小麦显性矮秆基因复等位多态特性研究

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1 中国农业科学 01,45(4): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn ESR 基因在苏姜猪世代选育中的遗传变异及与猪群繁殖性状的关联 王宵燕, 何庆玲, 经荣斌, 宋成义 ( 扬州大学动物科学与技术学院, 江苏扬州 5009) 摘要 : 目的 探讨苏姜猪 ESR 基因的 PvuⅡ 酶切位点多态性在世代选育过程中的遗传变异及与猪群繁殖性状的关系 方法 采用 PCR-RFLP 的方法对 906 头 6 世代苏姜猪 ESR 基因 PvuⅡ 酶切位点的多态性进行分析, 并采用最小二乘法和单因子方差分析该位点多态性与苏姜猪群的繁殖性状的关联效应 结果 ESR 基因在苏姜猪的第 6 世代中 B 等位基因频率呈现出不断增加的趋势,BB 基因型个体从第三世代开始出现, 并且频率呈现出上升的趋势 仅考虑公猪基因型时, 与配母猪总产仔数 产活仔数及死胎数之间无显著差异, 但不同基因型公 母猪交配后母猪产仔数则有显著差异 (P<0.05) 结论 ESR 基因的 PvuⅡ 酶切位点的多态性对不同基因型公 母猪交配后母猪的产仔数有显著影响 关键词 :ESR 基因 ; 苏姜猪 ; 遗传变异 ; 繁殖性能 Genetic Variation of ESR Gene in Different Generations of Sujiang Pigs and the Impact on Reproductive Traits of Pigs WANG Xiao-yan, HE Qing-ling, JING Rong-bin, SONG Cheng-yi (College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 5009, Jiangsu) Abstract: Objective This study was aimed to analyze PvuⅡ polymorphism of ESR gene in different generations of Sujiang pigs and the correlation between the polymorphism and the reproductive traits of Sujiang pigs. Method PCR-RFLP was used to diagnose polymorphism of ESR gene in 906 Sujiang pigs of -6 generations. Least square method and one-way anova were performed to evaluate the association of this polymorphism site with reproductive traits of pigs. Result The frequency of allele B of ESR gene in Sujiang pigs of -6 generations showed an increasing trend. Pigs with BB genotypes appeared in the third generations and then presented an upward trend in the frequency. There was no significant relationship between the polymorphism of ESR gene and litter size of sows mated to different genotypes of boars. But they had significant impacts on litter size that different genotypes of boars mated with different genotypes of sows (P<0.05). Conclusion The selection of boars for reproductive traits of Sujiang pig must be taken into consideration. Key words:esr gene; Sujiang pig; genetic variation; reproductive traits 0 引言 研究意义 产仔数是一个重要的经济性状, 但产仔数的遗传力很低 ( 约为 0.1) 变异程度很高, 通过常规的育种方法无法使该性状在短时间内得到有效 提高, 而分子标记辅助选择 (molecular-assisted selection,mas) 为显著改良产仔数的低遗传力性状提供了有效途径 苏姜猪是以产仔数较高的地方猪种姜曲海 枫泾和引入品种杜洛克为亲本, 通过亲本性能测定 基础群建立 群体继代选育 综合选择指数 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 江苏省科技厅高新技术项目 (BG006303) 江苏省研究生培养创新工程 (CX09B_316Z) 联系方式 : 王宵燕, [email protected]

