42 玉米科学 21 卷 tion PCR,DDRT-PCR) 是在 PCR 技术基础上发展而来的, 是通过筛选差异表达基因片段进而获得新基因的一项技术研究表明, 通过该技术以水稻作为材料, 探讨水稻 F 1 代与亲本基因表达的差异, 并对分 [4] 离的水稻抗性基因进行了详细探讨舒庆艳等以羊草

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悦众湛
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1 玉米科学 2013,21(5):41~45 Journal of Maize Sciences 文章编号 : (2013) 玉米 mrna 差异显示与杂种优势关系的研究姜涛 1, 王丕武 2, 张君 2 (1. 吉林大学珠海学院化学与药学系, 广东珠海 ;2. 吉林农业大学农学院, 长春 ) 摘要 : 以玉米抽穗前期幼叶作为材料, 应用 mrna 差异显示技术 (DDRT-PCR) 分析亲本与杂交种之间杂种优势表现, 从基因差异表达方面来探讨玉米杂种优势的机理结果表明, 杂交种和亲本之间存在明显的基因差异表达, 差异表达模式可分为单亲表达一致型双亲共沉默型单亲表达沉默型和杂种特异表达类型 4 种对 12 个性状进行相关分析, 结果表明, 在 72 个相关系数中有 10 个相关显著对于 4 种不同差异表达模式和 12 个性状的中亲优势 (MPH) 进行相关分析, 在 72 个相关系数中仅有 2 个达到显著或极显著水平对于 4 种不同差异表达模式和 12 个性状的超亲优势 (BPH) 进行相关分析, 在 72 个相关系数中有 4 个达到显著或极显著水平关键词 : 玉米 ; 反转录 PCR 技术 ; 杂种优势中图分类号 :S 文献标识码 :A Relationship Between mrna Differential Gene Expression and Heterosis in Maize JIANG Tao 1, WANG Pi-wu 2, ZHANG Jun 2 (1. Chemical and Pharmacy Department, Jilin University Zhuhai Collage, Zhuhai ; 2. Faculty of Agriculture, Jilin Agricultural University, Changchun , China) Abstract: Take the spire of heading-stage of maize as material, utilizing mrna differential gene expression technique to analysis the performance of heterosis between seed-parent and hybrid. From differential gene expression to discuss the mechanism of heterosis in maize. The results showed that there was a significant differential gene expression between hybrids and seed-parents. Differential expression patterns could be divided into 4 types that including single-parent expression of the same type, co-parents silence type, single-parent expression silence type and hybrid specific expression type. Through the analysis of 12 traits of maize, the experimental results showed that there were 10 coefficients were significant correlation in 72 correlation coefficients. For 4 types of different expressed patterns and 12 types of traits to carry out correlation analysis of mid-parent heterosis(mph), there were 2 coefficients achieved significant or very significant level in 72 correlation coefficients. For 4 types of different expressed patterns and 12 types of traits to carry out correlation analysis of best-parent heterosis(bph), there were 4 coefficients achieved significant or very significant level in 72 correlation coefficients. Key words: Maize; Reverse transcription PCR; Heterosis 农作物杂种优势利用在生产上已经取得巨大效益迄今为止, 玉米是利用杂种优势最早且最成功的收稿日期 : 作者简介 : 姜涛 (1982-), 男, 辽宁海城人, 助教, 硕士, 现从事生物化学与分子生物学等方面研究 Tel: @qq.com 作物尽管上个世纪玉米品种在农业生产上获得大规模推广和应用, 但过去对于杂种优势遗传机理研究主要集中在遗传差异与杂种优势的关系上, 而对于分子机理的研究十分缺乏, 对阐明玉米杂种优势 [1~3] 机理并无多大推动力借助分子标记和差异显示技术研究基因表达和杂种优势的关系也不失为探讨杂种优势的一条有效途径 mrna 差异显示反转录 PCR 技术 (mrna differential display reverse transcrip-

