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属瞿
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1 第 32 卷第 1 期 Vol.32, No 年 1 月 Jan 生殖与避孕 Reproduction & Contraception reproduction_journal@hotmail.com 1 例嵌合型 45,X/46,X,r(Y) 患者的遗传学分析邵敏杰高雪峰焦利萍杨丽萍黄瑾赵楠张小为魏彦玲李丹常亮张秋芳 ( 北京大学第三医院妇产科, 北京, ) 摘要目的: 应用细胞遗传学和分子生物学技术分析 1 例嵌合型 45,X/46,X,r(Y) 患者的核型方法 : 应用常规染色体标本制备方法进行 G- 显带和 C- 显带 ; 并应用 CEPX(DXZ1, Xp11.1-q11.1, Spectrum Green,Vysis) 探针 LSI SRY(Yp11.3, Spectrum Orange, Vysis) 探针和 CEP18(D18Z1,18p11.1- q11.1, Spectrum Aqua,Vysis) 与患者的中期分裂相进行荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH); 同时应用 PCR 技术对患者进行 Y 染色体微缺失检测结果 : 结合 G- 显带 C- 显带 FISH 检测结果和 Y 染色体微缺失的检测结果, 确定该患者核型为 46,X,r(Y)(p11.3q12)[85]/45,X[15] Yq11 区生精基因微缺失检测未显示该患者存在缺失结论 : 细胞遗传学检测结合 FISH 可以诊断复杂的染色体异常, 为患者提供正确的遗传咨询和生育指导关键词 : 环状 Y 染色体 ; 荧光原位杂交 (FISH); 微缺失 ; 植入前遗传学诊断 (PGD) 中图分类号 : R321.2 文献标识码 : A 文章编号 : X(2012) [1] 据世界卫生组织统计, 世界上约有 10% 的夫妇患有不育症, 男性不育约占 50%, 其中 30% 以上的患者是由遗传学异常引起的在染色体异常的不育男性患者中约 80%~90% 涉及性染色体的异常, 其中约 8% 为 Y 染色体的结构异常 Y 染色体结构异常包括倒位缺失等臂染色体环状染色体等, 可能由于结构异常的 Y 染色体容易丢失的缘故, 这种情况常见于 45,X 和含有异常 Y 染色体的嵌合型核型中具有这种嵌合型核型的患者可有各种表型 : 31% 患者为女性表型, 生殖器幼稚 ; 12% 为生殖器模 [2] 糊 ; 19% 为尿道下裂 ; 38% 为无精随着辅助生育技术的开展, 无精症和极度少弱精子症患者有了获得后代的机会但是结构异常的本研究为 08 北医三院院内骨干基金资助项目通讯作者 : 高雪峰 ; Tel: ; xuefenggao@yahoo.com.cn Y 染色体会通过辅助生育技术传递给男性子代, 使男性子代出现各种异常表型所以正确的染色体核型分析, 准确的遗传咨询和生育指导, 对确保患者生育正常的后代是非常必要的我们应用传统的细胞遗传学技术荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技术和 PCR 技术诊断了 1 例嵌合型环状 Y 染色体患者的核型, 为这位患者后续进行植入前遗传学诊断 (preimplantation genetic diagnosis, PGD) 奠定了基础 1 对象与方法 1.1 对象男, 25 岁, 由于婚后 2 年未避孕不育来我中心就诊体检 : 身高 158 cm, 体质量为 40 kg, 胡须喉结腋毛阴毛发育正常, 双侧睾丸大小约 15 ml, 质地可, 双侧附睾发育正常 2 次精液常规 -33-