2 4 期王宵燕等 :ESR 基因在苏姜猪世代选育中的遗传变异及与猪群繁殖性状的关联 769 和分子遗传标记辅助选择相结合的方法进行选育具有 较高产仔数 肉质优良的瘦肉型新品种, 目前已进入 六世代的选育阶段 [1] 前人研究进展 ESR 基因定 位于猪 SSC1p4-5 [] [3] Rothschild 等通过候选基因法 证明, 雌激素受体 (estrogen receptor,esr) 基因是 控制猪产仔性状的一个主效基因, 并认为 PvuⅡ 酶切 位点的一个有利等位基因 B 与高初生窝产仔数相关 联 此后, 国内外学者对这一酶切位点进行了大量的 研究 大部分研究认为,B 等位基因提高了国外商业 [4-8] [8-9] 猪种与中国地方猪种的产仔数 因此, 可以用 于育种实践以改良猪的产仔数 而有研究表明, 该位 点与母猪繁殖性能之间的相关性不高 [10-11] ; 但也有研 究表明,A 等位基因在繁殖性能上具有优势效应 [1-13], 可能与猪的品种 饲养水平 样本量及环境不同有关 苏姜猪自第二世代开始, 每个世代的育种群都检测 ESR 基因 PvuⅡ 酶切位点的多态性, 通过前期研究证 实 ESR 基因与苏姜母猪繁殖性状紧密关联 [14], 但优势 等位基因 B 对生长性状及背膘厚具有不利影响 [15] 本 研究切入点 关于 ESR 基因 PvuⅡ 酶切位点多态性的 遗传效应大多集中于与母猪繁殖性状的关联性研究, 且目前未见其在育种过程中的应用研究结果 拟解决的关键问题 本研究分析了 6 世代的 ESR 基因多态性, 并利用各世代的繁殖资料分析了不同基因型公 母猪交配后的总产仔数 产活仔数和死胎数 进一步探讨在苏姜猪选育核心群中应用 ESR 基因作为标记辅助选择来提高猪群繁殖性能的实用性, 为从 DNA 水平上为苏姜猪的选育工作提供理论支持 1 材料与方法 试验用耳朵样品于 年和 年分别采自姜堰市种猪场 4 代和江苏姜曲海种猪场 5 6 世代的苏姜猪, 相关分子标记检测试验同期于扬州大学动物遗传繁育与分子设计实验室进行 1.1 主要试剂蛋白酶 K Taq DNA 聚合酶 dntps pbr3 琼脂糖 DNA 片段回收试剂盒 限制性内切酶 PvuⅡ 等均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, 酚 氯仿等常规试剂购自上海生物工程技术服务有限公司 1. 试验方法 [16] 1..1 DNA 提取采取酚 / 氯仿抽提法提取猪耳样 DNA 并溶于 TE 中,-0 保存 [4] 1.. ESR 基因引物与 PCR-RFLP ESR 引物序列为 F:5 -CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3 和 R:5 -CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3 ( 引物由上海基康生物技术有限公司合成 ) PCR 总反应体系为 5 μl, 包括 10 Buffer.5 μl,dntps(.5 mmol L -1 ).0 μl, 上 下游引物各 1 μl(10 μmol L -1 ), Taq DNA 聚合酶 0. μl(5 U μl -1 ),DNA 模板 1.0 μl (100 ng μl -1 ) PCR 反应条件 :95 预变性 5 min; 94 变性 45 s 57 退火 45 s 7 延伸 45 s, 共 35 个循环 ;7 延伸 10 min;4 保存 酶切体系为 : PCR 产物 5 μl, 限制性内切酶 PvuⅡ0.5 μl(10 U μl -1 ),10 Buffer1 μl, 超纯水 3.5 μl; 酶切反应条件为 37 水浴 3 h 1..3 基因型的判定与测序将酶切产物经 10% 的聚丙烯凝胶电泳后, 对出现 11 bp 的条带定义为 AA 基因型,11 65 和 56 bp 的条带定义为 AB 基因型, 65 和 56 bp 的条带定义为 BB 基因型 选取 AA 和 BB 纯合子基因型各 3 个个体, 将 PCR 产物回收, 连接到 pmd19-t 载体上, 转化 DH5α 感受态细胞中, 经培养后挑取克隆菌落,PCR 鉴定正确后送于英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有限公司测序 1.3 数据分析 Hardy-Weiberg 平衡检验对基因型分布进行 Hardy-Weiberg 平衡的卡方适合性检验 (chi-square test) 1.3. 多态信息含量 (polymorphism information content,pic) 的计算 PIC = 1 k i= 1 i P k 1 k i= 1 j= i+ 1 i P P 其中,k 为某基因位点所具有的等位基因数 ;P i P j 为某位点第 i j 等位基因的基因频率 杂合度 (heterozygosity) 的计算 H e = 1 P i k i= 1 其中,k 为某基因位点所具有的等位基因数 ;P i 为某位点第 i 个等位基因的基因频率 ESR 基因多态与繁殖性状的相关性分析利用 SPSS11.0 的广义线性模型 (GLM) 分析公猪 ESR 基因型, 配种公 母猪基因型组合, 世代以及基因型与世代之间的互作对于母猪繁殖性状的遗传效应, 模型为 Y ijk =μ+g i +A j +L k +e ijk 其中,Y ijk : 性状观察值 ;μ: 群体均值 ;G i : 基因型效应 ;A j : 世代效应 ; L k :ESR 基因与世代的互作效应 ;e ijk: 随机残差效应 在互作效应不显著时, 采用单因子方差分析不同基因型及不同基因型组合母猪产仔数, 产活仔数及死仔数 j

