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1 细菌内毒素检测技术与应用 熊向党冯聚锦韦群 2007 年 6 月第一稿 湛江安度斯生物有限公司广东省湛江市人民大道中 38 号邮编 : 电话 : 传真 : 网址 : 电邮 :zacb@pub.zhanjiang.gd.cn

2 目 录 一 细菌内毒素检测技术的应用与发展 2 二 细菌内毒素检查的基础理论 5 三 凝胶法细菌内毒素检查技术 12 四 光度法细菌内毒素检查技术 27 五 细菌内毒素检查的常见干扰及消除 42 六 细菌内毒素检查法在药品生产质控的应用 45 七 辅剂及相关产品的使用 50 八 细菌内毒素检查常用术语 符号及英文缩写

3 一 细菌内毒素检测技术的应用与进展 1 热原 2 历史回顾 鲎试剂与细菌内毒素检查 3 BET 的发展趋势与特点 1 热原 热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 Webster 将热原定义为 致热剂 1) 早期的热原研究 静脉疗法的研究与热原的研究密切相关 在 世纪有很多关于静脉疗法的报道, 所有病人在注射后都伴随有发热反应, 当时的医生都深信发热对人体有益 1912 年,Hort 和 Penfold 阐明注射发热的真正本质, 将细菌分为热原和非热原两种 : 革兰氏阴性细菌为热原细菌 革兰氏阳性细菌为非热原细菌 他们推断出所有的注射发热都是由革兰氏阴性细菌产生的可滤过的 热稳定的物质导致的 2) 热原的检测 1941 年, 美国 USP FDA 和 NIH( 美国国家卫生研究所 ) 邀请了 14 个制药厂商参与第一次热原的协作研究 1942 年, 美国药典第一次收载热原检查法 该方法是将一定量的供试品通过静脉注入家兔体内, 在规定时间内, 观察家兔体温升高的情况来判定供试品中所含热原量是否符合规定 3) 细菌内毒素检查 (BET) 利用鲎试剂来检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素, 用以判断供试品中细菌内毒素含量是否符合规定 2 历史回顾 鲎试剂与细菌内毒素检查 1) 国际 1956 年, 美国科学家 Frederic Bang 发表论文 鲎的一种细菌性疾病, 阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象 随后,Bang 和 Levin 发明了鲎试剂 1980 年,FDA 发表使用鲎试剂检查人用和兽用注射药终成品内毒素的准则 ; 美国药典 20 版 (USPXX) 收载 BET 法 1989 年英国药典收载 BET 法 1991 年日本药局方收载 BET 法 1999 年,USPXXIV 版规定 670 种药品用 BET 法检查, 保留热原检查的药品约 20 种 2000 年, 国际调和委员会使 USP EP 和 JP 达成 BET 的国际调和案, 统一的 BET 法收载于 USPXXIV 版 NF19 的第二增补本中, 并于 2001 年 1 月 1 日生效 2) 国内 1983 年, 由 11 个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的成立 1988 年, 卫生部颁布 细菌内毒素检查法 和鲎试剂标准 1991 年, 卫生部部颁标准规定 4 种药品可使用细菌内毒素检查法 1993 年, 中国药典 (CP) 九零版第二增补本收载 BET 法 1995 年版 CP 规定 13 个品种使用 BET 法 2000 年,CP2000 版细菌内毒素检查品种增至 69 种 ; 附录 细菌内毒素检查法应用指导原则 中收录了 BET 定量法 2005 年,CP2005 版细菌内毒素检查品种增至 168 种 ;BET 法正式收载光度测定法 - 2 -

4 3 BET 发展趋势与特点 1)BET 技术的发展趋势 (1) 细菌内毒素检查取代热原检查 自 19 世纪 80 年代 FDA 批准鲎试验的应用以来,BET 法所具有的优点 : 快速 灵敏 可标准化等, 表明它比热原检查法更适应现代制药工业的发展 各国药典规定的 BET 检查品种都经历了从无到有, 从少到多的过程 BET 取代热原检查已成为趋势 (2) 走向统一的 BET 法 在初期各国颁布的 BET 法不尽相同, 不利于药品的全球流通 WH 实现了内毒素的国际标准品 (IS) 的效价 (IU) 与各国内毒素标准品的效价 (EU) 的统一, 即 1IU=1EU 国际调和委员会综合 USP EP JP 的 BET 法, 达成一个国际协调案 统一的 BET 法, 于 2001 年实施 中国药典 2005 年版的 BET 法基本参照统一的 BET 法 2) BET 技术及应用发展的特点 (1)BET 方法呈多样化 凝胶法 比浊法 比色法 - 动态比浊法 - 终点比浊法 - 动态比色法 - 终点比色法 (2)BET 趋向自动化 凝胶法 恒温设备方面, 干式恒温仪器逐步取代水浴恒温箱 定量 BET 试管式定量检测仪 酶标板式定量检测仪 全自动的 BET 系统 专用的数据软件 (3) 湛江安度斯在 BET 方法学及技术上的发展 专利 1: 同体系模型法 专利 2: 动态终点法 专利 3 细菌内毒素快速检测 TAL-40 型试管恒温仪 ( 凝胶法 ) BET 专用软件 生物探针 )BET 试剂的发展 鲎试剂的灵敏度越来越高 凝胶法最高达 EU/ml, 商品试剂 0.015EU/ml 定量法高达 0.001EU/ml 生物探针 湛江安度斯公司 湛江安度斯是国内唯一能批量生产高灵敏 度鲎试剂的厂家 权威的研究报告表明 : 安度斯公司的鲎试剂 具有较强的抗干扰性能

5 鲎试剂抗干扰性能更强 干扰 BET 的因素 :ph 值 离子浓度 干扰物质 鲎试剂特异性更好 试剂特异性的重要性 相关法规对试剂特异性的要求 特异性试剂的种类 BET 辅剂的应用 缓冲剂 : 调节 ph 值 稀释剂 : 补充二价阳离子 抗增液 : 增强抗 β- 葡聚糖的能力 4) 高技术的产物 --- 便携式生物检测系统 (PTS) 快捷 方便的检测仪 第一代产品可作快速 定量的 BET(7~15 分钟 ) 发展方向 特异性强的 BET β 葡聚糖检测 革兰氏细菌快速鉴别 取代传统的染色法 微量蛋白的快速测定 应用领域 : 制药 医学 食品卫生 环保 5)BET 应用的领域越来越广 药品检验 药品生产过程质控中美两国鲎试剂应用比较中国美国终成品检查 (%) 生产质控 (%) 临床应用 : 辅助诊断 其它领域 : 食品卫生, 环境保护 - 4 -

6 二 细菌内毒素检查的基础理论 1 细菌内毒素 2 鲎试剂 3 BET 检查用水 4 BET 检查程序 年版细菌内毒素检查法 6 相关参数的计算 7 试验相关知识 1 细菌内毒素 1) 化学成分及特性 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 是高分子量脂多糖复合物 (LPS) 单体分子量介于 10,000 至 20,000 道尔顿 典型地以 100,000 至 500,000 道尔顿的聚合体形式存在 (1) 特性致热性内毒素作用于人体细胞, 使之释放内原性热原, 再刺激下丘脑体温调节中枢, 引起发热反应耐热性需要在 250 摄氏度干热 30 分钟才能彻底灭活 分子极性 酸碱性 鲎反应性 多糖链有亲水性, 脂肪链具有疏水性, 在水中呈不均匀分布 与强酸强碱水解反应 能与鲎试剂发生多级酶促反应, 形成凝胶 除上述性质外,LPS 还有许多其它的生物活性 (2) 化学结构 含有 3 个截然不同的区域 - 特异侧链 核心多糖 类脂 A 2) 细菌内毒素与热原的关系 内毒素是热原之一种 医药工业接受的观点是, 内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原, 控制内毒素污染就等于控制热原污染 3) 标准内毒素与环境内毒素 标准内毒素 - 5 -

7 经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素, 作为 BET 检查的参考品或对照品 标准内毒素分内毒素标准参考品 (RSE) 和内毒素工作标准品 (CSE) CSE 的效价必须用 RSE 来标化 目前 CSE 的效价有两种标示方法 : 固定效价法 ( 中国 ) 及浮动效价法 ( 国际 ) 环境内毒素 天然产生的内毒素, 普遍存在于水 空气及各种原料中, 成份除了脂多糖外还含有蛋白质 多糖和其它杂质, 其两极活性不明显, 致热性较弱 BET 的对象是环境内毒素 4) 标准内毒素溶液的制备 中国药典 2005 年版 BET 法要求, 将细菌内毒素国家标准品用 BET 检查用水溶解后, 需在旋涡混合器上混匀 15 分钟, 以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混合 30 秒钟 其他国家的 BET 法也有类似的要求 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 2 鲎试剂 1) 鲎试剂的分类 根据鲎的种类分类 : 美洲鲎试剂 (LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂 (TAL) 根据检查方法分类 : 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 根据鲎试剂的反应特异性分类 : 普通鲎试剂 特异性鲎试剂 2) 鲎试剂的规格 一般分单次试验试剂和多次试验试剂 ( 也称大装量试剂 ) 把自身的包装容器作为反应试管的试剂成为单次试验试剂, 在国内使用的 0.1ml/ 支的鲎试剂就属于单次试验试剂 多次试验试剂有 0.5ml/ 支 1.2ml/ 支等, 使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂 3) 鲎试剂的质量标准 灵敏度 定义 : 在细菌内毒素检查法规定的条件下, 能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度, 单位为 EU/mL 常用鲎试剂的灵敏度 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml 0.03EU/ml 自身凝集 - 6 -

