Microsoft Word - 基因诊断第33期_1_.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - 基因诊断第33期_1_.doc"

阿磨仲
7 years ago
Views:

1 人乳头瘤病毒基因分型方法的建立和应用王方金 1, 王敏 1, 王丁 2, 肖克林 3 1, 何蕴韶 (1. 中山大学达安基因诊断中心, 广州 ; 2. 广东省人民医院检验科, 广州 ; 3. 深圳市宝安区妇幼保健院检验科, 深圳 ) 摘要目的建立一种简便快捷灵敏度高经济实用的人乳头瘤病毒 (HPV) 基因分型的低密度基因芯片技术, 并对该方法进行评价方法利用低密度基因芯片技术对 355 例妇产科疑似 HPV 感染病人进行 HPV 检测并分型, 用杂交捕获 Ⅱ 代方法进行评价, 并利用该方法对珠三角地区的 730 例标本进行 HPV 分型检测结果 355 例疑似样本中, 低密度基因芯片技术和杂交捕获 Ⅱ 代方法分别检出 211 例 (59.4%) 和 222 例 (62.5%) 阳性, 检测符合率达到了 94.1%(334/355), 取得了较好的一致性低密度基因芯片技术具体分型共检测出 15 种常见高危型和 5 种低危型, 其中型检出率较高 26~30 年龄组 HPV 感染率最高, 并随着细胞学程度的加深, 感染率呈明显上升趋势结论低密度基因芯片技术能具体分型和检测混合感染,HPV 检测和细胞学检测结合起来, 对子宫颈癌筛查有很重要的指导意义关键词人乳头瘤病毒 ; 低密度基因芯片 ; 杂交捕获 Ⅱ 代 ; 基因分型 The Establishment and Application of the Method of Human Papillomavirus Genotyping WANG Fangjin 1,WANG Min 1,WANG Ding 2,XIAO Kelin 3,HE Yunshao DaAn Gene Diagnostic Center, Guangzhou ,China;2.Guangdong Provincial People, s Hospital,Guangzhou ,China; 3. Shenzhen Baoan Woman and Children Hospital and Health Institute,Shenzhen ,China Abstract Objective Establishing a convenient fast high sensitivity and economic low-density DNA array method to detect genotypes of human papillomavirus and evaluate its application in clinic services. Methods Cervical swab samples from 355 women in gynaecology and obstetrics clinic are HPV genotyped with hybrid capture Ⅱ(HC Ⅱ) and low-density DNA array simultaneously. 730 clinic samples in pearl triangle are HPV genotyped with low-density DNA array. Results HPV-DNA were detected from 59.4% of sample by low-density DNA array and 62.5% of sample by HCⅡ in 355 samples, respectivity. The concordance between the two assays was 94.1%. 15 high risk type and 5 low risk type was detected with low-density DNA array.the most commonly found high-risk types were HPV-16 HPV-52 HPV-58 HPV-56. The peak age of HPV infection is 26~30. There are genotype distribution differences between various cervical diseases. Conclusion single-type and multiple-type can detected by Low-density DNA array; It will be instructive significance for cervical cancer screening if HPV detection and cytology detection are combined. Key Words human papillomavirus;low-density DNA array;hcⅡ;genotyping 人乳头瘤病毒 (human papillomavirus, HPV) 已被证实是引起子宫颈癌的重要致病因子, 研究报道显示, 大约 99.7% [1] 的子宫颈癌病人被发现有 HPV 感染, 根据不同型别 HPV 导致子宫颈癌的风险不同, 可将 HPV 分为高危型和低危型长期以来, 子宫颈癌的早期筛查是通过 Pap Smear 细胞学检测, 但该方法主要存在灵敏度低假阴性率高的缺点, 若能将 HPV 检测和细胞学检测有机的结合起来, 将更有助于预防子宫颈癌的发生美国 Digene 公司的杂交捕获 Ⅱ 代 (hybrid capture Ⅱ,HCⅡ) 是主要用于临床检测

