Microsoft Word - LAL使用说明

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1 凝胶法鲎试剂使用说明书 用途 : 鲎试剂是鲎阿米巴细胞的抽提液, 用于通过凝胶法进行定性检测内毒素 概述 : 鲎试验是一种最灵敏和专一的内毒素检查方法, 它是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物, 通常称为热原 鲎试验的原理是内毒素与 LAL 反应可形成易于分辨的凝胶 简单 经济的的鲎试验使得它已广泛应用于半成品 原材料以及药品 医疗器械和生物制品等产品的检查 美国药典的细菌内毒素检查法和美国 FDA 指南为有效验证鲎试验法代替兔热原法提供了标准方法 凝胶法是一种简单 重现性好的检测方法, 将等量的凝胶法试剂和检品混合并及时放在 37 下保温加热 60 分钟 阳性反应表明检品中的内毒素含量等于或超过试剂的标示灵敏度, 用 λ 表示 生物原理代替兔热原法的可行方法的发展由 Hopkins 大学的研究者们发起 Frederick Bang 观察到细菌导致美洲鲎血管内的血液凝结 在协作研究中,Levin 和 Bang 发现导致凝结现象的因素存在于鲎的阿米巴细胞中或循环血液细胞中, 热原 ( 细菌内毒素 ) 触发浊度和凝胶形成酶促反应 在阿米巴细胞的溶解物中发现的丝氨酸酶由内毒素和二价阳离子激活后引起一系列酶促反应, 这改变了大量的蛋白凝结物, 产生蛋白酶凝胶 由于放射性药品需要一种合适的热原检测法使得 Cooper Levin 和 Wagner 将这一新方法扩大应用到药品中 1970 年的一个比较研究显示鲎试验法比兔法更灵敏, 而且试剂活性 ( 凝胶和不断增加的浊度 ) 与内毒素浓度相关联 鲎试剂的改善 标准方法的制定和自动系统的开发以及对鲎试剂的反应能力的进一步理解使得鲎试剂立即被广泛应用到各种生物制品 非经肠道药品和医疗器械的检查中 鲎试剂反应要求中性的 ph 值并依赖于时间和内毒素浓度 鲎试验局限于使用检品的溶液或抽提液, 大多数的鲎试验干扰都可用简单稀释来克服 美国 FDA 终产品检测指南 : 美国食品与药品管理局在 1987 年发布了一份准则, 通知生产人用药品和生物制品 兽用药品和医疗器械的厂商,FDA 认为有必要验证鲎试验作为终产品的内毒素检测方法, 那些遵照鲎试验准则的厂商将被认为符合 CGMPs 有关规定 非经肠道药品的通用内毒素限值是 5 个内毒素单位 (EU) 每公斤剂量, 但鞘内药品的限值是 0.2EU/Kg, 医疗器械浸取液不得超过 0.5EU/ml; 与脑脊髓接触的器械的限值为 0.06EU/ml 预防 鲎试剂只用于体内诊断, 不用于检测内毒素血症, 使用时须小心因为其毒性仍不为人所知 所有与样品接触的材料或检测材料必须是无热原的, 玻璃器皿必须经有效除热原, 例如 200 干热 3 小时 标示已灭菌和处理过的塑料制品通常是无热原的, 然而那些不能经高温灭菌的材料或销售时没有无热原标签的材料应小心检测其是否含内毒素 可提供的试剂可提供 5.2ml/vial 50 次管和 1.2ml/vial 10 次管的冻干的鲎试剂, 试剂含有缓冲的阿米巴细胞溶解物并已用单价和二价阳离子加以稳定

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3 1. 加 0.1 毫升的每个检测样品的稀释液到检测试管中, 至少重复两管 2. 加 0.1 毫升的复溶的鲎试剂到每个试管中, 先加阴性对照, 最后加最高内毒素浓度 接着用手或低速旋涡混合检测试管以避免混合了人工制品 3. 将反应试管放在 37 的水浴或干浴中恒温 60±2 分钟, 鲎试剂与内毒素的反应时间很关键, 如果有很多样品待测, 反应应以 2-4 分钟的间隔开始, 以便在上述时间限制内读取每一个检测 由于鲎试剂的反应对温度很灵敏, 应小心监测恒温器 还有, 凝胶形成反应是很脆弱的, 如果在保温期间受到干扰, 凝胶会被改变 B. 内毒素对照系列 ( 阳性水对照 ) 1. 如果显示与标准终点一致, 不需要每次检测都要做内毒素标准系列, 做第一套实验时应至少每天做一次内毒素标准系列, 如果鲎试剂有任何变化, 应重新做一次 2. 应用库存的溶液制备一套新鲜稀释的 2 倍稀释系列, 包括试剂的标示灵敏度, 将 0.1ml 每个浓度的内毒素加到 10 75mm 的反应试管中, 至少重复两管检测, 从阴性 ( 水 ) 对照开始 3. 加 0.1ml 的鲎试剂至每支反应试管中, 先从阴性对照开始, 并按要求混合 4. 将反应试管放在 37 下不受干扰保温一小时 C. 检测对照 1. 将 0.1ml 用于检测的 LAL 检查用水加入重复两管中 2. 阴性水 ( 内毒素 ) 对照 : 没有内毒素系列时, 加 0.1ml 的 2λ 浓度的内毒素标准品 3. 阳性样品对照 : 加 0.1ml( 双份 ) 的含 2λ 浓度内毒素的混合物到检品中, 可根据有效条件进行缓冲或稀释, 这一对照可确保检测无干扰, 它的制备是将内毒素加到一部分检品中, 因此检品中有 2λ 浓度, 浓缩的内毒素溶液可用来制备产品对照 4. 最后, 每支试管加入 0.1ml 的鲎试剂, 如上所述将其混合并保温 结果判断使用凝胶法时, 每支试管的检测结果不是阳性就是阴性, 试管中形成坚实的凝胶, 当试管翻转 180 时凝胶仍保持完整的为阳性反应 无凝胶形成或形成一团粘性物质, 但试管翻转后不能保持完整的为阴性反应 当阳性水和样品对照在 2λ 内毒素浓度为阳性, 阴性对照无凝胶形成时, 检测结果才有效 期望值鲎试剂是根据美国标准内毒素 EC-5 来标定的, 因此灵敏度用 EU/ml 来表示, 标示值的复核是对照 EC-5 或标准的内毒素对照的一种鲎试验, 它们产生一等于或在标示灵敏度的两倍稀释范围内的终点 标示灵敏度 (λ) 为 0.12EU/ml 的鲎试剂的内毒素检测结果列于表 I, 制备 5 点内毒素稀释系列, 包括标示的灵敏度 表 I: 凝胶法检测结果 内毒素稀释 (EU/ml) 重复两管 终点