8 部颁标准, 鲎试剂的阴性对照在 37 度 4 小时不产生凝集反应 缓冲能力 干燥失重 无菌 : 中国标准无此项要求 4) 鲎试剂与内毒素的反应机理 β 葡聚糖或 LAL-RM 旁路反应 活化 C 因子 内毒素 C 因子 G 因子 活化 G 因子 活化 B 因子 B 因子 凝固酶 凝固酶原 凝胶法 比浊法 凝固蛋白 ( 凝胶 ) 凝固蛋白原 显色法 AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA( 酶作用物 ) AC-Ile-Glu-Ala-Arg-H pna( 对硝基苯胺, 黄色 ) 405nm 测吸光度值 3 BET 用水 2000 年版药典要求,BET 用水应为与灵敏度为 0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在 37 ±1 条件下 24 小时不产生凝聚反应的灭菌注射用水 2005 年版药典要求, 凝胶法 BET 用水应为内毒素含量小于 0.015EU/ml 的灭菌注射用水 ; 光度测定法用的 BET 用水内毒素含量应少于 0.005EU/ml 美国药典要求的 BET 用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水 4 BET 程序 1) 验证实验 凝胶法 灵敏度复核试验 干扰试验 光度测定法 标准曲线可靠性试验 干扰试验 2) 检查法 凝胶法 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 终点法 - 终点比色法试验 动态终点法 : 湛江安度斯公司创造的新方法 光度测定法 动态法 - 动态比浊法试验 - 动态比色法试验 - 7 -

9 5 中国药典 2005 年版细菌内毒素检查法 1) 综述部分 细菌内毒素检查法的定义及 BET 方法学分类 内毒素标准品及检查用水 BET 器具的要求 供试品溶液的要求 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数的计算 2) 实验部分 (1) 凝胶法 鲎试剂灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 (2) 光度测定法 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 检查法 3)2005 年版药典 BET 法实验部分主要内容 鲎 试 验 方 法 凝胶法 光度测定法 限量法 半定量法 动态法 终点法 动态浊度 动态显色 终点浊度 终点显色 灵敏度预试验 1 有效条件预试验 2 无干扰条件检查法有效条件 以标示灵敏度 表示灵敏度复核试验各浓度平行 4 管, 阴性对照 2 管 1D 阴性 20.5 c 2 干扰试验 1A D 阴性 Es 2 0.5Es Et 2Es A B C D 各平行 2 管 ( 共 8 管 ) 1 B C 阳性 2 D 阴性 以标准曲线最低浓度 表示标准曲线验证试验各浓度平行 3 管, 阴性对照 2 管 TD>TC 干扰试验 % R 200% 3TD>TC A B C D 各平行 2 管 ( 共 12 管 ) % R 200% 3TD>TC - 8 -

10 6 相关参数的计算 1) 内毒素限值 (1) 药品 生物制品的细菌内毒素限值 (L) 一般按以下公式确定 : L=K/M L 为供试品的细菌内毒素限值, 以 EU/ml EU/mg 或 EU/U( 活性单位 ) 表示 ; K 为人每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量, 以 EU/(kg h) 表示, 注射剂 K=5 EU/(kg h), 放射性药品注射剂 K=2.5 EU/(kg h), 鞘内用注射剂 K=0.2EU/(kg h); M 为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量, 以 ml/(kg h) mg/(kg h) 或 U/(kg h) 表示, 人均体重按 60kg 计算, 注射时间若不足 1 小时, 按 1 小时计算 (2) 内毒素限值计算举例 注射用头孢曲松钠舒巴坦钠, 成人最大剂量为 1500mg/ 次 5EU/ (kg h) L= =0.20EU/mg 1500mg/(60kg h) 注射用人头孢孟多酯钠, 成人每日剂量为 2.0~8.0g, 分 3~4 次给药, 一日最高剂量不超过 12g 5EU/ (kg h) L= =0.075EU/mg (12000mg/3)/(60kg h) 对于大输液 (LVP), 美国药典 (USP) 通常都取 L 值为 0.5EU/ml 2) 最大有效稀释倍数 供试品最大有效稀释倍数 (MVD) 按下式计算 : MVD=cL/λ C 为供试品溶液的浓度, 其中当 L 以 EU/ml 表示时,c 为 1.0ml/ml; 当 L 以 EU/mg 或 EU/U 表示时,c 的单位为 mg/ml 或 U/ml 凝胶法中,λ 为鲎试剂的灵敏度光度测定法中,λ 为标准曲线最低点浓度 如使用鲎试剂灵敏度为 0.25EU/ml, 注射用头孢曲松钠舒巴坦钠 ( 浓度为 10mg/ml,L=0.25EU/mg) 的最大有效稀释倍数为 : 10mg/ml 0.2EU/mg MVD= =8( 倍 ) 0.25EU/ml 3) 最低有效浓度 (MVC) MVC=λ/L 如使用鲎试剂灵敏度为 0.25EU/ml, 注射用头孢曲松钠舒巴坦钠的最低有效浓度为 : 0.25EU/ml MVC= =1.25mg/ml 0.20EU/mg 4) 样品稀释过程中加液量的计算 稀释过程中, 假设从溶液 S1 取 (x)ml 溶液稀释 (n) 倍至 S2, 加液量为 (y), 则满足 Y=(n-1) x 如从溶液 S1 取 0.5ml 稀释 3.8 倍至 S2, 则加液量为 : Y=(3.8-1) 0.5=1.4(ml) 即 0.5ml 的 S1 加 1.4ml 稀释液即得 S1 的 3.8 倍稀释液 S2-9 -

11 7 试验相关知识 1) 内毒素标准品的使用 (1) 复溶 复溶 2ml 安瓿装的内毒素标准品, 为了避免溶液在混合时溢出安瓿, 我们建议在安瓿颈部上方开口加液 复溶液的体积一般为 1.0ml, 或根据使用说明书加液 (2) 效价 厂家必须向用户提供一份效价分析证书 (Certificate of Analysis,CoA), 效价分析证书上应注明 :RSE/CSE? EU/ng;? ng/ 瓶 2) 鲎试剂的使用 使用前, 应将鲎试剂置于室温环境下使其达到室温温度后再复溶使用 复溶鲎试剂后, 应避免强烈振动产生泡沫 由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性, 反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阴性 开口部位 3) 内毒素的清除 (1) 冲洗 适用于器械组件 塞子等 可用加热等方法提高清除效率 (2) 蒸馏折流系统和地心引力阻止大分子量的 LPS 转变为蒸汽状态逸出 (3) 反渗透 (4) 超滤 (5) 活性炭吸附 4) 内毒素的灭活 (1) 酸 / 碱水解 (2) 氧化 H22 (3) 干热 250,>30 分钟的干烤

12 三 凝胶法细菌内毒素检查技术 1 凝胶法 BET 试验程序 2 试验器具 3 鲎试剂灵敏度复核 4 干扰初筛试验 5 干扰试验 6 检查法 7 相关知识及技巧 1 凝胶法 BET 的实验程序 1) 试验准备 2) 确定供试品的内毒素限值 3) 选择鲎试剂 4) 计算最大有效稀释倍数或最低有效浓度 5) 鲎试剂灵敏度复核 6) 干扰初筛试验 7) 干扰试验 8) 日常检查 2 试验器具 1) 器具的要求及处理 玻璃器皿需经除热原处理, 以除去可能存在的外源性内毒素, 常用方法是玻璃器皿经清洗后 >250 至少干烤 1 小时 塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具 2) 孵育反应仪器 恒温水浴箱 干式恒温仪 孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一 现行法规对反应温度的要求较宽松 (37±1 ) 严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一 80 年代发达国家已使用干式恒温仪取代水浴箱 2000 年版 中国药典 BET 法开始接受干式恒温仪 TAL-40 型试管恒温仪的特点 温控精确 :37±0.2 发热均匀 :<0.1 可定时及提示 :0~90 分钟可设定时 蜂鸣提示 试管免封口 使用方便