2 HPV 的方法该方法仅能检测 HPV 感染, 不能具体分型本研究利用低密度基因芯片技术对 HPV 进行基因分型检测, 并用 HCⅡ 进行比较评价, 旨在建立一种快速简便灵敏特异度强的 HPV 感染和基因分型的诊断方法同时利用该技术检测珠三角地区临床标本, 分析珠三角地区 21 种常见 HPV 基因型分布情况, 探讨 HPV 与子宫颈病变的临床关系 1 材料和方法 1.1 标本标本主要来源于珠三角地区共计 1085 例, 其中广东省人民医院检验科提供的 2004 年 7 月至 2005 年 12 月该院妇产科门诊就诊的 355 例疑似 HPV 感染子宫颈刷标本, 以及 2005 年 9 月至 2005 年 12 月, 来自珠三角地区包括广州深圳佛山中山等城市, 由中山大学达安临床检验中心提供的妇科等科室门诊拭子标本 730 例根据 355 例标本的薄层液基细胞学检查结果 (Bethesda System 1999 分级方法 ) 将病例分为 5 组 : 正常组 (NILM)194 例 ; 未明确意义非典型鳞状上皮不除外高度病变组 (ASC-H)6 例 ; 未明确意义非典型鳞状上皮病变组 (ASCUS)58 例 ; 低度鳞状上皮病变组 (LSIL)73 例 ; 高度鳞状上皮病变组 (HSIL)24 例 355 例标本细胞学结果由广东省人民医院病理科提供 355 例临床标本先经 HCⅡ 方法检测后放置于 -20 保存, 待用低密度基因芯片方法检测,730 例拭子标本直接用低密度基因芯片技术进行基因分型 1.2 实验方法 HCⅡ 检测利用 Digene 公司的高危型 HPV 检测试剂盒对所有标本进行高危型 HPV 检测, 详细步骤严格按说明书进行低密度基因芯片检测 DNA 提取和基因扩增取经 HCⅡ 检测后的样本 300 μl 于 1.5 ml 离心管, 加入 60 μl 的 3 mol/l 冰醋酸, 上下颠倒混匀后加入 750 μl 无水乙醇, 混匀后 r/min, 离心 15 min, 去上清待乙醇完全挥发后, 加入 50 μl 去离子水充分溶解 DNA 后备用通用引物 [2] 内参基因 Globin 引物均由中山大学达安基因股份有限公司合成扩增仪为 ABI9700, 反应体系为 50 μl, 反应条件为 :93 预变性 3 min,93 变性 40 s,55 退火 40 s,72 延伸 40 s, 共 40 个循环, 最后 72 延伸 7 min PCR 产物在 20 g/l 的琼脂糖电泳检测后 -20 保存备用芯片制备将尼龙膜用 1- 乙基 -3[3-( 二甲氨基 ) 丙基 ] 碳二亚胺 (EDC) 浸泡 2 h 以活化膜条, 蒸馏水清洗晾干后按一定顺序, 将 21 型探针 (15 种常见高危型和 5 种低危型及 cp8304 型 ) 点于膜条上, 晾干后用 NaOH 固定探针, 蒸馏水清洗后晾干存于 4 冰箱备用 21 型探针由中山大学达安基因股份有限公司设计并合成基因分型扩增产物 98 变性 10 min 后立即放置冰上 2 min, 然后将产物与杂交液 Ⅰ(3 SSC-0.5%SDS) 混合, 放置 DNA 杂交仪 ( 香港凯普公司 ) 快速杂交 5 min, 用杂交液 Ⅱ(1 SSC-0.1%SDS) 清洗膜条 ; 再用链霉素 - 生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶结合物 (POD)25 下浸泡 2 min, 最后用过氧化氢作为催化剂催化 TMB 显色观察结果 1.3 统计学方法利用 SPSS13.0 统计软件对检测结果进行统计分析 2 结果

3 2.1 HCⅡ 检测结果利用高危型 HPV 混合探针对 355 例标本进行检测, 检测出阳性标本 222 例, 阳性率为 62.5% 不同细胞学分组的 HPV 感染情况如下 :NILM 90 例,ASC-H 3 例, ASCUS 46 例,LSIL 60 例,HSIL 23 例 2.2 低密度基因芯片分型结果利用低密度基因芯片对 1 085( ) 例样本进行 HPV 基因分型, 共检测出 437 例 HPV 感染病例, 总阳性率为 40.3%, 其中单一型感染 319 例 (73.0%), 混合感染 118 例 (27.0%), 后者中二重感染三重感染四重感染分别为 92 例 (21.1%) 20 例 (4.6%) 6 例 (1.4%); 共检出 21 种 HPV 型别, 其中 2 例标本电泳呈阳性, 利用芯片检测无结果, 通过克隆测序后确定为 54 型和 73 型在 23 种型别中, 感染率最高的为 16 型 (24.5%), 其次为 52 型 (16.2%) 58 型 (16.0%) 56 型 (7.3%) 31 型 (6.9%) 等具体型别分布见表 1 表 1 珠三角地区 HPV 型别分布表 Table 1 HPV genotyping distribution in pearl triangle HPV 型别单型感染数 ( 例 ) 混合感染数 ( 例 ) 总感染数 [ 例 (%)] 高危型 (24.5) (16.2) (16.0) (7.3) (6.9) (6.2) (5.9) (5.7) (5.5) (3.2) (3.2) (3.1) (3.1) (2.3) (1.1) (0.2) 低危型 (8.9) (7.8) (1.1) (1.1) (0.5) (0.2) 其他型 cp (3.9)