2 42 玉米科学 21 卷 tion PCR,DDRT-PCR) 是在 PCR 技术基础上发展而来的, 是通过筛选差异表达基因片段进而获得新基因的一项技术研究表明, 通过该技术以水稻作为材料, 探讨水稻 F 1 代与亲本基因表达的差异, 并对分 [4] 离的水稻抗性基因进行了详细探讨舒庆艳等以羊草作为材料, 运用该技术对羊草差异表达的基因进行分离, 并对其特性进行了分析该技术在基因克隆基因功能研究抗性机理等方面均取得了一定成绩, 在玉米杂种优势方面则鲜有研究本研究通过 mrna 差异显示技术, 以抽穗前期玉米叶片为材料, 分析 6 个杂交种及其亲本之间的基因差异表达模式, 探讨玉米杂种优势产生的原因, 为最终解释杂种优势形成的遗传机理提供参考 1 材料与方法 1.1 实验材料以自交系黄早四丹 340 C Mo 吉 853 作为亲本, 杂交组合为 8902 黄早四 Mo17 黄早四黄早四 340 黄早四 C 黄早四黄早四吉 853 对上述自交系亲本及杂交组合按完全随机区组设计,3 个重复在一个重复中取抽穗前期植株心叶叶片进行差异显示分析 3' 锚定引物 : R1:5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'; R2:5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'; R3:5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3' 5' 寡聚核苷酸引物 : L1:5'-TGCCGAAGCTTTGGTAGC-3'; L2:5'-TGCCGAAGCTTTGGTCAC-3'; L3:5'-TGCCGAAGCTTGATTCCG-3'; L4:5'-TGCCGAAGCTTGGAGCTT-3'; L5:5'-TGCCGAAGCTTTGGTGAC-3'; L6:5'-TGCCGAAGCTTGATTGCC-3'; L7:5'-TGCCGAAGCTTTGGTGTC-3'; L8:5'-TGCCGAAGCTTCGACTGT-3', 以上引物均购自上海生物工程有限公司 1.2 玉米总 RNA 提取及检测取自交系及杂交系玉米抽穗期叶片 1 g 放入装有液氮的研钵中充分研磨, 将粉末放到装有 1 ml 的离心管中, 按照 TRIzol 总 RNA 提取试剂盒 (Invitrogen 公司 ) 的使用说明书提取玉米叶片总 RNA, 之后通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测提取总 RNA 的分子大小及片段完整性, 进一步使用紫外分光光度计在 260 nm 波长下测定 RNA 浓度, 最后利用 AMV-RT 反转录酶将提取的 RNA 反转录为 cdna 反转录体系为,1 滋 g 总 RNA, 补 DEPC 水至 9.5 滋 L, 后 70 变性 5 min, 立即在冰浴中放置 5 min, 然后稍离心, 依次加入下列各种成分 :5 AMV-RT buffer 4 滋 L,5 AMV-RT buffer 4 滋 L,RNasin Ribonuclease Inhibitor (40 u/ 滋 L)0.5 滋 L,primer 2.0 滋 L,AMV-RT 1 滋 L, 放入 42 孵育器中 1 h, 在 85 水浴放置 10 min, 所得样品即为反转录后的 cdna 1.3 PCR 扩增 PCR 总反应体系为 25 滋 L,10 PCR buffer 2.5 滋 L 2.5 mmol/l dntps 2.5 滋 L Mg 滋 L 3 ' anchor primer 0.5 滋 L 5' random primer 0.5 滋 L cdna 2.5 滋 L 补水至 25 滋 L PCR 反应程序为,94 预变性 5 min,94 变性 1 min,40 退火 4 min,72 延伸 1 min, 共进行 1 个循环 ;94 变性 45 s,60 退火 120 s,72 延伸 60 s, 共进行 40 个循环 ; 最后 72 后延伸 5 min,4 保存备用 1.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳方法参照文献 [5] 的方法进行, 加样前除了将电压调至 V 电流 30 ma 功率 40 W 预电泳 20~30 min 外, 样品还需 94 短暂变性 5 min 电泳结束后, 银染过程参照文献 [6] 的方法进行, 记录银染检测结果应用 quantity one 分析软件进行数据统计每个样品的扩增条带按有或无记录扩增条带存在时记录为 1, 否则记录为 0 2 结果与分析 2.1 总 RNA 的提取使用 TRIzol 总 RNA 提取试剂盒提取玉米的总 RNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测后 ( 图 1), 清晰看见 28S 和 18S 条带,RNA 片段完整性较好, 符合进一步实验的要求图 1 玉米总 RNA 的提取电泳结果 Fig.1 Electrophoresis results of extracted total RNA