13 3 鲎试剂标示灵敏度的复核 1) 实验目的 验证实验室的条件是否满足 BET 实验的要求 验证实验人员的操作技能是否满足 BET 实验的要求 验证实验所用试剂 ( 包括鲎试剂 内毒素标准品 BET 检查用水等 ) 是否满足 BET 实验的要求 2) 实验步骤 恒温仪器的预热 C 溶液 ( 标准内毒素溶液 ) 的制备 鲎试剂的准备 加样及恒温反应 结果判断 数据处理 3) 操作步骤示意图 内毒素 RSE 或 CSE BET 水复溶 鲎试剂 TAL BET 水复溶 混匀 旋涡混合器混合 15min 轻轻转动瓶壁摇匀 混匀 稀释为 2λ λ 0.5λ 0.25λ 内毒素标准溶液 (C 溶液 ) 每步稀释于旋涡混合器混合 30 秒 单次管 : 原安瓿 多次管 : 反应试管 0.1mlTAL0.1mlCSE(RSE), 平行 4 管 NC:0.1mlTAL0.1mlBET 水, 平行 2 管 混匀 ( 水浴恒温需封口 ) 4) 灵敏度复核试验举例 (1) 试剂 37 ±1, 孵育 60min±2min 试剂名称厂家规格标示效价数量 TAL 安度斯 0.1ml/ 支 0.25EU/ml 18 内毒素标准品 (CSE) 安度斯 10ng/ 瓶 10EU/ng 1 BET 水 (W) 安度斯 50ml/ 瓶 <0.003EU/ml

14 (2)C 溶液的制备 BET 水 1.0ml 3.6ml 3.6ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 混合 5 分钟 0.4ml 0.4ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 30s 30s 30s 30s 30s 30s 100EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml (3) 鲎试剂的准备取 0.1ml 装量, 灵敏度为 0.25EU/ml 的鲎试剂 18 支, 在安瓿颈部折断, 按照阴性对照溶液 D 两支, 标准内毒素溶液每浓度平行 4 管排列 : 0.25EU/ml 阴性对照溶液 D 0.5EU/ml 0.06EU/ml 0.125EU/ml 用精确移液器准确吸取 0.1mlBET 水分别加入每支鲎试剂中, 使鲎试剂全部溶解 (4) 加样用精确移液器分别吸取 0.1ml 的 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml 的标准内毒素溶液, 加入已复溶的鲎试剂中, 每浓度平行 4 管, 吸取 0.1mlBET 用水 (D 溶液 ) 加入另外两支鲎试剂内, 作为阴性对照 CSE 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml NC 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TAL 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 加样顺序一般从低浓度到高浓度 (5) 恒温反应 将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀 ( 避免产生气泡 ), 放入 37±1 的恒温器中孵育 60±2 分钟 ( 孵育过程中

15 避免振动影响凝胶形成 ) 若恒温装置是水浴恒温箱, 那么在加样后需将反应管封口, 避免水蒸气进入反应管内造成污染 (6) 结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出, 缓缓倒转 180, 若管内形成凝胶, 并且凝胶不变形 不从管壁滑脱者为阳性, 记录为 ; 未形成凝胶或形成的凝胶不坚实 变形并从管壁滑脱者为阴性, 记录为 阳性 阴性 结果判断 : 反应管缓缓倒转 180º 阳性 (): 凝胶不变形, 不从管壁滑脱者阴性 (-): 凝胶不能保持完整, 从管壁滑脱者试验符合要求的基本条件 : NC 管全部阴性 (--) 2λ 管全部阳性 () 0.25λ 管全部阴性 (----) (7) 数据处理平行管内毒素标准溶液浓度 (EU/ml) NC 反应终点浓度 X (lg 反应终点浓度 ) λ c =lg -1 (ΣX/4) =lg -1 {[(-0.903)(-0.602)( )( )]/4} = 0.210EU/ml 即在本批号鲎试剂的复核灵敏度 (λc) 为 0.21EU/mL 药典要求 : 当 λ c 在 0.5λ~2λ( 包括 0.5λ 和 2λ) 时, 方可用于细菌内毒素检查, 并以标示灵敏度 λ 为该批鲎试剂的灵敏度值 结论 : 本批 TAL 的灵敏度标示值符合规定 4 干扰初筛试验 1) 目的及原理 本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验, 通过对一系列含 2λ 内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应, 初步筛选出对鲎试验 无干扰的浓度 本试验可减少干扰试验的盲目性 2) 试验步骤 供试品限值的确定 供试品最大有效稀释倍数的确定

16 试剂的选择 反应溶液的制备 加样及反应 结果判断 3) 干扰初筛试验举例 (1) 供试品限值 硫酸庆大霉素,100ml/ 瓶,20000U/ml; 药典要求, 硫酸庆大霉素限值 L=0.5EU/1000U (2) 最大有效稀释倍数的确定 最大有效稀释倍数 MVD=cL/λ 使用 λ=0.5eu/ml 灵敏度的鲎试剂时, MVD0.5= 由此可计算出使用不同 λ 时所对应的 MVD: 20000U/ml 0.5EU/1000U 0.5EU/ml =20( 倍 ) 灵敏度 λ(eu/ml) 对应的 MVD( 倍 ) (3) 试剂 试剂名称 厂家 规格 标示效价 数量 TAL 安度斯 0.1ml/ 支 0.25EU/ml 24 内毒素标准品 (CSE) 安度斯 10ng/ 瓶 10EU/ng 1 BET 水 (W) 安度斯 50ml/ 瓶 <0.003EU/ml 1 为了方便试验, 干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验 (4) 各反应溶液的制备 溶液编号 A D 溶液内容 S 20 S 40 S 80 S 160 S 320 W 平 行 管 溶液编号 B C 溶液内容 S 20 E 2λ S 40 E 2λ S 80 E 2λ S 160 E 2λ S 320 E 2λ E 2λ 平行管 溶液 C 的制备 : E ml 3.6ml W E ml E 1 0.5ml E 0.5 溶液 C: E 2λ

17 溶液 A 的制备 : 3.6ml W 0.5ml W S 原液 0.4ml 3.6ml W S ml 1.4ml W S ml 1.4ml W S ml 1.4ml W S ml 1.4ml W S 160 1ml 1ml W S 320 溶液 A 溶液 B 的制备 : E 1 0.5ml S 20 E 0.5 E 1 0.5ml S 40 E 0.5 E 1 0.5ml S 80 E 0.5 S 10 E 1 0.5ml 0.5ml S 20 S 160 E 0.5 E 1 0.5ml 0.5ml S 320 E 0.5 溶液 B: SE 2λ S ml S ml 注意事项 : 制备溶液 C 和 B 时, 每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少 30 秒 S ml (5) 加样及反应 用移液器准确吸取 0.1ml BET 水将鲎试剂复溶 取 0.1ml 相应溶液 C B A 加入鲎试剂反应管, 每浓度平行 2 管 另外取 0.1ml BET 水作为阴性对照溶液 D 加入鲎试剂反应管 (6) 结果判断 溶液编号 A D 溶液内容 S 20 S 40 S 80 S 160 S 320 W 平 行 管 溶液编号 B C 溶液内容 S 20 E 2λ S 40 E 2λ S 80 E 2λ S 160 E 2λ S 320 E 2λ E 2λ 平行管 当溶液 A D 均为阴性 ; 溶液 C 均为阳性时, 试验有效 溶液 B 系列中, 第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度 本试验中的样品无干扰浓度为 S

18 5 干扰试验 通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度, 来确定供试品在该浓度下是否对 BET 检查有干扰 至少对 3 批样品进行干扰试验 1) 试验步骤 供试品限值的确定 鲎试剂的选择 最大有效稀释倍数的确定 反应溶液的制备 加样及反应 结果判断 (1) 供试品限值 硫酸庆大霉素,20000U/ml; 药典要求内毒素限值 L=0.5EU/1000U (2) 试剂选择 试剂名称 厂家 规格 标示效价 数量 TAL 安度斯 0.1ml/ 支 0.125EU/ml 36 内毒素标准品 (CSE) 安度斯 10ng/ 瓶 10EU/ng(CoA) 1 BET 水 (W) 安度斯 50ml/ 瓶 <0.003EU/ml 1 根据干扰初筛试验的结果, 供试品在 40 倍稀释 ( 对应鲎试剂灵敏度为 0.25EU/ml) 时无干扰 一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验 本试验我们选择灵敏度为 0.125EU/ml 的鲎试剂进行干扰验证试验 (3) 最大有效稀释倍数的计算 MVD=cL/λ=80( 倍 ) (4) 各反应溶液的制备 溶液编号 B A 溶液内容 S80E0.25 S80E0.125 S80E0.06 S80E0.03 S80 平行 管 溶液编号 C D 溶液内容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03 W 平行管