2 检查 (WHO 标准 ): 精液量为 0.1 ml; 显微镜下偶见活精子, 头部严重畸形 ; ph 8.5; 精子密度为 /ml, 其中精子活动率分别为 a 级 : 0.00%; b 级 : 0.00%; c 级 : 33.33%; d 级 : 66.67% 血清激素检查: PRL 为 ng/l, FSH 为 3.54 IU/L, LH 为 3.10 IU/L, T 为 6 nmol/l, E2 为 44.8 pmol/l; 患者配偶的实验室检查未见异常 1.2 方法染色体检查按常规方法进行外周血淋巴细胞培养, 制备染色体, 经 G- 显带进行细胞遗传学分析, 同时考虑到可能存在微小结构异常, 留部分未显带染色体标本, -20 冰箱保存, 用于 C- 显带和荧光原位杂交 FISH 杂交 CEPX(DXZ1, Xp11.1-q11.1, Spectrum Green) 探针 LSI SRY(Yp11.3, Spectrum Orange) 探针和 CEP18(D18Z1,18p11.1-q11.1, Spectrum Aqua) 均购自 Vysis 公司混合 3 种探针, 按试剂盒操作说明分别与患者和正常男性中期分裂相进行杂交, 荧光显微镜下观察, 正常男性 FISH 结果应显示均匀清晰的 1 个绿色信号 1 个橘红色信号和 2 个蓝色信号 C- 显带按常规 C- 显带方法依次经 HCl Ba(OH)2 和 2 SSC 溶液消化洗脱, Giemsa 染色液染色 Y 染色体微缺失检测取患者外周血 2 ml, EDTA 抗凝, 酚 - 氯仿法提取 DNA Y 微缺失检测试剂盒购自上海透景生命科技有限公司, 选取 Yq11AZF 区 6 个 STS 位点 (SY84 SY86 SY127 SY134 SY254 SY255) 按试剂盒操作说明对病例 DNA 进行 PCR 扩增, 选取 SRY 作为内对照, 同时设正常男性对照和空白对照, 30 mg/ml 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果植入前遗传学诊断患者进行植入前遗传学诊断 (preimplantation genetic diagnosis, PGD) 筛选女胚 2 结果 2.1 GTG 染色体核型分析 2 次 GTG 染色体核型分析显示患者染色体核型均为 46,X,r(?Y)[85]/45,X[15]( 图 1) 2.2 CEPX 探针 SRY 探针和 CEP18 探针杂交结果 CEPX 探针 (Spectrum Green) SRY 探针 (Spectrum Orange) 和 CEP18 探针 (Spectrum Aqua) 混合后与患者中期分裂相杂交, 显示均匀清晰的 1 个绿色信号 1 个橘红色信号和 2 个蓝色信号, 橘红色和绿色信号分别位于 2 条染色体上, 证实环状染色体为 Y 染色体, 且 SRY 基因定位于环状 Y 染色体上 ( 图 2) 2.3 C- 显带结果 C- 显带显示具有环状染色体的核型, 环状染色体存在结构异染色质深染区, 证实环状 Y 染色体 q12 区存在图 1 患者染色体核型图 Figure 1 The patient s chromosome karyotype 图 2 CEPX SRY 和 CEP18 探针与患者中期分裂相杂交, CEP18 为 2 个蓝色杂交信号, SRY 为 1 个橘红色杂交信号, CEPX 为 1 个绿色杂交信号 Figure 2 Fluorescence in situ hybridization (FISH)(CEPX, SRY, CEP18) to detect the patient s chromosome, CEP18 showed two aqua signals, SRY was an orange signal, CEPX was a green signal -34-