3 770 中国农业科学 45 卷 的影响,LSD 法检测差异显著性分析 结果.1 PCR-RFLP 分析基因组 DNA 经 PCR 扩增 酶切之后产物在 10% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析 RFLP 图谱及测序峰图如图 1 和 所示 由测序峰图可以看出, PvuⅡ 酶切位点 (CAG CTG) 是由于 AA 基因型发生点突变 (A-G T-G) 而产生的,11 bp 的 PCR 产物被 PvuⅡ 酶切成 65 和 56 bp, 电泳检测出现 条带 ( 65 和 56 bp) AA 基因型则出现 1 条带 (11 bp),ab 基因型出现了 3 条带 (11 65 和 56 bp) M:pBR3 marker;6:aa 基因型 ;4 和 5:BB 基因型 ;1 3 和 7: AB 基因型 M: pbr3 marker; 6: AA genotype; 4 and 5: BB genotype; 1-3 and 7: AB genotype 图 1 ESR 基因片段的 PCR-RFLP 分析 Fig. 1 PCR-RFLP analysis of ESR gene 箭头处表示碱基突变的位置 Arrow denotes base mutation Fig. 图 AA 和 BB 基因型测序 Sequencing analysis of PCR products of AA and BB genotypes. 各世代 ESR 基因型及基因频率分布情况由表 1 可以看出, 基因型 BB 个体从第 3 世代开始出现, 等位基因 B 频率随世代的增加在不断地增加 而第 5 世代出现 B 等位基因频率下降 可能是该世代猪群正处于由姜堰市种猪场转向江苏姜曲海种猪场更换育种场地的时间, 强烈的应激可能会使生长较弱的 BB 个体处于选择劣势而被淘汰 [16] 经卡方适合性检验, 和 3 世代猪群极显著地偏离哈代 - 温伯格平衡 (P< 0.01) 而随后的 4 6 世代则符合哈代 - 温伯格平衡 (P>0.05) 杂合度和多态性有增加的变化趋势.3 公猪不同 ESR 基因型对母猪繁殖性状的影响 ESR 基因在苏姜公猪中有 AA AB BB 这 3 种基因型 采用模型分析公猪不同基因型及世代对于母猪繁殖性状无显著影响, 且基因与世代对繁殖性状无 表 1 苏姜猪 ESR 基因型及基因频率分布 Table 1 Genotypes and allele frequency of Sujiang pigs 世代 猪群总数 公猪数 基因型频率 Genotypes frequence 等位基因频率 Allele frequence 卡方检验 杂合度 PIC Generations Number of all pigs Number of boars AA AB BB A B Chi square test Heterozygosity χ 0.05(1) =3.84; χ 0.01(1)=6.63

4 4 期王宵燕等 :ESR 基因在苏姜猪世代选育中的遗传变异及与猪群繁殖性状的关联 771 互作效应 从表 中可以看出, 这 3 种基因型在总产 仔数和产活仔数中呈现出 AB<AA<BB 的趋势 虽 然死仔数呈现出 AA<AB<BB 的趋势, 但它们之间 的差异没有达到显著水平 (P>0.05) 表 公猪不同 ESR 基因型对母猪繁殖性状的影响 Table The effect of ESR genotype on reproductive traits of boars 基因型 Genotype AA AB BB 公猪数量 ( 头 ) Number of boars (head) 总产仔数 Total number born 9.18± ± ±1.76 产活仔数 Number born alive 8.66± ± ±3.5 死仔数 Number born dead 0.5± ± ±3.1.4 不同基因型公 母猪配种对母猪繁殖性状的影响采用模型分析公 母猪的不同基因型配种对于总产仔数和死仔数有显著效应, 且不同世代对产仔性状无显著影响, 世代与基因之间无互作效应 采用单因子方差分析可以看出,AAAA AAAB ABAA ABAB ABBB BBAA 这 6 种基因型的总产仔数与产活仔数呈现出 (ABAA ABAB)<(AAAA AAAB ABBB)<BBAA 的趋势, 并且 BBAA 型的总产仔数与 ABAA ABAB 比较, 差异显著 (P<0.05) 