19 溶液 C 的制备 : CSE 稀释 (E4λ ) E2λ Eλ E0.5λ E0.25λ ( 即 E0.5 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03) BET 水 1.0ml 3.6ml 3.6ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 混合 5 分钟 0.4ml 0.4ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml CSE (EU/ml) s 30s 30s 30s 30s 30s 30s 溶液 A 的制备 : 溶液 C 2.7 ml 3.0 ml 0.6 ml BET 水 0.3ml 1.0ml 0.6ml 硫酸庆大霉素 S S 10 S 40 溶液 A:S 80 溶液 B 的制备 E ml E ml S 80 E 0.25 S 80 E S ml S ml E ml S 80 E E ml S 80 E S ml S ml (5) 加样及反应 0.25EU/ml (2λ) 0.125EU/ml (λ) 0.06EU/ml (½ λ) 0.03EU/ml (¼ λ) BET 水 S 80 E 0.25 (S 80 E 2 λ) S 80 E (S 80 Eλ) S 80 E 0.06 (S 80 E ½ λ) S 80 E 0.03 (S 80 E ¼ λ) S

20 36 支鲎试剂, 先用 0.1ml BET 复溶, 再加相应的溶液 0.1ml 37 ±1 反应 60±2 分钟 (6) 结果判断 反应结果 溶液编号 B A 溶液内容 S 80 E 0.25 S 80 E S 80 E 0.06 S 160 E 0.03 S 80 平 行 管 溶液编号 C D 溶液内容 E 0.25 E E 0.06 E 0.03 W 平 行 管 结果计算及判断 (lg0.125) 4 ES=lg -1 4 = EU/ml Et=lg -1 (lg0.06) (lg0.125) 3 4 = EU/ml 药典要求 : 当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性, 且 0.5λ Es 2λ 时, 试验有效 当 0.5 Es Et 2 Es 时, 供试品在该浓度下无干扰 本试验 : 1)0.5λ=0.06,2λ=0.25 E s =0.125,0.5λ< E s < 2λ, 有效! 2)0.5E s =0.06,2E s =0.25 E t =0.104,0.5 E s < E t < 2 E s, 无干扰! 结论 : 使用灵敏度 λ=0.125eu/ml 的鲎试剂对样品 (S) 的 80 倍稀释液 (S 80 ) 作 BET, 无干扰 6 检查法 1) 凝胶法限量试验 (1) 反应项目设置 溶液编号 A B C D 溶液内容 S SE 2 λ E 2 λ W 平 行 管

21 (2) 试剂 试剂名称厂家规格灵敏度或效价数量 TAL 安度斯 0.1ml/ 支 0.125EU/ml 8 CSE 安度斯 10ng/ 支 10EU/ng 1 BET 水 (W) 安度斯 50ml/ 瓶 <0.003EU/ml 1 硫酸庆大霉素 (S) 100ml/ 支 20000U/ml 1 根据干扰试验结果, 供试品在 80 倍稀释, 使用鲎试剂灵敏度为 0.125EU/ml 条件下, 对 BET 无干扰 本试验选择 TAL 灵敏度为 0.125EU/ml, 供试品稀释 80 倍检查 (3) 反应溶液制备 E 溶液 100 C: 0.4ml 0.4ml 1.6ml 0.6ml E 10 E 1 E ml W 3.6ml W 1.6ml W 0.6ml W E 0.25 溶液 A: S 原液 0.3ml 2.7ml W S ml 1.8ml W S ml 0.6ml W S 80 溶液 A 溶液 C 溶液 B: E ml S 80 E 0.25 溶液 B S ml (4) 加样及反应 8 支鲎试剂, 先加 0.1mlBET 水复溶 ; 再加入相应的溶液, 每浓度平行 2 管 溶液 D(NC,0.1mlW) 溶液 C( E 0.25 ) 溶液 A( S 80 ) 溶液 B( S 80 E 0.25 ) (5) 结果判断溶液编号 A B C D 溶液内容 S80 S80E0. 5 E0. 5 W 试验有效合格不合格需复检 复检合格 复检不合格

22 当需要复检时,A 溶液平行 4 管, 若所有平行管均为阴性, 则供试品合格 ; 否则不合格 2) 凝胶法半定量试验 (1) 反应项目设置 编 号 内毒素浓度 / 加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数 A 无 / 供试品溶液 检查用水 B 2λ/ 供试品溶液 1 2λ 2 C 2λ/ 检查用水 检查用水 λ 1λ 0.5λ 0.25λ D 无 / 检查用水 2 注 :A 为不超过 MVD 并且通过干扰实验的供试品溶液, 从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释成 1 倍,2 倍,4 倍,8 倍, 最后的稀释倍数不得超过 MVD B 为 2λ 浓度标准内毒素的溶液 A( 供试品阳性对照 ) C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D 为阴性对照 (2) 凝胶半定量试验举例 i. 试剂 鲎试剂 (TAL) 内毒素 (CSE) BET 水 (W) 供试品 ( 生理盐水 ) 0.06EU/ml 10ng/ 瓶 ;10EU/ng 50ml/ 瓶 L=0.5EU/ml 凝胶半定量法一般选用灵敏度较高的鲎试剂 ii. 各溶液的制备 i) 溶液 C 的制备 将 CSE 稀释成 E 0.125, E 0.06, E 0.03, E 浓度溶液 E ml 3.6ml W E ml 1.8ml W E ml 1.8ml W E ml 1.8ml W E

23 ii) 溶液 A 的制备 将供试品 (S 1) 稀释至 2 倍 4 倍 8 倍 1.8ml 1.8ml 1.8ml S 1 1.8ml W S 2 1.8ml W S 4 1.8ml W S 8 iii) 溶液 B 的制备 E ml S 1 E 近似稀释法 S 1 1.8ml iii. 加样及反应 溶 液 A B C D S1 S2 S4 S8 S1E0.125 E0.125 E0.06 E0.03 E0.015 W 平行管 iv. 结果判断 试验有效条件 : 溶液 D:-- 溶液 B: 溶液 C:E 且 E ( 即 0.5λ λ c 2λ ) 溶 液 A B C D S1 S2 S4 S8 S1E0.125 E0.125 E0.06 E0.03 E0.015 W 平 行 管 v. 结果计算 S1 S2 S4 S8 A 反应终点倍数反应终点浓度 (EU/ml) 平行管 = =0.06 所有平行管的反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度 [CE=Lg -1 ( X/2)]: lg -1 lg0.125lg

24 供试品内毒素浓度 (CE)= 2 =0.08(EU/ml) 当溶液 A 所有平行管均为阴性时, 供试品溶液的内毒素浓度小于 λ 乘以初始稀释倍数 ( 本试验初始稀释倍数为 1); 当溶液 A 所有平行管均为阳性时, 供试品溶液内毒素浓度大于或等于 λ 乘以最大稀释倍数 ( 本试验最大稀释倍数为 8) 7 相关知识及实验技巧 1) 关于 ph 值的要求 CP2005 年版 BET 法要求 一般要求供试品的 ph 值在 6.0~8.0 范围 USP 的 BET 法要求是供试品与鲎试剂的混合液的 ph 值在 6.0~8.0; 推荐的做法 : 在验证试验时, 测定供试品溶液与鲎试剂的混合液的 ph 值, 如果满足要求 (ph 值在 6.0~8.0), 则在日常检查试验中无需调节 ph 值 如果不满足要求, 那么需进行 ph 的调节, 且日常检查试验时, 也必须进行同样的调节 2) 溶液 B 的制备方法如需制备 S 4 E 0.25 ( 供试品 4 倍稀释液, 其中含有 0.25EU/ml 的内毒素浓度 ) (1)50/50 法 E ml S 4 E 0.25 S 2 0.8ml 该法不能制备 S1E2λ (2) 近似法 E ml S 4 E 0.25 S 4 1.8ml 3) 一步法制备溶液 C 系列 如要制备 E 0.5,E 0.25,E 及 E 0.06 : E ml 0.8ml 0.8ml 2.4ml E 0.25 E ml 2.8ml E

25 四 光度测定法细菌内毒素检查技术 1 光度测定法方法学分类 2 光度测定法原理 3 动态比浊法 BET 4 终点比色法 BET 1 光度测定法方法学分类浊度法光度测定法 ( 比浊法 ) ( 定量法检测 ) 显色法 ( 比色法 ) 动态浊度法终点浊度法动态显色法终点显色法 2 光度测定法原理 1) 光电转换原理 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法 当一束光线进入如下光电转换装置时, 该装置将产生电流 I, 我们称 I 为透光强度 透光容器反应混合物 入射光 透射光 I 光电池 设 : 初始时的透光强度为 I s, 某时刻的透光强度为 I t, 如图 1 定义 1: 透光度 (R t ): Rt=It/Is(%) 初始时 It=Is,R t =100%,R t 曲线变化趋势由高至低, 如图 2 定义 2: 吸光度 (D): D= -lg(it/is) 初始时 I t =I s,d=0,d 曲线变化趋势由低至升高, 如图 3 选择不同的参数 (Rt 或 D) 将得到不同变化趋势的动态曲线 I I s 图 1 I t I e T( 分 ) 2)TAL 与内毒素反应的动态曲线 (R t -T 曲线 ) 以透光度 (R t) 为纵座标, 时间 (T) 为横座标, 把 TAL 与内毒素反应引起反应混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中, 便得到该反应的动态曲线如图 2:

