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1 1298 方法研究 盐酸莫西沙星注射液细菌内毒素检查方法学研究 张横, 蔡彤, 高华 * ( 中国食品药品检定研究院, 北京 ) 摘要 : 目的研究建立盐酸莫西沙星注射液的细菌内毒素检查方法 方法按 中国药典 2010 年版二部附录 ⅪE 细菌内毒素检查法及相关规定, 使用 2 个不同厂家的鲎试剂对某制药有限公司生产的盐酸莫西沙星注射液进行了细菌内毒素检查法的方法学研究 结果调节 ph 值至 6.0~8.0, 使用稀释剂 Ⅰ 稀释浓度至 0.625mg ml -1 时, 可排除干扰作用 结论盐酸莫西沙星注射液可适用细菌内毒素检查法 拟定标准 : 取本品, 依法检验 ( 中国药典 2010 年版二部附录 XIE), 每 1mg 盐酸莫西沙星中含细菌内毒素的量应小于 0.8EU 关键词 : 盐酸莫西沙星注射液 ; 细菌内毒素 ; 鲎试剂 ; 干扰试验 中图分类号 :R927 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) StudyofBacterialEndotoxinTestforMoxifloxacinHydrochlorideInjection ZhangHeng,CaiTongandGaoHua * (NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050) ABSTRACT: Objective To studythebacterialendotoxininspection methodofmoxifloxacinhydrochloride injection.methodsaccordingtobacterialendotoxininspectionmethodandtherelatedregulationsofthechinese Pharmacopoeia2010volumeⅡappendixXIE,twodiferentmanufacturerslimulusreagentswereusedtotestsome pharmaceuticalcompanyofmoxifloxacinhydrochlorideinjectiononbacterialendotoxininspectionmethodofstudy. ResultsByadjustingpH valuesofsamplesto rangeandusingthethinnerⅠfordilutingthesample concentrationto0.625mg ml -1,interferencewasremoved.ConclusionMoxifloxacinhydrochlorideinjectionin bacterialendotoxintestmethodisapplicable.standardsestablishment:takethisproductandtestthataccordingto guideline(chinesepharmacopoeia2010volumeⅡappendixxie)withtheamountlessthan0.8euinthebacterial endotoxinofmoxifloxacinhydrochlorideper1mg. KEY WORDS: moxifloxacin hydrochlorideinjection;bacterialendotoxin;limulusamebocytelysate; interferencetest 盐酸莫西沙星是一种具有广谱抗菌活性的第四代喹诺酮类抗菌药, 在体外对革兰阳性菌 革兰阴性菌 厌氧菌 抗酸菌和非典型微生物如支原体 衣原体和军团菌有广谱抗菌活性 本品用于临床的适应证包括 : 成人上呼吸道和下呼吸道感染, 如急性鼻窦炎 慢性支气管炎急性发作 社区获得性肺 [1-3] 炎及皮肤和软组织感染 本试验探讨盐酸莫西沙星注射液建立细菌内毒素检查项的可行性, 并对 3 批盐酸莫西沙星注射液的细菌内毒素含量进行了检测 1 试剂 1.1 盐酸莫西沙星注射液某制药有限公司, 规格 :20 ml/ 瓶 ; 浓度 : 400mg/20mL; 批号 : 1.2 鲎试剂湛江安度斯生物有限公司, 规格 :0.1 ml; 批号 : ; 灵敏度 :0.25EU ml -1 湛江博康海洋生物有限公司, 规格 :0.1mL; 批号 : ; 灵敏度 :0.25EU ml 细菌内毒素国家标准品 通信作者 : 高华, 博士生导师 ;Tel:(010) ; huag55@163.com