4 2.3 HCⅡ 和芯片检测比较 355 例标本中,HCⅡ 和芯片方法分别检测出 222 例和 211 例阳性标本, 其中 2 种方法同时检测出阳性标本 206 例, 阴性标本 128 例,2 种方法的检测符合率达到了 94.1% (334/355), 另有 16 例标本 HCⅡ 检测阳性而芯片检测阴性 ; 有 5 例标本芯片检测阳性而 HCⅡ 阴性 ( 见表 2) 2 种检测结果不符标本均经过重复实验后确认后仍存在不符 ; 利用卡方检验进行统计学分析,χ 2 值 ,P<0.001, 认为 2 种方法存在关联表 2 两种方法结果比较例 Table 2 Comparison of results obtained by two methods Low-density DNA array HCⅡ + - 合计合计从上述表格可以看出, 将 HCⅡ 方法作为金标准, 低密度基因芯片方法的灵敏度为 92.8%(206/222), 特异度为 96.2% 2.4 HPV 感染与细胞学检测结果的关系如图 1 所示, 随着细胞学病变程度的加深,HPV 的感染率明显呈上升趋势,LSIL 和 HSIL 的 HPV 感染率都达到了 80% 以上不同子宫颈病变型别差异见表 3 120% 100% 80% 60% 40% HC2 RDB 20% 0% NILM ASC-H ASCUS LSIL HSIL Figure 1 HPV infection in various cervical diseases 图 1 不同子宫颈病变组 HPV 感染情况表 3 不同子宫颈病变组 HPV 型别分布例 Table 3 HPV genotyping distribution in various cervical diseases

5 临床分组 ( 例 ) 16 型 18 型 31 型 33 型 35 型 39 型 45 型 51 型 NILM(194) ASC-H(6) ASCUS(58) LSIL(73) HSIL(24) 临床分组 ( 例 ) 52 型 53 型 56 型 58 型 59 型 66 型 68 型 cp8304 型 NILM(194) ASC-H(6) ASCUS(58) LSIL(73) HSIL(24) 讨论 3.1 低密度基因芯片技术和 HCⅡHPV 基因分型比较 HCⅡ 是目前唯一通过美国 FDA 认证可用于临床的 HPV-DNA 检测手段, 特别适合于大规模筛查本研究利用低密度基因芯片技术对 HPV 进行具体分型检测, 结果与 HCⅡ 取得了较好的一致性 355 例标本中有 334 例检测结果完全一致, 另有 16 例标本 HCⅡ 阳性而芯片检测结果阴性, 其中有 10 例标本 HCⅡ 检测结果相对光单位 ( relative light unit,rlu) / 标准阳性对照的 RLU 比值小于 10, 说明病毒含量较低研 [3] 究显示样本放置大于 48 日进行检测的检出率显著低于放置小于等于 47 日的样本的 HPV 检出率 ; 因此标本存放时间过久导致 DNA 降解将直接影响 HPV 基因芯片的阳性检出率另有 3 例标本芯片检测阳性而 HCⅡ 阴性, 包括 2 例为 6 型,1 例 16/31 混合感染型 ; 另有 2 例电泳阳性, 经测序鉴定为 54 型和 73 型其中 54 和 73 均不在 2 种方法的型别检测范围之内同时芯片方法检测到 28.9% 的混合感染, 混合感染的检出有助于区别持续性感染和重复感染, 且高危型混合感染比单型感染更加重了对子宫颈组织的损害, 从而更容易导致疾病的发生综上所述, 本研究建立的低密度基因芯片方法对 HPV 基因分型不仅能与 HCⅡ 方法达到很好的一致性, 灵敏度高, 特异度强, 而且能够具体分型和检测出混合感染, 方便快捷, 在临床应用上有很大的前景 3.2 HPV 感染的型别分布通过低密度基因芯片技术对标本进行具体分型, 共检测出 15 种常见高危型和 3 种低危型, 其中 16 型感染率最高 (24.5%), 其次为型, 分别为 16.2% 16.0 % 7.3%, 与大多研究结果一致 [4-7] 型别的分布差异可能与以下几个因素有关:1 人的种族来源不同, 所处的环境有所不同 2 筛查系统的建立以及受检人群的不同 3 各地的生活习惯和其他导致子宫颈癌发生的因素 ( 吸烟, 使用避孕药, 性生活等 ) 有所不同 3.3 细胞学和 HPV 联合筛查的意义本研究结果显示无论是基因芯片还是 HCⅡ 方法检测 HPV, 随着细胞学损害程度越重,HPV 检出率也随之升高细胞学正常组的 HPV 检出率明显低于其他分级组的检出率 HSIL 组病例中 HPV 检出率达到了 95% 以上本研究中显示感染年龄高峰在 26~30 [8,9] 岁之间, 与研究报道结果大致相符 HPV 感染大多是一过性的, 其清除时间为 7~ 12 个月 [10], 因此对 HPV 阳性的妇女 1 年后应重复检查, 如果仍为阳性, 推荐做阴道镜