26 Rt(%) 100 动态曲线 图 2 孕育期反应期结束 T( 分 ) 3)TAL 与内毒素反应的动态曲线 (D-T 曲线 ) 以吸光度 (D) 为纵座标, 时间 (T) 为横座标, 把 TAL 与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中, 便得到该反应的动态曲线如图 3: D 图 3 动态曲线 0 孕育期反应期结束 T( 分 ) 4) 动态曲线的特点 把标准内毒素制备成三个浓度 C 1 C 2 C 3( C 1>C 2>C 3 ), 分别与 TAL 反应, 描绘出反应的动态曲线如下图 : Rt(%) 分析动态曲线可看出 : 内毒素浓度越高, 孕育期越短 ; C1 C2 C3 内毒素浓度越高, 反应期曲线越陡 ; 内毒素浓度越高, 进入结束期越快 T( 分 ) 5) 光度测定法试验的相关变量 Rt (%) 相关变量 : 100 内毒素浓度 (C) 透光度 (Rt 或 D) 反应时间 (T) C3 C1 C2 T( 分 ) 6) 动态法原理

27 原理 : 固定透光度 ( Rt ) 建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线 (C-T 曲线 ), 用供试品的反应时间比对标准曲线, 得出供试品的内毒素浓度 这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值 (R 0 ) 的时间 (1) 建立标准曲线 Rt% 预设透光度值 (R0) T 3 LgT LgT=b-kLgC 回归分析 T 2 C 2 C 3 C 1 T 1 T1 T2 T3 T( 分 ) C 3 C 2 C 1 LgC (2) 测定样品内毒素浓度 (Cs) 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品 (S) 反应, 得到反应时间 Ts, 比对 C-T 关系的标准曲线, 可得出供试品的内毒素含 量 Cs Rt(%) LgT LgT=b-kLgC 92 R0 比对标准曲线 Ts Ts Cs T( 分 ) Cs LgC 7) 终点法原理原理 : 固定反应时间, 建立内毒素浓度与透光度关系的标准曲线 (C-Rt 曲线 ), 用供试品的透光度比对标准曲线, 得出供试品的内毒素浓度 (1) 建立标准曲线 Rt(%) 100 R 3 R 2 终点时间 回归分析 R 3 Rt Rt=b-K C R 1 R 2 C 1 C 2 C 3 R 1 预设反应终止时间 (To) (2) 测定样品内毒素浓度 (Cx) T( 分 ) C 3 C 2 C

28 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品 (X) 反应, 得到透光度值 Rx, 比对 C-Rt 关系的标准曲线, 可得出供试品的内毒素含量 Cx R t (%) R t (%) R t =b-k C 100 Rx 比对标准曲线 Rx C x To T( 分 ) Cx 3 动态比浊法 BET 1) 试验仪器及器具 动态微孔平板仪或试管仪 BET 软件 微孔平板 反应试管 32 孔动态试管仪 美国 Charles River Endosafe 动态 测定仪, 使用 96 孔微孔板 美国 Charles River Endosafe 内 毒素全自动测定系统 日本和光纯药株式会社 Toxinometer

29 美国 Bio-Tek Elx808IU 湛江安度斯公司开发的 BET 专用软件 生物探针 英国 Lab Kinetics 公司 ATi 动态试管仪, 96 孔 2) 动态比浊法试验程序 (1) 器具的准备 (2) 验证试验 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 (3) 检查法 (1) 试验器具的准备 器具分类反应试管稀释容器移液器具其他 器具名称玻璃试管 ( 外径 8 75mm 或 10 75mm) 大口径玻璃试管刻度吸管及洗耳球, 或移液器及无热原吸头等试管架 酒精灯 异丙醇浸泡的无纺布 镊子 剪刀 砂轮 封口膜或医用胶布 标记纸等 凡是与供试品或反应试剂接触的器具, 必须经除热原处理 通常玻璃器具 需经 分钟的干烤处理

30 (2) 标准曲线的可靠性试验 I. 试验目的 验证实验室的条件是否满足 BET 试验的要求 验证实验人员的实验技能是否满足 BET 试验的要求 验证实验所用试剂 ( 包括鲎试剂 内毒素标准品 BET 水等 ) 是否满足 BET 试验要求 II. 试剂 试剂名称 厂家 装量 规格 动态浊度法 TAL 安度斯 1.25ml/ 支 10EU/ml~0.03EU/ml 内毒素标准品 (CSE) 安度斯 10ng/ 支 10EU/ng(CoA) BET 水 (W) 安度斯 25ml/ 瓶 内毒素 <0.003EU/ml III. 反应项目 项目平行管 阴性对照溶液 (D) 内毒素标准 (C) (EU/mL) 将标准内毒素制备成至少 3 个浓度的稀释液, 相邻浓度间稀释倍数不得大于 10, 最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测 限 实验前, 先预热动态仪, 使其达到反应温度 IV. 溶液 C 的制备 BET 水 1.0ml 3.6ml 3.2ml 2.8ml 2.8ml 混合 5 分钟 0.4ml 0.8ml 0.4ml 0.4ml 30s 30s 30s 30s CSE/E 100 E 10 E 2 E 0.25 E V. 鲎试剂的准备 1 取 TAL 1 支, 用砂轮在安瓿颈划痕, 擦拭后从安瓿颈处折断 ( 避免玻璃屑落入安瓿内 ); 2 用刻度吸管或移液器准确吸取 BET 水 1.25ml 沿瓶壁加入安瓿内, 轻轻转动瓶壁, 使内容物全部溶解 ( 避免产生气泡 ); 3 取反应试管 11 支, 按 2.0 EU/ml 0.25 EU/ml EU/ml 各浓度平行 3 管,NC 平行 2 管标记 ; VI. 软件系统的设置 进入动态仪系统软件, 根据试验要求, 设置相关参数, 如反应时间 预设透光度值等 进入数据采集模块, 使软件进入待采集状态

31 VII. 加样反应 2.0EU/ml 0.25EU/ml EU/ml NC BET 水 CSE 加样顺序从低浓度到高浓度 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TAL 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 先将复溶好的鲎试剂分装至各反应试管中,0.1ml/ 管 ; 再将反应溶液加入各反应管中, 一般按照从低浓度到高浓度的顺序加样, 首先加阴性对照溶液 ; 加样完成后, 将每支反应管内的混合液轻轻混匀后, 插入动态仪中反应 VIII. 填写参数在软件给出的表格中填写反应项目及相应参数 IX. 结果判断 药典要求 阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间

32 标准曲线的相关系数 r 厂家建议值 变异系数 CV%<10% 关于相关系数 当对一组数据作线性回归分析时, 以相关系数 r 表示其标准曲线的线性状况, 即该组数据的相关状况 当 r 值为正时, 表示该组数据呈正相关关系 ;r 值为负时, 该组数据为负相关关系 当 r 值的绝对值 r =1 时, 其标准曲线的线性最好

33 (3) 干扰初筛试验 I. 目的及原理 只有在无干扰情况下, 样品的内毒素检测结果才是有效的 通过检测从供试品原液到其 MVD 或 MVC 之间的适当浓度的稀释液的内毒素回收率, 初步判断供试品的干扰情况 II. III. 试验步骤 (i) (ii) (iii) 供试品限值的确定 试剂的选择 供试品最大有效稀释的计算 (iv) 反应溶液的制备 (v) 加样及反应 (vi) 结果判断 干扰初筛试验举例 (i) 供试品限值 硫酸庆大霉素,100ml/ 瓶,5000U/ml; 药典要求, 硫酸庆大霉素限值 L=0.5EU/1000U (ii) (iii) (iv) 试剂 试剂名称厂家装量规格 动态浊度法 TAL 安度斯 1.25ml/ 支 10EU/ml~0.03EU/ml 内毒素标准品 (CSE) 安度斯 10ng/ 支 10EU/ng(CoA) BET 水 (W) 安度斯 25ml/ 瓶内毒素 <0.003EU/ml 本试验使用鲎试剂的检测范围为 10~0.03EU/ml, 选择标准曲线浓度为 EU/ml 最大有效稀释倍数的计算 光度测定法中, 供试品最大有效稀释倍数计算公式 : 本试验, MVD=cL/λ, 其中 λ 为标准曲线最低点浓度 MVD= 反应溶液的制备 溶液 C 的制备 : 5000U/ml x 0.5EU/1000U EU/ml =80( 倍 ) E ml E ml E 2 0.4ml E ml E ml W 3.2ml W 2.8ml W 2.8ml W 溶液 A 的制备 : 0.8ml 2.4ml W E 0.5 备用液 S 原液 0.4ml 3.6ml W S ml 1.4ml W S ml 1.4ml W S ml 1.4ml W S