4 鲎试剂的灵敏度是通过确定终点的几何均值的重复四管检测的终点换算成常用对数, 将常用对数值平均, 则 LAL 灵敏度是该平均对数值的反对数 ( 见表 II) 表二 : 终点几何均值的计算 终点 (EU/ml) Log10 终点 均值 = 均值的反对数 =0.085 检测实验室初次质量控制程序在做任何正式检测前应评估检测实验室的变异性和分析实验人员, 每个实验人员使用单一批 LAL 和内毒素应圆满完成标示 LAL 灵敏度的复核检测, 可接受的范围为 0.5λ 至 2λ 之间 复核鲎试剂标示灵敏度的检测 : 将一批新的 LAL 介绍给检测实验室之前应复核其标示的灵敏度, 单一一批 LAL 内毒素 (CSE 或 RSE) 检测不少于 4 管重复检测, 终点的几何均值必须在标示范围内, 如上所述 确定未知样品中的内毒素浓度, 检测检品的两倍稀释系列直到达到一终点, 内毒素水平的计算用 LAL 标示灵敏度除以终点几何均值 表 Ⅲ: 样品中内毒素浓度的确定 LAL 灵敏度 =0.12 EU/ml 样品稀释 重复试管 1:2 1:4 1:8 1:16 1: 终点检品稀释 Log10 终点 1:16(0.0625) :8(0.125) 均值 = 均值的反对数 = 内毒素浓度 =LAL 灵敏度 终点均值 =0.12 EU/ml 0.088=1.36 EU/ml 产品抑制在日常鲎试验开始前, 应排除潜在的产品抑制, 抑制通常与浓度有关, 可简单地用 LAL 检查用水稀释来克服, 抑制的通常来源包括 :1) 酶介凝胶反应的干扰 ; 和 2) 内毒素对照的分散性的改变 如果两倍内毒素稀释系列的检测终点与一个相同的内毒素系列 ( 阳性水对照 ) 的终点相差大于一个 2 倍稀释, 则存在抑制 产品抑制可如下辨认出 : 标示的鲎试剂灵敏度 (λ) 终点阳性水对照终点阳性产品 A 对照终点阳性产品 B 对照 =0.12 EU/ml =0.12 EU/ml =0.20 EU/ml =0.50 EU/ml

5 产品 A 在规定范围内而产品 B 存在抑制 确定无抑制产品浓度的最简单方法是制备含 2λ 内毒素浓度的产品系列, 检测该系列以及用水稀释的产品系列, 下列结果表明产品以 1:20 或更高稀释倍数稀释无抑制且无内毒素. 样品稀释 1:4 1:10 1:20 1:40 产品和 2λ 内毒素 产品和 LAL 检查用水 酸性或碱性产品可能要求调节 ph 值至中性以及稀释来解决产品抑制 最大有效稀释 : 美国食品和药品管理局规定经静脉给药的药品的内毒素限值为 5EU/kg, 鞘内药品为 0.2EU/ml 但对于一些简单的药品也采用特殊限值例如放射性药品为 175EU/kg, 这些限值可以用来确定稀释的范围以克服干扰问题而不会超过限定的内毒素浓度, 最大有效稀释 (MVD) 是按照以前提到的文件和其它药典中提供的公式来计算的 对于有公布限值的药品,MVD 可按下列公式计算 : MVD= 内毒素限值 产品效价灵敏度 例如, 环磷酰胺的内毒素限值是 0.17EU/mg, 如果使用灵敏度为 0.125EU/ml 的鲎试剂来检测效价为 20 mg/ml 的产品,MVD 等于 1:27 MVD= 0.17 EU/mg 20 mg/ml = EU/ml 在这种情况下, 环磷酰胺最大稀释到 1:27 可解决可能出现的抑制 局限性除非检测条件有效, 药品和医疗器械才能用鲎试验方法作为其终产品检验的放行方法 如果检品必须以大于 MVD 的倍数稀释才能克服抑制, 则鲎试验不能作为终产品检测方法

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