6 检查年龄大于 30 岁的妇女 HPV 阳性更倾向于持续性感染, 与子宫颈上皮高度病变密切相关 [11,12] 目前对于子宫颈癌的筛查方法主要在于用巴氏涂片, 但是该方法最大的不足是敏感度太低, 造成假阴性率太高, 很多病例都不能及时发现和得到治疗若能将 HPV 检测与细胞学检查有机的结合起来, 将对子宫颈癌筛查有很重要的指导意义 30 岁以上女性接受 HPV 检测具有很高的阴性预测价值, 结合细胞学检查, 双阴性者筛查期限可延长至 2~3 年联合筛查可以监测低度上皮病变变化决定不同的复查时间以及监测高度上皮病变的治疗效果参考文献 [1] Walboomers JM,Jacobs MV,Manos MM,et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol,1999,189(1): [2] Iftner T,VILLAL L. Chapter 12: Human papillomavirus technologies..j Natl Cancer Inst Monogr, 2003,(31): [3] 陈凤, 沈艳红, 刘彬, 等. 第二代杂交捕获法检测子宫颈癌人乳头瘤状病毒影响因素的研究. 中华医学杂志,2005,85(2): [4] 朱岩, 谢建生, 徐湘民, 等. 人乳头状瘤病毒亚型 PCR /RDB 基因分析方法的建立及初步评价. 华南预防医学,2006,32(4):9-13. [5] Huang S,Afonina I,Miller BA,et al. Human papillomavirus types 52 and 58 are prevalent in cervical cancer from Chinese women. Int J Cancer,1997,70(4): [6] Lin QQ,Yu SZ,Qu W,et al. Human papillo2mavirus types 52 and 58. Int J Cancer,1998, 75(3) : [7] Lai HC,Sun CA,Yu MH,et al. Favorable clinical outcome of cervical cancers infected with human papilloma virus type 58 and related types. Int J Cancer,1999,84 (6) : [8] Bekkers RL,Massuger LF,Bulten J,et al. Epidemiological and clinical aspects cancer.rev Med Virol,2004,14(2): [9] Jacobs MV,Walboomers JM,Snijders PJ,et al. Distribution of 37 mucosotropic HPV types in women with cytologycally normal cervical smear : The age-related patterns for high-risk and low - risk Types. Int J Cancer,2000,87(2): [10] Dalstein V,Riethmuller D,Pretet JL,et al. Persistent and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: A longitudinal French cohort study. Int J Cancer,2003, 106(3): [11] Damasus-Awatai G,Freeman-Wang T,et al. Human papillomavirus and cervical screening. Curr Opin Obstet Gynecol,2003,15(6): [12] Kulasingam SL,Hughes JP,Kiviat NB,et al. Evaluation of human papillomavirus testing in primary screening for cervical abnormalities coparison of sensitivity, sepecificity, and frecuency of referral. JAMA,2002,288(14):

<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63>

<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63> EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌分期的关系蔡永林, 郑裕明, 成积儒, 李军, 莫永坤, 钟青燕 ( 广西梧州市红十字会医院, 梧州市肿瘤防治研究所, 广西梧州 543002) 摘要 : 目的探讨 EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌临床分期的关系方法用酶

Microsoft Word - 基因诊断 第33期_1_.doc

Microsoft Word - 基因诊断第33期_1_.doc