34 溶液 B 的制备 : E ml S 20 E 0.25 E ml S 40 E 0.25 E ml S 80 E 0.25 S ml S ml S ml (v) 加样及反应 溶液 D 溶液 C 溶液 A 溶液 B BET 水 E E 0.25 E 2 S 20 S 20 E S 40 S 40 E S 80 取 TAL 两支, 参照标准曲线可靠性试验中的方 法将其复溶 ; 复溶鲎试剂后, 运行软件, 使其进入待采集 状态 ; 将两支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起, 轻 轻混匀避免产生气泡 ; 将鲎试剂液分装至 20 支反应试管中,0.1ml/ 管 ; 将相应的溶液 A B C D 加至反应管中, 0.1mL/ 管, 每浓度平行 2 管 S 80 E (vi) 结果判断 药典要求 1 阴性对照的反应时间(T D ) 大于标准曲线最低浓度的反应时间 (Tλ) 2 标准曲线的相关系数 r 回收率 R 满足 :50% R 200% 厂家建议值 4 变异系数 CV%<10% (vii) 回收率的计算光度测定法试验中, 在供试品检查浓度的溶液中, 添加标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度, 根据回收的内毒素浓度与添加的内毒素浓度的比值 ( 回收率 R), 判断供试品溶液对试验的干扰程度 R 的计算公式如下 : R= C s -C t m Ct: 试验测出的供试品溶液的内毒素含量 C s : 试验测出的加入 λ m 标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量 λ m : 标准曲线的中点或靠近中点的已知浓度内毒素光度测定法规定 : 当 R 在 50~200% 之间时, 认为在此试验条件下该供试品溶液对试验无干扰

35 湛江安度斯生物有限公司 viii 本试验结果 相关系数绝对值 r =0.9949>0.980 试验有效 试验有效 TD >3600s >Tλ 20倍回收率 有干扰 40倍回收率 无干扰 无干扰 80倍回收率 4 干扰试验 根据干扰初筛试验结果 确定选择供试品的无干扰浓度 I. 有干扰 不理想 无干扰 选择3批供试品进行干扰验证试验 溶液的制备方法与干扰初筛试验相同 II. 溶液的制备

36 湛江安度斯生物有限公司 编号 内毒素浓度 配制内毒素的溶液 平行管数 A 无 供试品溶液 不少于2个 B 标准曲线的中点 或附近点 的浓度 设 供试品溶液 不少于2个 为λm C 至少3个浓度 最低点设定为λ 检查用水 每一浓度不少于2个 D 无 检查用水 不少于2个 A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液 B为加入 m内毒素且与a溶液有相同稀释倍数的供试品溶液 C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液 D为阴性对照 反应项目设置 III. 溶液编号 项 目 平行管 阴性对照 D A1 S80 B1 S80E0.25 A2 S80 B2 S80E0.25 A3 S80 B3 S80E0.25 C 内 毒 素 标 准 E0.031 (EU/mL) E0.25 E2 IV. 3批样品都在同一浓度做干扰验证试验 每浓度平行2管 接受标准 药典要求 1 阴性对照的反应时间 TD 大于标准曲线最低浓度的反应时间 Tλ 2 标准曲线的相关系数 r 各批样品的回收率R满足 50% R 200% 厂家建议值 4 变异系数CV%<10%

37 湛江安度斯生物有限公司 5 检查法 日常检查 根据干扰试验结果 选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查 I. II. 各反应溶液制备及反应项目设置与干扰试验相同 溶液编号 项 目 平行管 D 阴性对照 C 内 毒 素 标 准 E0.031 (EU/mL) E0.25 E2 A S80 B S80E0.25 III. 结果判断 药典要求 1 阴性对照的反应时间(TD)大于标准曲线最低浓度的反应时间(Tλ) 2 标准曲线的相关系数 r 各批样品的回收率R满足 50% R 200% 厂家建议值 4 变异系数CV%<10% 若供试品溶液A所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后 小于规定的内毒素限值 判供试品符合规定 否则判供试品不符合规定 无复测要求 4 终点比色法BET 1 原理 当鲎试验的显色反应到达预设的反应终止时间 T0 时 反应混合液的吸光度值 D 与内毒素浓度 C 成正比 利 用标准内毒素建立D-C关系的标准曲线 利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量 2 仪器 分光光度计 酶标仪器 37 恒温仪器 3 试验程序 1 试验准备 仪器及用具等 2 确定药品的细菌内毒素限值 L 3 选择终点比色法试剂盒 终点比色法鲎试剂 显色基质 底物 工作标准内毒素 CSE 4 计算供试品的最大有效稀释 MVD 或最低有效浓度 MVC 5 标准曲线的可靠性试验 6 干扰试验 验证

38 湛江安度斯生物有限公司 7 检查法 日常检查 4 终点比色法日常检查举例 I. 试剂及器具 终点比色法试剂盒 终点比色法试剂 显色基质 底物 工作标准内毒素 CSE 酶标仪 405nm 微孔平板 96孔 无热原 微孔平板恒温器 提供37 恒温环境 供试品 S 生理盐水 L=0.5EU/ml II. 试验步骤 1 开启微孔平板恒温器预热 2 溶液C的制备 根据试剂盒说明书标准曲线浓度的要求 制备标准内毒素系列溶液 如1.0EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml及0.125EU/ml λ 3 溶液A B的制备 MVD=L/λ=0.5/0.125=4 倍 将供试品稀释到S2 S4 溶液A 1.2ml S4E0.5 溶液B 0.6ml S20.6E1.0 4 反应项目设置 溶液编号 项 平行管 阴性对照 D C 目 内 毒 素 标 准 E0.125 (EU/mL) E0.25 E0.5 E1 A S4 B S4E0.5 5 取微孔平板放到37 恒温器上 每孔加0.05ml相应溶液 A B C及D溶液 每溶液浓度平行2孔 加样完毕恒温孵育 5分钟* 6 复溶鲎试剂及显色基质 底物 7 每孔加入0.05ml鲎试剂 恒温7分钟* 8 每孔加入0.1ml显色基质溶液 恒温5分钟* 9 每孔加入0.1ml终止液 10 把微孔平板放入酶标仪中用405nm波长测吸光度值 11 根据各内毒素浓度对应的吸光度值建立内毒素浓度与吸光度值的标准曲线

39 湛江安度斯生物有限公司 12 利用标准曲线计算A B溶液的内毒素含量及供试品的回收率 此计算一般由仪器自动进行 判断实验的有效性与动态浊 度法相同 *此时间根据终点比色试剂盒使用说明书要求确定

40 湛江安度斯生物有限公司 五 细菌内毒素检查的常见干扰及消除 1 BET干扰的普遍性 一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围 在所研究的品种中仅30%的药品可以不经任何处理直接进行 BET 有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方法去消除 2 干扰的表现 1 凝胶法 FDA的鲎试验指南中规定 同一标准内毒素的阳性对照与阳性样品对照系列的反应终点存在显著差异时 即可确定为存在干 扰 0.5λ Es 2λ 0.5Es Et 2Es USP27规定无干扰条件 0.5λ Es 2λ 0.5λ Et 2λ 管数 2λ 1 溶液B Et SE2λ SE 2 2 光度法 3 CP USP规定无干扰条件 4 50% R 200% FDA规定无干扰条件 平行 50% R 150% 管数 1 2 最理想的无干扰状况 3 4 溶液 C Es 平行 管数 2λ 1 溶液 SE2λ SE 平行 管数 溶液 C Es 平行 CP2005规定无干扰条件 λ ½ λ ¼ λ SE½ λ SE¼ λ ¼ λ 管数 2λ 1 溶液 SE2λ SE SE½ λ SE¼ λ 不符合CP要求 但符合USP要求 3 4 平行 管数 溶液C Es ½ λ 2 λ 平行 B Et λ λ λ ½ λ ¼ λ B Et λ SE½ λ SE¼ λ 符合CP要求 但不符合USP要求

41 湛江安度斯生物有限公司 3 干扰的类型 抑制 供试品含有的内毒素浓度 2倍检测试剂的灵敏度 但检测结果仍为阴性 称之为假阴性 增强 供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2 但检测结果仍为阳性 称之为假阳性 4 抑制的来源 内毒素激活的酶反应受抑制 ph 二价阳离子的减少 酶的改良 内毒素损耗 吸附 损耗 5 抑制的解决办法 鲎试验的正常反应需要中性的pH值 一定浓度的钠离子及二价阳离子 用BET水稀释供试品可以解决大多数情况下的抑制 ph值 鲎试验的反应混合液 TAL供试品 的 ph 值应在 6~8 范围内 用BET水在容许范围对供试品内进行稀释 用缓冲液制备样品稀释液 用酸 碱或缓冲液来调节pH 二价阳离子 在含有鳌合剂的样品制备中使用MgS4缓冲剂可平衡Ca Mg离子的水平 蛋白和酶的改良 血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶可经加热处理使其变性 某些蛋白的变性或酶的抑制原料需要用超滤方法去除 内毒素损耗 在标准内毒素制备及使用过程 需要经常旋涡混合其溶液 避免使用对标准内毒素有吸附作用的实验器具 6 增强的来源和解决方法 1 来源 β-葡聚糖是造成鲎试剂结果假阳性的一个已知来源 USP24-NF-19 第二补充版 BET 法的要求 除了内毒素 鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应 一些经处理而制备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应 应用这种鲎试剂检测含葡聚 糖的样品 2 解决方法 用湛江安度斯公司的抗增液复溶鲎试剂可以消除 1-3 β-d 葡聚糖的干扰 湛江安度斯公司的 TAL 可以抵抗一般水平的β-葡聚糖干扰