随着总产仔数的提高,BBAA 的死仔数显著 (P<0.05) 高于其它基因型 因为样本量的问题, 没有发现预期优势组合 BBBB 个体, 无法计算出该基因型组合在产仔数的优势 ( 表 3) 表 3 不同基因型公 母猪配种对繁殖性状的影响 Table 3 The effect of different genotypes of boars and sows on reproductive traits 公 母猪基因型 ( 公 / 母 ) 数量 总产仔数 产活仔数 死仔数 Genotypes of boar and sow (male/female) Number Total number born Number born alive Number born dead AA AA ±.37ab 8.39±.6a 0.7±1.13a AA AB 5 9.8±3.08ab 8.68±.8a 0.60±1.08a AB AA ±.59a 8.08±.48a 0.57±1.56a AB AB ±.50a 7.77±.69a 0.56±1.18a AB BB ±.4ab 8.0±.95a 1.80±.49a BB AA ±.00b 9.33±5.03a.67±4.6b 同列不同字母表示差异显著 (P<0.05), 同列相同字母表示差异不显著 (P>0.05) Values within the same column with different letters differ significantly (P<0.05), and values within the same column with the same letters are not significantly different (P>0.05) 3 讨论 常规育种技术对于遗传力较低猪的产仔数性状的改良效果非常有限, 而当 ESR 基因被证明是影响猪产仔数的主效基因时, 这一发现可为提高猪产仔数的选育工作提供新的思路 前期研究表明, 该位点与苏姜母猪的繁殖性能显著相关 [14] 因此, 在苏姜猪世代选育中, 笔者逐世代检测了猪群中该酶切位点多态性 通过研究发现, 世代中 ESR 基因的 BB 型纯合子数量为 0, 可能是因为该世代群体较小, 且前期研究表明 B 等位基因与生长有显著负效应 [15], 在选择过程中注重肉质和生长速度的选择会导致 BB 型纯合子被淘汰 而 3 世代以后对种猪以繁殖性能和生长性能相结合来进行选择, 结果发现 B 等位基因频率逐渐上升 该位点在引入品种和中国地方猪种中的分布有较大差异 地方猪种中 B 等位基因频率偏高 [8-9], 而引入猪种 中 A 等位基因频率偏高 [6-8,10-11] 本研究中各世代的苏姜猪 ESR 基因的 B 等位基因频率低于所报道的中国地方猪种, 但高于外种猪, 原因可能是苏姜猪含有一定血缘比例的杜洛克 姜曲海和枫泾猪, 为中外猪种杂交而成 和 3 世代猪群极显著的偏离哈代 - 温伯格平衡, 可能是因为在世代选育早期适当的利用近交提高猪群的整齐度和生产性能, 这样的人工选择对该位点造成影响 而随着选育群体规模的扩大, 以及在后期制定配种计划时考虑近交系数不至增长过快而尽量避免近交, 使得 ESR 基因的 PvuⅡ 酶切位点处于动态平衡中 衡量基因突变变异程度高低的多态信息含量指标,PIC>0.50 为高度多态位点,0.50>PIC>0.5 为中等多态位点,PIC<0.5 为低度多态位点 本试验中,ESR 基因的 PvuⅡ 位点为中等多态位点 多态信息含量 杂合度都是衡量群体内遗传变异大小的指标,

5 77 中国农业科学 45 卷 PIC 高杂合度大, 说明群体在该位点的遗传变异性高 ESR 基因的群体杂合度分别为 , 说明苏姜猪 目前还存在一定的选择的空间 目前研究表明, 雌激素与受体结合在雄性动物繁 殖功能的维持与受精过程发挥重要作用 [17-18] ESR (ESR1 ERα) 雄性敲除小鼠虽然繁殖器官结构正常, 但精子数量减少, 精子活力下降, 与母鼠交配率下降 [19-0] ESR 基因 mrna 在动物睾丸 附睾 前列腺等雄性生殖器官中均有表达 [1] 公猪 ESR 基因 mrna 在睾丸 附睾头 附睾尾 精囊腺和尿道球腺中有较强表达, 而在非繁殖器官, 如脑和肝脏中表达量较低 [] 说明 ESR 基因在精子的形成与成熟中可能发挥重要的生理功能 有研究表明,ESR 基因的多态位点与男性精子数密切相关 [3] [] Xing 等报道, 猪 ESR 基因位于单次射精的总精子数的 QTL 上并与公猪精子 [] 活力的 QTL 紧密相连 Gunawan 等研究发现, 公猪 ESR 外显子 1 g.67c>t 位点多态性显著影响公猪精子活力和脂质滴比例 (Plasma droplet rate), 内含子 g.35756t>c 位点与母猪配种后的返情率密切相关 可能 ESR 基因的碱基突变会改变公猪精液性状从而影响配种母猪的繁殖性能 猪为多胎动物, 产仔数属限性性状, 公猪的选择主要集中于生长性状与肉质 [4], 强调生长速度的选择使得公猪精液品质和繁殖性能均有所下降 [5] 以往的研究注重于 ESR 基因与母猪的繁殖性状的分析 [6], 随着人工授精技术的运用, 