对相同样品进行分离时 对单增的检出率为 % 而 - 对单增的检出率为 % 有人对 3 8. (! 平板与 86 #( 8 - 琼脂平板比较后发现 3 8. (! 琼脂平板对单增李斯特菌的确认率为 而 - 等传统培养基对单增李斯特菌的确认率仅为 传统的 - 琼脂平板在筛选李斯特菌时灵敏度和特异度都要低于 3 8. (! 显色平板 这是由于 3 8. (! 显色平板中含有大豆卵磷脂 单增李斯特菌中的卵磷脂酶可以分解大豆卵磷脂 使菌落周围呈现透明环 很容易将单增李斯特菌与非致病性的李斯特菌区分开来 而 - 平板上单增李斯特菌菌落形态与其他的李斯特菌菌落形态完全相同 在随机挑选菌落进行后续鉴定的过程中 容易将单增李斯特菌遗 漏 - ( 等对 8 (!!. ( 3 8. (!. ( 平板进行比较 (!!. ( 的准确率 灵敏度与特异度均高于 3 8. (! 3 8. (! 各项指标均高于 8 而 培养基的各项指标与 (!!. ( 培养基相当 综合来看 新型的显色培养基对李斯特菌尤其单增李斯特菌的选择鉴别效果明显优于传统的选择培养基 而 (!! 培养基的效果相比较更好一些 培养基中的添加剂对李斯特菌的损伤抑制作用 在复杂的微生物菌群中分离出目标菌是很有挑战的 选择培养基中加入的选择性物质是为了抑!# %

4 疾病监测 年 月 日第 卷第 期! #% #% 制除李斯特菌以外的细菌的生长 但是抑制其他细菌的同时也会对李斯特菌产生抑制 #! 等研究发现在 中 株单增李斯特菌的平均代时为 %! 株英诺克李斯特菌的平均代时为! 而在加有添加剂的选择培养基中 株单增李斯特菌的平均增代时间为 %! 株英诺克李斯特菌的平均增代时间为 %! 这些数据显示添加剂对李斯特菌具有抑制作用 并且对单增李斯特菌的抑制作用大于对英诺克李斯特菌的抑 制作用 等发现按照 8 的方法进行分离鉴定 将固体选择性培养基的添加剂减少到标准量的 时 很明显的提高了培养基对李斯特菌属细菌的检测能力 而特异度没有明显下降 在杂菌抑制方面 8 培养基中的添加剂浓度降低到标准浓度的 时 #+#! #% 全部被抑制 而 +# 有 被抑制 当使用标准浓度的添加剂时 8 对 +# 的抑制也仅达到 当 8 和 - 培养基的添加剂浓度为 标准浓度时 就可以完全抑制大肠埃希菌 粪肠球菌 金黄色葡萄球菌的生长 他们还发现当添加剂浓度为标准浓度的 时 在 8-8 上的检测灵敏度均为 因此认为当选择性培养基的添加剂浓度过高时会损伤或者抑制一些李斯特菌 朱敏等通过测定不同浓度的吖啶黄 萘啶酮酸 亚碲酸钾对单增李斯特菌和大肠埃希菌 蜡样芽胞杆菌的生长的影响 选择出最适的添加剂浓度 低于国标法 制成改良的李斯特菌增菌液 发现与国标法相比单增李斯特菌的检出率 明显提高 3. 等发现不同种的李斯特菌对选择培养基反应不同 当培养基中添加剂浓度为标准浓度的 时 单增李斯特菌和英诺克李斯特菌的生长速度始终快于伊氏李斯特菌 并且在电子显微镜下观察发现培养基上伊氏李斯特菌的菌落也明显比单增李斯特菌和英诺克李斯特菌的菌落小 提示伊氏李斯特菌对很多添加剂都很敏感 伊氏李斯特菌的分离率明显低于单增李斯特菌的分离率 这一现象可能是由于环境中存在的伊氏李斯特菌本来就很少 也可能是伊氏李斯特菌仅存在于某些特定的宿主中 或者还可能是在分离过程中由于添加剂的作用抑制了伊氏李斯特菌的生长 李斯特菌选择培养基存在的一些问题 在病原菌分离过程中 杂菌或者非目标菌的竞争生长会严重影响目标菌的分离 在单增李斯特 菌增菌的过程中 无害李斯特菌的过度生长经常会 掩盖单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的存在 导致假阴性结果 前文提到的添加剂对致病性李斯特菌的抑制作用也有可能造成假阴性结果 因此认为改变添加剂的种类或者降低添加剂浓度也许可以降低检测的假阴性率 另外 目前的显色培养基 如 (!!. (8 等 只可以区分致病性李斯特菌与非致病性李斯特菌两个大组 不能进一步将致病性李斯特菌区分为单增李斯特菌和伊氏李斯特菌 也不能将非致病李斯特菌区分为无害李斯特菌 西尔李斯特菌 威尔李斯特菌等 这也可能是目前伊氏李斯特菌 西尔李斯特菌等较少从标本中分离到的原因之一 因此 可以根据不同种的李斯特菌对营养物质利用的不同在固体选择培养基中加入特异性的底物及指示剂 发展具有更好鉴别作用的培养基 为了更好地了解李斯特菌在标本中的实际污染状况 特别是提高致病性李斯特菌在食品及临床标本中的检出率 迫切需要发展新型的李斯特菌增菌液和选择及鉴别培养基 可以有效抑制杂菌和无害李斯特菌的生长 同时能够有效区分李斯特菌的各个种 从而提高李斯特菌的分离率 减少检测结果的假阴性率 为食源性单增李斯特菌的病原学检测 以及李斯特菌病例的监测提供有力的技术支持 从而为预防和控制李斯特菌病提供基础 参考文献 8 ++ % - (,.- ##. %- # #, + % #. # (. % - (,.-!# # +. %- #, + %, % - (,.- # ##. % -,- % %! # # - %!. %- #, + % 8%! - (,.- 3. %- #, + % - %( ## #!. %- #, + %!# %

5 9! 疾病监测!# 年 月 % 日第 %# 卷第 期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朱敏!梅玲玲!程苏云改良李斯特菌增菌液的研究+, 中国 > S>=,N+, <.LL4 9C!#KK%!### %! %9 卫生检验杂志!!H!#H#!!K%!K9 S!, T!!.4! 3 ;< +!, K =! H ; 8! R 34,! P( 6-3 ; 4 6; < %%+, <.LL4 ;< < 4 < 4+,?.LL4 9C!!#!%!#! HI I! 9C!!!###% H## H#H +#, I ;@!! T6! > ; KW,! +!H, R6 H I! 64 I! M_ 6! P( 6 S % 4. % % % % = (.-; C < %%6 4 ;% 64 < < ; 4 <6 # 3 % < 4 % < < 6 6 <+,?U99I 9C!!9!#8#! #!% #%8 % +,.LL4 ;J 9 9C! #KK#! 9H # K!!H +#H, ; M=!!6,! PC 64 =! P( 6 4 #. ( 4 - ( VO=+ T # K99 9I8# < 作者贡献 % % 4. % % % % = (. 6 < - 9+ ; ;< 6# 4 < 叶长芸修改校对 4 +,?U99I 9!!%!#% 88# 889 +#I, S =< S@! T ( %; -( (4 4 ; 4 6; 9+ +,.LL4;J 9 9C!!#8! I # % 刘东鑫 #! #!9!!!# # % ( +!,-. 3# 4 6.,-- 889,. -, ,

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