42 湛江安度斯生物有限公司 0.1Mg/ml葡聚 糖 抗增液 NC 0.1Mg/ml葡聚糖E0.3 E0.3 抗增液 E0.03 E Mg/ml葡聚糖 每个浓度的标准内毒素溶液分别与抗增液 复溶的鲎试剂及BET水复溶的鲎试剂反应 0.1Mg/ml葡聚 糖E Mg/ml葡聚糖出现明显 的增强 0.1Mg/ml葡聚糖 抗增液 不存在干扰

43 湛江安度斯生物有限公司 六 细菌内毒素检查法在药品生产质控的应用 1 鲎试验对药品生产质控的意义 1 GMP的意义在于使人们对产品质量的控制从传统的成品检验把关 上升到对产品生产全过程进行有效监控的现代质量管理 2 医药领域中 在GMP条件下 热原就是内毒素 控制内毒素就控制了热原 已成为一致的认识 基于这种认识 许多国家 的药典药品已由细菌内毒素检查项取代热原检查项并且成为了发展的趋势 将会有越来越多的药典品种使用鲎试剂检查 不仅如此 鲎试验法已在医药工业上成为注射药品生产质控的最好方法之一 它为众多的药品生产企业带来显而易见的经 济效益 3 中国和美国是世界上应用鲎试剂最早的国家 也是鲎试剂产量及用量最多的国家 尽管如此 两国在鲎试剂应用的水平 程度及范围上仍有明显的差异 中国药典2005年版收载的BET品种有160多种 而USP收载的BET品种超过700种 检验方法的比较 凝胶法 中国 90% 美国 45% 动态浊度 5% 25% 鲎试剂应用的比较 动态显色 终点显色 终产品检验 生产质控 75% 25% 27% 3% 30% 70% 2 生产质控的基本要求 1 质量控制分事前控制和事后控制 药品生产过程的质量控制应属于事前控制 2 生产过程的质控又分静态质控及动态质控 3 对检验方式的要求 取样方便 微量 操作简单 快速 检查准确 灵敏 结果可靠并能自动处理数据 4 鲎试验法是药品生产过程热原控制的最好方法 鲎试验法的优点在于 取样方便 微量 ml 操作简便迅速 只需15 60分钟 灵敏 准确 可测出0.001EU/ml 的内毒素 定量检测的范围可涵盖 ,000EU/ml 可由仪器自动处理检测数据 鲎试验的优点使得药品生产过程热原质控能实现动态监控和事前控制 3 药品生产过程内毒素的控制方法 1 内毒素监控体系 1 监控对象 重要的媒体及原料 水是制药工业最重要的媒体 大量的原料 生产过程添加的各种辅剂 与中间体接触的各种用具 器皿及终产品的包装容器 各工序前后中间体内毒素水平的变化 至少在生产过程的重要工序之间要设置检测点 例如在除热原工序后设置检测点 检测该工序除热原 干烤 过滤 吸附 的效果 又如 在分装工序前需抽检 确保中间体内毒素水平不超出控制水平才进行分装 烘箱等除热原设备的验证 2 内毒素监控体系示意图

44 湛江安度斯生物有限公司 药品生产过程细菌内毒素监控体系 入库 生产原料 生产用具 容器 备用 清洗 除热原 Δ2 Δ1 原料 辅剂 Δ3 辅剂 Δ6 Δ7 工序2 Δ8 Δ5 Δ4 工序1 水 工序3 Δ9 Δ10 分装 终成品 Δ Δ1 Δ Δ2 Δ Δ3 Δ 入库 内毒素检测点 工序运行路线 取样 鲎试验检查 检测结果反馈 2 建立内毒素监控体系的步骤 确定药品的内毒素限值L 分析药品生产过程 合理设置内毒素监测点 制定各监测点合理的内毒素控制水平Lx 进行干扰性验证试验确定各监测点样品的有效浓度或有效稀释范围 选择所用鲎试剂 进行日常的内毒素监测检查 3 内毒素控制限值的确定 如果终产品的内毒素限值为L 各监测点的内毒素控制水平为LX 则LX L 某些原料或中间体在其后的生产工序中将要被稀释 计算其稀释后的内毒素含量ED 如果ED 1/2L 可以允 许该原料或中间体的内毒素控制水平LX L 例如 某种主要原料在生产时将要被稀释10倍以上使用 如果L 为0.5EU/ml 可以允许该原料的内毒素控制水平LX为2.5EU/ml 如果能确实保证在除热原工序后的中间体的内毒素含量至少低于1/2L 可允许该工序前的LX适当大于L 在制定各监控点LX时 应注意热原具有积累性 制药企业需要根据自身的生产条件及工艺水平来制定合理的 LX值 在欧美通常以1/10L~1/4L作为LX 4 干扰验证 目的 找出每个监测点的供试品的无干扰浓度 抽取监测点的适量样品 选择凝胶法鲎试剂的灵敏度或定量鲎试剂的标准直线范围 计算检测样品的最大有效稀释倍数MVD 样品与鲎试剂相容性的初筛试验

45 湛江安度斯生物有限公司 样品与鲎试剂的干扰试验 5 内毒素监控的常规检查 取样 鲎试验检查 结果分析 将信息反馈至生产控制系统 4 内毒素的快速检测方法 1 细菌内毒素快速检测试剂盒 湛江安度斯公司的专利产品 属于凝胶法 反应时间只需 20~25 分钟 操作方便 简单 详见本讲义第七 辅剂及相关产品的使用 2 光度法定性快速检测法 属动态浊度法或动态显色法 步骤 1 确定供试品原液 S0 的内毒素限值 L 2 确定供试品无干扰浓度 如 S8 3 制备不含可测内毒素的供试品 S8 4 制备含 L8 浓度标准内毒素的阳性供试品 S8L8 5 在日常检测时以 S8L8 与 TAL 反应的时间 T0 作为判断其它供试品内毒素含量的标准 见下图 凡是反应时间 T<T0 的供试品 其内毒素含量>L8 即原液 S0 的内毒素含量>L 凡是反应时间 T>T0 的供试品 其内毒素含量<L8 即原液 S0 的内毒素含量<L 只需供试品的动态曲线一达到预设光度值 即可知道该供试品是否合格 Rt % 100 S8 92 产品合格 预设透光度值 产品不合格 S8L8 3 光度法定量快速检测法 T1 T0 T2 T(秒) 属动态浊度法或动态显色法 需要使用安度斯软件 生物探针-2002 步骤 1 预先用标准内毒素与 TAL 反应制备一条标准曲线 存档 最理想的标准曲线是用同体系模型法建立 参阅本公司讲 义 2005 年 3 月版

46 湛江安度斯生物有限公司 2 检测开始前调出存档标准曲线 3 反应开始后 只要各供试品的动态曲线一达到预设光度值 界面上的表格中立即显示出该供试品的内毒素含量 注意事项 1 制备存档标准曲线的 TAL 必须与检测试剂相同 2 供试品应在无干扰浓度且不超过 MVD 浓度内检测 样品原液内毒素 调用的标准曲线 4 便携式检测系统PTS 详见本公司讲义 2005 年 3 月版 5 生产质控应用举例 下面的实例是某药厂对生产工艺用水连续25天的凝胶法 限量 和动态法 定量 的检测情况 该工艺用水的 细菌内毒素控制限值为0.125EU/ml 在第十一日时凝胶法呈阳性 立即对水系统进行处理 此后的第十二至二 十五日均为阴性 动态法的检测结果则揭示了内毒素的具体变化 在第八 九 十日内毒素含量明显上升 第 十日已经接近控制限值 按这一趋势 第十一日很可能超过限值 事实也确实如此 了解这一信息就可以在出 现不合格产品前采取预防措施 : (EU/mL) : 0.125EU/mL (天)