2 中国食品药品检定研究院, 规格 :1 ml; 批 号 :150600~200707; 效价 :10000EU/ 支 1.4 细菌内毒素检查用水 中国食品药品检定研究院, 规格 :10 ml; 批 号 : 稀释液 Ⅰ 含有二价金属离子的稀释液, 用于排除螯 合金属离子所产生的干扰作用, 湛江安度斯生物有 限公司 ; 规格 :4mL; 批号 : 仪器 电热恒温水温箱 ( 北京五洲东方科技发展有限 公司 ) 漩涡混合器 (Vortex-Genie2) 移液器 (ThermoFisher) 2 试验与结果 [4] 2.1 细菌内毒素的限值确定 公式 :L=K/M 根据盐酸莫西沙星注射液使 用说明 推荐本品的输液时间应为 90min, 推荐剂 量为一次 0.4g, 一日一次 确定 M 为 267mg -1 h K 为按规定的给药途径, 临床无任何不良反应的内 毒素阈剂量, 注射液为 5EU (kg h) -1 ; 中国人 平均体重按 60kg 计, 则 L= 5EU (kg h) -1 [267mg h -1 60kg]=1.12EU mg -1 考虑到 在实际使用时, 盐酸莫西沙星注射液会被溶解到大 输液中, 而大输液本身也含有内毒素, 为保证联合 用药的安全, 将盐酸莫西沙星注射液内毒素限值进 一步严格, 制定为 0.8EU mg -1 [5] 2.2 鲎试剂灵敏度复核实验 按 中国药典 2010 年版二部附录 ⅪE 细菌 内毒素检查法, 进行鲎试剂的标示灵敏度复核, 结 果见表 1 所示 1299 表 1 鲎试剂灵敏度复核 TAL 批号标示灵敏度 /λ NC 灵敏度 /λc EU ml EU ml EU ml EU ml -1 此 2 批鲎试剂经用细菌内毒素国家标准品复核 灵敏度,λC 在 2.0λ 至 0.5λ 之间, 结果均符合规定 [5-8] 2.3 干扰实验预实验 盐酸莫西沙星注射液有效稀释倍数 (MVD) 的计算公式 MVD= L C/λ; 其中 L 为盐酸莫西 沙星注射液的细菌内毒素限值 0.8EU mg -1, 盐 酸莫西沙星注射液浓度 :400 mg/20 ml 即 20 mg ml -1 λ 为鲎试剂标示灵敏度, 目前市售鲎试 剂灵敏度 λ 通常在 0.5~0.03EU ml -1 则盐酸 莫西沙星注射液的对应最大有效稀释倍数为 : MVD0.5= (0.8 20) 0.5=32 倍 ;MVD0.25= (0.8 20) 0.25=64 倍 ;MVD0.125= (0.8 20) 0.125=128 倍 ;MVD0.06= (0.8 20) =256 倍 ; MVD 0.03= (0.8 20) =512 倍 取盐酸莫西沙星注射液, 用细菌内毒素检查用水分别稀释至 倍, 将此系列浓度溶液记为 NPC 同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液, 使每一浓度的实验液中均含有 2λ (λ 为所用鲎试剂的标示灵敏度 ) 浓度的细菌内毒素, 记此系列溶液为 PPC 取灵敏度为 0.25 EU ml -1 的 2 个不同厂家的鲎试剂, 分别与上述 PPC 和 NPC 进行反应, 每一浓度重复两管, 并设阳性和阴性对照 结果见表 2 表 3 表 2 稀释倍数 PPC

3 1300 表 3 稀释倍数 由以上干扰实验预实验结果可以初步了解 : 此 3 批对 2 个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应存在着较强的抑制作用 由于此 3 批的 ph 值在 4.0 左右, 偏酸性, 可能会对内毒素与鲎试剂的反 应存在一定的干扰作用, 利用氢氧化钠饱和溶液调 节 ph 值在 6.0~8.0 间, 重复干扰试验预实 验 结果见表 4 表 5 表 4 稀释倍数 表 5 稀释倍数 PPC PPC 通过以上实验结果可以看出 : 调节 ph 值至 6.0~8.0, 此 3 批对 2 个厂家的鲎试剂与内毒素反应依然存在着较强的抑制作用 分析中含有对金属离子具有螯合作用的物质, 会导致溶液中游离的金属离子减少或缺失 由于细菌内毒素与鲎试剂的反应须在有二价 Ca 2+ Mg 2+ 的存在下才能进行, 因此, 具有螯合作用的会对细菌内毒素检 测会带来一定影响 为排除螯合作用带来的干扰, 使用特殊的稀释液来稀释, 保证内毒素与鲎试剂的正常反应, 且考虑酸度可能带来的干扰, 同时考察调节 ph 值的影响 取 1 批,1 支利用饱和氢氧化钠溶液调节 ph 值至 6.0~8.0, 另 1 支不调节 ph 值, 分别使用稀释剂 Ⅰ 稀释至 倍, 进行干扰试验预实验的摸索 结果见表 6 表 7

4 1301 表 6 ( 未调 ph 值 ) ( 调 ph 值至中性 ) 稀释倍数 PC NC PPC PPC 表 7 ( 未调 ph 值 ) ( 调 ph 值至中性 ) 稀释倍数 PC NC PPC PPC 综合考虑的 ph 值及螯合作用带来的干 扰, 先利用饱和氢氧化钠溶液调节 ph 值至 6.0~8.0, 再使用稀释液 Ⅰ 替代检查用水来稀释样 品, 从而保证细菌内毒素与鲎试剂的正常反应 再 次进行干扰试验预实验, 结果见表 8 表 9 表 8 稀释倍数 表 9 稀释倍数 由以上干扰实验预实验结果可以看出调节 ph 值至 6.0~8.0 后, 并使用稀释剂 Ⅰ 代替细菌内毒素检查用水稀释, 在稀释至灵敏度为 0.5EU ml -1 鲎试剂对应的 MVD:32 倍 ( 浓度 为 0.625mg ml -1 ) 时即无干扰作用 [5,11] 2.4 正式干扰试验 为了最终确认是否存在干扰因素的影响, 进行以下正式干扰实验 取盐酸莫西沙星注射液调节 ph 值至 6.8~8.0, 用稀释液 Ⅰ 稀释 ( 至 32 倍 ) 和细菌内毒素国家标准品, 按 中国药典 二部附录 ⅪE 细菌内毒素检查法, 使用灵敏度为 0.25EU ml -1 的鲎试剂进行实验, 结果见表 10 表 11