3 5 期姜涛等 : 玉米 mrna 差异显示与杂种优势关系的研究 DDRT-PCR 电泳及银染结果使用 3 个锚定引物和 8 个随机引物组成的引物组合对获得的 cdna 进行 PCR 扩增, 从图 2 检测结果可见, 各亲本与杂交种间存在大量差异条带 ; 对 PCR 产物通过聚丙烯酰凝胶电泳和银染检测后, 其结果见图 3 注 :M 为 Marker;1~14 为样品 Note: Mwas Marker; 1-14 were the samples. 图 2 PCR 产物琼脂糖检测图 3 电泳后获得的差异条带 Fig.2 Agrose gel. electrophoresis of products of PCR Fig.3 Difference strip obtained from electrophoresis 2.3 杂交种和双亲间的基因差异表达分析从抽穗前期叶片中提取总 RNA, 用 24 对引物组合共扩增出条 cdna 片段, 其中条为差异条带, 差异条带比例为 65.71% 差异表达模式可分为 6 种 : 单亲表达一致一型, 即该条带仅在母本和杂种中出现, 在父本中不出现 (110 型 ); 单亲表达一致二型, 即该条带仅在父本和杂种中出现, 在母本中不出现 (011 型 ); 双亲共沉默类型, 即该条带在双亲中有, 而杂种中没有 (101 型 ); 单亲表达沉默一型, 即该条带仅出现在母本中, 而在父本和杂种中没有出现 (100 型 ); 单亲表达沉默二型, 即该条带仅出现在父本中, 而在母本和杂种中没有出现 (001 型 ); 杂种特异表达类型, 即该条带仅在杂种中出现, 而在双亲中不出现 (010 型 ) 6 个杂交组合基因差异表达分析发现, 同一差异类型在不同杂交组合中所占比例存在明显差异 ( 表 1) 表 1 玉米抽穗前期叶片中杂交种和亲本间基因差异表达类型比例 Table 1 The expression pattern and proportion of differential genes between hybrids and their parents in the leaves during the seeding stage % 组合 Combination 无差异条带数 No. of same bands 差异条带数 No. of differential bands 110 型 011 型 101 型 100 型 001 型 010 型总计 Total 8902 黄早四 MO17 黄早四黄早四丹黄早四 C 黄早四黄早四吉平均值基因差异表达和杂种性状的相关分析对 6 种不同差异表达模式和 12 个性状的杂种表现进行相关分析发现, 在 72 个相关系数中有 10 个相关显著 ( 表 2) 穗重和双亲共沉默型(101 型 ) 呈极显著负相关 ( 相关系数为 -0.88**); 穗重粒重和单亲表达沉默一型 (100 型 ) 呈显著负相关 ( 相关系数分别为 -0.82* -0.80*); 秃尖长茎粗和单亲表达沉默一型 (100 型 ) 呈极显著负相关 ( 相关系数分别为 -0.97** -0.91**); 穗长轴重粒重和双亲共沉默型 (101 型 ) 呈显著负相关 ( 相关系数为分别为 -0.80* -0.78* -0.86*); 百粒重和单亲表达一致一型 (110 型 ) 呈极显著负相关 ( 相关系数为 -0.90**); 穗位高和单亲表达沉默二型 (001 型 ) 呈显著负相关 ( 相关系数为 -0.76*)

4 44 玉米科学 21 卷 Table 2 表 2 玉米杂交种和亲本间不同差异表达模式与性状表现的相关关系 The correlativity of the expression pattern of differential genes between hybrids and their parents and traits 穗重 ** -0.82* 行数行粒数秃尖长 ** 穗长 * 径粗 ** 轴重 * 轴粗百粒重 -0.90** 株高穗位高 * 0.64 粒重 * -0.80* 基因差异表达模式和杂种优势的相关分析 Table 3 表 3 玉米杂交种和亲本间不同差异表达模式与中亲优势 (MPH) 的相关关系 The correlativity of the expression pattern of differential genes between hybrids and their parents and MPH 穗重行数行粒数秃尖长 0.96** 穗长径粗轴重轴粗 * 百粒重株高穗位高粒重 Table 4 表 4 玉米杂交种和亲本间不同差异表达模式与超亲优势 (BPH) 的相关关系 The correlativity of the expression pattern of differential genes between hybrids and their parents and BPH 穗重行数行粒数秃尖长 0.94** 穗长径粗轴重轴粗 -0.79* 0.88** 百粒重 * 株高穗位高粒重