对公猪繁殖性状的研究越来越受到人们的重视 [5] 有研究表明, 同样条件下采用人工授精的方式,3 头公猪配种的母猪受胎率可以达到 75%, 而第 4 头公猪只有 33% [7] 本研究发现,ESR 基因对不同基因型苏姜公猪交配母猪的繁殖性状无显著效应, 但 BB 型有提高产仔数的趋势 同时, 考虑交配公 母猪的基因型时发现,BBAA 型的总产仔数与 ABAA ABAB 比较, 差异显著, 与其它 3 种基因型相比有提高的趋势 说明 BB 型公猪与母猪交配后同样具有提高产仔数的效应 此结果也可能是 ESR 基因对母猪繁殖性能影响的研究结果各不相同的原因之一 公猪的基因型与母猪的基因型是否有相加效应及其提高母猪繁殖性能的机理还有待进一步研究, 但可以肯定的是对繁殖性状而言不可忽视公猪的作用 [8] 虽然从本试验结果看, 随着总产仔数的提高, 死胎数也显著提高, 但是可以通过改善孕期饲养管理及营养水平来降低死胎数, 达到提高产仔数的目的 因此, 对今后苏姜猪的培育工作而言,ESR 基因的 PvuⅡ 酶切位点可以作为公猪和母 猪繁殖性状的遗传标记加以利用, 使得产仔数这一性状能够得到改良 4 结论 苏姜猪 ESR 基因的 PvuⅡ 酶切位点的 B 等位基因频率和 BB 型个体数随世代的增加在不断上升 BB 型个体的公猪产仔数有增加的趋势, 在与 AA 型母猪交配后产仔数相对于基因型分别为 ABAA ABAB 的公母猪交配后的产仔数显著提高 References [1] 经荣斌. 江苏省地方猪种的保存和选育的演变. 猪业科学, 009(): Jing R B. The evolvement of preservation and breeding of native pig breeds in Jiangsu province. Swine Industry Science, 009(): (in Chinese) [] Xing Y, Ren J, Ren D, Guo Y, Wu Y, Yang G, Mao H, Brenig B, Huang L. A whole genome scanning for quantitative trait loci on traits related to sperm quality and ejaculation in pigs. Animal Reproduction Science, 009, 114(1-3): [3] Rothschild M F, Jacobson C, Vaske D A, Tuggle C K, Wang L, Short T H, Eckardt G R, Sasaki S, Vincent A M, Mclaren D G, Southwood O, van der Steen H, Mileham A, Plastow G. The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs. Proceedings of the National Acadamy of Sciences, 1996, 93: [4] Short T H, Rothschild M F, Southwood O I, Mclaren D G, de Vries A, van der Steen H, Eckardt G R, Tuggle C K, Helm J, Vaske D A, Mileham A J, Plastow G S. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines. Journal of Animal Science, 1997, 75(1): [5] Noguera J L, Varona L, Gómez-Raya L, Sánchez A, Babot D, Estany J, Messer L A, Rothschild M, Pérez-Enciso M. Estrogen receptor polymorphism in Landrace pigs and its association with litter size performance. Livestock, 003, 8(1): [6] 兰旅涛, 周利华, 李琳, 陈东军. 3 个外来种猪群 ESR 基因位点多态性及其与繁殖性能相关性分析. 江西农业大学学报, 006, 8(1): Lan L T, Zhou L H, Li L, Chen D J. Polymorphism of ESR gene and its relationship to reproduction performance in three western commercial pig breeds herds. Acta Agriculturae Universitis Jiangxiensis, 006, 8(1): (in Chinese) [7] 施启顺, 柳小春, 刘志伟, 李小平, 李永辉, 唐凡. 5 个与猪产仔数相关基因的效应分析. 遗传, 006, 8(6):

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