5 1302 表 3-10 盐酸莫西沙星注射液的干扰试验 NC Es/(EU ml -1 ) Et/(EU ml -1 ) 水溶液 稀释液 Ⅰ 表 11 盐酸莫西沙星注射液的干扰试验 NC Es/(EU ml -1 ) Et/(EU ml -1 ) 水溶液 稀释液 Ⅰ 正式干扰试验结果 : 所有 Es/Et 均在 0.5~2.0 研究表明 : (1) 分别使用细菌内毒素检查用水及稀释液 Ⅰ 稀释细菌内毒素标准品,Es 同为 0.25EU ml -1, 说明稀释液 Ⅰ 对细菌内毒素检查无干扰作用 ; (2) 此 3 批对 2 个厂家的鲎试剂确认在 32 倍 ( 浓度为 0.625mg ml -1 ) 稀释下无干扰作用, 且细菌内毒素含量均小于 0.8EU mg -1, 符合拟定标准 3 结果与讨论由干扰实验预实验结果可以初步发现批号为 的盐酸莫西沙星注射液由于 ph 偏酸性和存在对金属离子具有螯合作用等原因, 对鲎试剂与细菌内毒素的反应存在着较强的抑制作用, 稀释至灵敏度为 0.06EU ml -1 对应的 MVD 仍不能有效排除干扰, 需通过调节 ph 值至 6.0~8.0 并适当添加二价金属离子, 方能排除干扰作用 ( 稀释至灵敏度为 0.5EU ml -1 鲎试剂对应的 MVD:32 倍时对 2 个鲎试剂厂家的鲎试剂即无干扰作用 ) 正式干扰实验使用经以上方法处理后并稀释至 32 倍的稀释液 ( 浓度为 mg ml -1 ), 实验结果 Es/Et 在 0.5~2.0, 确定所采用的排除干扰的方法可行, 消除了对鲎试 [12] 剂与细菌内毒素反应的干扰影响 研究结果表明, 当使用适宜的方法排除干扰作用后, 盐酸莫西沙星注射液可适用细菌内毒素检查法, 且供样单位提供的批号为 的内毒素含量均小于 0.8EU mg -1, 符合拟定标准 拟定标准 : 取本品, 依法检验 ( 中国药典 2010 年版二部附录 XIE), 每 1mg 盐酸莫西沙星中含细菌内毒素的量应小于 0.8EU 参考文献 : [1] Wikipedia:Moxifloxacinhydrochloride[DB/OL].[ ]. htp://en.wikipedia.org/wiki/moxifloxacin_hydrochloride [2] 杨小红, 李会敏, 张立华. 临床用药指南 [M]. 石家庄 : 河北大学出版社,2009:51. [3] 段皎. 盐酸莫西沙星注射液治疗社区获得性肺炎的临床观察 [J]. 中国实用医药,2013,8 (2): [4] 夏振民. 药品细菌内毒素检查的限值 [J]. 药物分析杂志, 1995,15 (3): [5] 中国药典 [S]. 二部,2010: 附录 ⅪE [6] 中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010: [7] 刘帅英, 王益民, 陈卫平, 等. 维生素 C 注射液细菌内毒素检 查中干扰问题的探讨 [J]. 海峡药学,2013,25 (4): [8] 祝清芬, 国明, 程春雷. 注射用大观霉素细菌内毒素检查法 标准修订 [J]. 中国药事,2010,24 (1): [9] 汪伟. 注射用奥美拉唑钠细菌内毒素检查法考察 [J]. 解放 军药学学报,2012,28 (4): [10] 陈丹丹, 付步芳, 付海洋, 等. 蛋白质补充液的细菌内毒 素检测 [J]. 中国药事,2013,27 (8): [11] 蔡彤, 张国来, 李波, 等.84 种注射用药品细菌内毒素检查法的 方法学研究 [J]. 中国药学杂志,2010,45 (2): [12] 周筱莉. 我国细菌内毒素检查法的应用进展 [J]. 中国医 药导报,2010,7 (23): ( 收稿日期 编辑范玉明 )

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