5 5 期姜涛等 : 玉米 mrna 差异显示与杂种优势关系的研究 45 在玉米苗期, 对于 6 种不同差异表达模式和 12 个性状的中亲优势 (MPH) 进行相关分析 ( 表 3), 从表 3 可以看出, 在 72 个相关系数中仅有 2 个达到显著或极显著水平其中, 秃尖长中亲优势和单亲表达一致一型 (110 型 ) 呈极显著正相关 ( 相关系数为 0.96**), 轴粗和单亲表达沉默一型 (100 型 ) 呈显著负相关 ( 相关系数为 -0.77*) 对于 6 种不同差异表达模式和 12 个性状的超亲优势 (BPH) 进行相关分析 ( 表 4), 从表 4 可以看出, 在 72 个相关系数中有 4 个达到显著或极显著水平, 其中, 秃尖长超亲优势和单亲表达一致一型 (110 型 ) 呈极显著正相关 ( 相关系数为 0.94**), 轴粗超亲优势和单亲表达一致一型 (110 型 ) 呈显著负相关 ( 相关系数为 -0.79*), 轴粗超亲优势和单亲表达一致二型 (110 型 ) 呈极显著正相关 ( 相关系数为 0.88**), 百粒重和双亲共沉默型 (101 型 ) 呈显著负相关 ( 相关系数为 -0.76*) 3 结论与讨论 mrna 差异显示技术已经对大豆小麦水稻等多种农作物的亲本与杂交种间的杂种优势进行了研 [7] 究, 其优点不仅表现在效率高操作简便快速重现性好灵敏性高, 但是其缺点表现在所得的 cdna [8] 差异片段较短且假阳性高利用 mrna 差异显示技术对玉米亲本及杂交种进行分析, 为杂种优势形成的遗传机理奠定了一定基础造成杂交种和亲本之间基因差异表达的分子机制, 有可能是 DNA 甲基化所导致的基因沉默或激活 Xiong 对水稻杂交种及其双亲的 DNA 甲基化进行了研究, 结果表明, 两个亲本具有相同的甲基化 ( 均为 16.3%), 而在杂交种中甲基化比例为 18% 虽然总体上甲基化程度与杂种优势不相关, 但某些特异性位点上甲基化程度的改变却对杂种优势有显著效应有的位点上甲基化降低对杂种优势有利, 而有的位点甲基化增强对杂种优势有利这说明杂种优势产生过程中并不仅仅是一些基因表达增强是有利的, 而同时某些基因受到抑制也是有利的另外一种导致杂交种和亲本间基因差异表达的原因也可能性是组氨酸乙酰化和去乙酰化所导致基因表达与沉默, 研究证明, 组氨酸去乙酰化和 DNA 甲基化参与调控了异源四倍体芸苔 ( 拟南芥的近缘种 ) 的一个亲 [9] 本中的一套 rrna 基因的沉默参考文献 : [1] 刘国花. mrna 差异显示技术及其在植物基因工程中的应用 [J]. 重庆文理学院学报,2006,5(1): [2] 孙其信. 农作物杂种优势机理研究及展望 [J]. 作物杂志,1998(4): 31. [3] Tollenaar. Physiological basis of heterosis for grain yield in maize[m]. Crop Sci., [4] 陈昊, 赵森, 等. mrna 差异显示技术在分离水稻抗性基因中的应用 [J]. 安徽农业科学,2007,35(13): [5] 梁德勇, 王小民, 等. 银染 mrna 差异显示方法的条件优化 [J]. Chinese Journal of Neuroscience,1999,15(2): [6] 张义平, 陈学峰, 熊建华. 运用银染同 RNA 差异显示方法分析杂交水稻红莲优 6 号基因表达差异 [J]. 江西农业大学学报,2003, 25( 4): [7] Z Ni, Sun Q. Identification of a hybrid-specific expressed gene encoding novel RNA-binding protein in wheat seedling leaves using differential display of mrna[j]. Mol. Gen. Genet., 2000, 263: [8] 刘荣梅, 李凤兰, 等. mrna 差异显示技术研究进展 [J]. 黑龙江农业科学,2007(1): [9] 林洁. DNA 甲基化组蛋白去乙酰化与基因表达抑制 [J]. 临床及试验病理学杂志,2006(3): ( 责任编辑 : 朴红梅 ) 欢迎订阅大豆科学大豆科学是由黑龙江省农业科学院主管主办的大豆专业领域学术性期刊, 也是被国内外多家重要数据库和文摘收录源收录的重点核心期刊主要刊登有关大豆遗传育种品种资源生理生态耕作栽培植物保护营养肥料生物技术食品加工药用功能及工业用途等方面的学术论文科研报告研究简报国内外研究述评学术活动简讯和新品种介绍等大豆科学主要面向从事大豆科学研究的科技工作者大专院校师生各级农业技术推广部门的技术人员及科技种田的农民大豆科学为双月刊,16 开本, 每期 144 页国内外公开发行, 国内每期定价 :10.00 元, 全年元, 邮发代号 :14-95 国外每期定价 :10.00 美元 ( 含邮资 ), 全年 60 美元, 国外代号 :Q5587 全国各地邮局均可订阅, 也可向编辑部直接订购热忱欢迎广大科研及有关企事业单位刊登广告, 广告经营许可证号 : 地址 : 哈尔滨市南岗区学府路 368 号大豆科学编辑部邮编 : 电话 : 网址 : dadoukx@sina.com ddkexue@126.com

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吉林农业大学学报２０１６３８１８７９１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｈｔｔｐｘｕｅｂａｏｊｌａｕｅｄｕｃｎＥｍａｉｌｊｌｎｄｘｂｖｉｐｓｉｎａｃｏｍ神经生长因子ｍｒｎａ在鹅等级前卵泡中的表达刘璐璐隋玉健朱海洋武惠岩杨辉孙永峰吉林农业大学动物科学技术学院长春１３０１１８