47 湛江安度斯生物有限公司 七 辅剂及相关产品的使用 1 内毒素指示剂 1 用途 用于干热设备灭活内毒素程序验证 2 使用方法 1 保留1~2支内毒素指示剂作为未经干热对照品 2 除去指示剂标签 开启 用铝箔纸把指示剂包裹 3 把指示剂放置在烤箱的不同位置 一般放置10~15个点 指示剂应与除热原物料夹放在一起 4 按灭活内毒素程序进行干烤 5 对经灭活程序后的指示剂进行鲎试验测试 6 数据分析 3 使用举例 内毒素指示剂 标示效价2500EU/支 鲎试剂 标示灵敏度 λ 0.25EU/ml 1 未经干热的内毒素指示剂效价确认 按标示效价稀释至4λ 2λ λ λ/2 λ/4 BET水 3.6ml 1.0ml 0.4ml 混合10分钟 3.6ml 3.2ml 3.2ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 0.4ml 0.8ml 0.8ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 30s 30s 30s 30s 30s 30s 30s 30s 2500EU/ml 250EU/ml 25EU/ml 5EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml 2 500倍 5 000倍 倍 倍 倍 2 经干热的指示剂 1.0ml BET水 3.6ml 0.4ml 混合10分钟 30s S1 S10 经干热的指示剂需稀释至出现阴性结果的浓度 3 结果计算及判断 反应终点倍数 未经干热的指示剂 平 行 管 反应终点浓度 EU/ml) X0.25= X0.25=

48 湛江安度斯生物有限公司 lg 可回收内毒素量Rc= lg5000lg =3535(EU/瓶) 2 反应终点倍数 经干热的指示剂 1 平 行 管 EU/ml) 10 残余内毒素量Rs< 反应终点浓度 lg -1 <1 <1X0.25=0.25 <1 <1X0.25=0.25 lg0.25lg0.25 即Rs<0.25(EU/瓶) 2 内毒素衰减lgRd=lgRc-lgRs>4 2 稀释剂I 稀释剂II 1 用途 稀释剂是一种细菌内毒素检查辅助剂 主要用于消除鲎试验的干扰因素 稀释剂I含有一定浓度的二价离子 用于枸橼酸盐类抗凝剂及血液保养液的细菌内毒素检查 稀释剂II用于调节样品的pH值 2 用法 稀释剂主要用于对样品的稀释 必须要经过验证试验 确认对试验无干扰后才能用于日常检查 仅用于配套本公司鲎试剂使用 勿用于其它厂家的鲎试剂产品 3 应用举例 稀释剂 1.6 ml 0.4ml BET水 1.0 ml 1.0ml 样品 S S5 S10 SMVD 用稀释剂稀释样品 以达到消除干扰的目的 必须做干扰验证试验 3 抗增液 1 用途 抗增液是一种细菌内毒素检查辅助剂 用于阻断β-葡聚糖的干扰 假阳性 2 使用方法 抗增液使用时 用来代替BET水复溶鲎试剂 仅用于配套本公司鲎试剂使用 勿用于其它厂家的鲎试剂产品

49 湛江安度斯生物有限公司 3 应用举例 材料 样品 人血白蛋白 国产 低温乙醇工艺 热原检查合格 L=1.33EU/ml 鲎试剂 0.1ml/支 灵敏度λ=0.125EU/ml 抗增液 安度斯产品 0.6ml/支 MVD=cL/λ=10倍 干扰验证试验 溶液编号 0.1ml BET水复溶 溶液内容 C E0. 25 D E0.125 E0.06 E0.03 W 平 用BET水复溶的 鲎试剂反应存在 干扰 增强 行 管 溶液编号 溶液内容 B S10E0.25 S10E0.125 A S10E0.06 S10E0.03 S10 平 0.1ml 抗增液复溶 行 管 用抗增液复溶 溶液编号 的鲎试剂反应 溶液内容 干扰消除 平 行 管 B S10E0. 25 S10E0.125 A S10E0.06 S10E0.03 S10 4 细菌内毒素快速检测试剂盒 用途 用于生产过程中 细菌内毒素的限量快速检测 特点 使用方便 快速检测盒内配置与国际使用接轨的单次试验鲎试剂 TAL 使用这种单次试验TAL时 直接加0.2ml样品复溶试剂兼检测 不必象使用0.1ml/支TAL那样要先加0.1ml的水复溶试剂 然后再加0.1ml样品检测 同一试剂盒有多个灵敏度供选择 我们在每一批号的快速检测试剂盒上都标示有至少两个可供选择的灵敏度 使用时选择不同的灵敏度(λ0)对应有不同的反应 时间(T0) 如批号为 的快速检测试剂盒 灵敏度标示如下 λ0 T0 0.25EU/mL 20±1分钟 0.125EU/mL 25±1分钟

50 湛江安度斯生物有限公司 CSE无需稀释 我们我们知道 在细菌内毒素检查过程中 最繁琐耗时的操作就是稀释标准内毒素 CSE 快速检测试剂盒配备了无需稀 释一步到位的CSE 使实验真正快速方便 配套器具 如虎添翼 在使用快速检测试剂盒时 如果配合使用湛江安度斯公司提供的可调移液器 采样瓶 可定时的干式恒温仪等实验器具 可 真正体会到BET实验的快速 准确及方便 试剂盒组成 名称 规格 数量 鲎试剂TAL 0.2ml/支 8支 λ 0.125EU/ml / 0.25EU/ml 工作标准内毒素CSE ng/支 EU/ng 1支 BET水 2ml/支 1支 使用方法 检查项目 反应管数 每管加样 阴性对照溶液D 2 0.2mL TRW 阳性对照溶液C 2 0.2mLTRW0.01mLE5 供试品阳性对照溶液B 2 0.2mLS0.01mLE5 供试品溶液A 2 0.2mLS 以λ=0.125EU/ml为例 加样方法如上表 若λ为0.25EU/ml则加样时 加入 浓度0.02ml E5-49 -

51 湛江安度斯生物有限公司 八 细菌内毒素检查常用术语 符号及英文缩写 常用术语 英文缩写或符号 表 示 内 容 BET 细菌内毒素检查(测) Bacterial Endotoxin Test) LAL 美洲鲎试剂 (Limulus Amebocyte Lysate) TAL 东方鲎试剂 (Tachypleus Amebocyte Lysate) TRW/LRW 鲎试验用水(TAL/LAL Reagent Water) RSE 内毒素参考标准品 (Reference Standard Endotoxin) NSE 内毒素国家标准品(National Standard Endotoxin) CSE 内毒素工作标准品 (Control Standard Endotoxin) LPS 脂多糖 (Lipopolysaccharide) EU/IU 内毒素单位 (Endotoxin Unit / International Unit) K 内毒素耐受阈值 (Endotoxin Tolerance Limit) M 人体每公斤体重每小时最大用药剂量 Maximum Human dose per KG per hour L 内毒素限值 (Endotoxin Limit) L=K/M MVD 最大有效稀释 (Maximum Valid Dilution) MVD=L/ MVC 最低有效浓度(Minimum Valid Concentration) MVC=1/MVD LVP 大输液 (Large Volume Parenteral) SVP 小输液 (Small Volume Parenteral) Gel-clot Technique 凝胶法技术 Photometric Technique 光度测定法技术 Gel-clot Limit Test 凝胶限量试验 Gel-clot Assay 凝胶半定量试验 KTA 动态浊度法 Kinetic Turbidimetric Assay KCA 动态显色法 Kinetic Chromogenic Assay ETA 终点浊度法 Endpoint Turbidimetric Assay ECA 终点显色法 Endpoint Chromogenic Assay Inhibition 抑制 Enhancement 增强 Interference 干扰 NWC 阴性水对照 (Negative Water Control) NC 阴性对照 (Negative Control) PWC 阳性水对照 (Positive Water Control) PC 阳性对照 (Positive Control) NPC 阴性产品对照 Negative Product Control PPC 阳性产品对照 (Positive Product Control)

52 湛江安度斯生物有限公司 A 药典 BET 法中表示供试品溶液 系列 B 药典 BET 法中表示添加内毒素标准的供试品溶液 系列 C 药典 BET 法中表示内毒素标准溶液 系列 D 药典 BET 法中表示阴性对照 λ 凝胶法鲎试剂标示灵敏度(Lambda) 或光度法标准曲线的最低浓度 m 光度法标准曲线的中点浓度 c 凝胶法灵敏度复核试验的测定值 Es 凝胶法干扰试验 C 溶液系列测定的灵敏度值 Et 凝胶法干扰试验 B 溶液系列测定的灵敏度值 γ 相关系数 (Correlation Coefficient) CV 变异系数 Coefficient of Variation) SD 标准方差 (Standard Deviation ) CoA 分析证书 Certificate of Analysis CoQ 质量证书 Certificate of Quality QA 质量保证 Quality Assaurance QC 质量控制 (Quality Control) SP 标准操作规程 (Standard peration Procedure) D 光密度 (ptical Density) Absorbance 吸光度值 Regression Analysis 回归分析 STD Curve 标准曲线 Standard Curve Linearity 线性 GM 几何平均 Geometric Mean Valid Verification 有效验证 nset Time 动态法的反应时间