3 2.4 Y 染色体微缺失检测结果正常男性和患者的 SRY 及 6 个 STS 位点均有扩增, 空白对照无扩增, 说明患者 SRY 基因及所检测的生精基因均存在通过以上实验我们确定该患者的染色体核型为 : 46,X,r(Y)(p11.3q12)[85]/45,X[15] 3 讨论 Y 染色体结构异常有多种形式, 包括缺失等臂染色体环状染色体和各种形式的嵌合等而嵌合型 45,X/46,X,r(Y) 类型的核型较少见, 且环的结构形态通常不确定, 从 GTG 水平无法判定环状染色体的来源, 因此确定环状染色体的来源及基因定位, 给患者正确的遗传咨询, 指导患者生育, 具有重要的临床意义常染色体和性染色体均可发生环状染色体环状染色体有 2 种形成机制 : 一种机制是一条染色体的长臂和短臂均发生一次断裂, 含有着丝粒节段 [3] 的 2 个端口彼此重新连接, 形成环状染色体 ; 另一种机制是染色体的两侧端粒端融合形成环状染色 [4] 体, 融合的端粒区域有部分 DNA 片段的丢失形成的环状染色体在继后的有丝分裂中可以分为 2 个环状染色体, 分别进入子细胞环在减数分裂时也可正常分离为 2 个大小相同的环但如果发生 1 次或 2 次交换, 则将分别形成一个比原先大一倍的环或 2 个互锁的环, 他们在子细胞分开时被拉断, 使染色体不均匀地分到 2 个子细胞中, 形成部分单 [5] 体或部分三体由于染色体结构异常, 导致环状性染色体通常不稳定, 减数分裂时容易丢失, 因此具有环状 Y 染色体的患者核型通常为 45,X/46,X,r(Y) 患者的临床表型也非常广泛, 从男性表型到女性表型均有, 临床表现与嵌合核型的比例及形成环 Y 时丢失片 [6] 段大小相关本例患者外周血淋巴细胞分析显示大部分核型为具有环状染色体的 46,X,r(Y) (85%), 小部分为 45,X(15%), 没有正常的 46,XY 核型小比例的 45,X 核型可能为细胞分裂过程中环状染色体丢失所致患者的临床特征比较典型, 身材矮小, 皮肤痣较多, 这一点与 Turner 综合征的特征相符, 其原因为 45,X 核型所致患者的第二性征及睾丸发育基本正常, 这与其大部分核型为含有环 Y 的核型, 且 Y 染色体的 SRY 基因 AZF 生精基因 [7] 及 Yq12 区均存在有关但是精液量少, 精子浓度极低, 且均为 c 级和 d 级精子, 其少弱精的原因则与染色体核型异常有关 [8] 早先有文献报道, 环状 Y 染色体减数分裂, 在终变期为不配对的形态, 且减数分裂 I 期和 II 期成熟阻滞但是 Blanco 等对嵌合型环 Y 患者精子进行 [2] FISH 后观察到, 45,X 核型的细胞无法完成减数分裂, 因其性染色体无法配对, 而环状性染色体则可以进入减数分裂, 完成精子生成过程, 所以患者表现为少弱精子症由于环 Y 容易丢失, 所以在生成的精子中, 含有 X 染色体的精子比例明显高于含有 Y 染色体的精子减数分裂前期细胞非整倍体比率高于减数分裂后精子细胞, 其原因可能为 Y 染色体结构异常, 如果拟常染色质 1 和 2 区丢失, 则造成 X 和环状 Y 染色体配对错误, 如果拟常染色质区存在而结构重排, 则造成 X 和环 Y 之间的配对困难 ; 且由于细胞的凋亡作用, 在精子形成过程中清除了异常的细 [9] 胞, 所以减数分裂后精子非整倍体比率反而下降本例患者如果能够配合再次留取精液进行精子荧光原位杂交分析其精子非整倍体情况, 进一步分析染色体异常对精子生成的影响, 确定其少弱精的原因, 则更有说服力, 遗憾的是患者不愿配合而未能再次获得精液标本本例患者 46,X,r(Y) 的核型所占比例大, 因此大部分细胞可以完成减数分裂, 但由于环状染色体可能存在部分基因的丢失, 因此该遗传缺陷会遗传给后代患者虽然精液量少精子密度低质量差, 但生育愿望强烈, G- 显带分析核型为嵌合型环状染色体后, 为了确定环状染色体的来源, 我们进一步做了 C- 显带和 FISH 分析, 确定环为 Y 染色体, 且环 Y 的 SRY 基因 q11 区生精基因 (AZF) 及结构异染色质 (q12) 均存在, 所以患者核型为 46,X,r(Y)(p11.3q12) [85]/45,X[15] 因 Y 染色体结构异常, 建议该患者行 PGD 选择女胚植入但是在细胞联会配对时, X 和 Y 染色体配对发生交换, 考虑到 SRY 基因可能会易位到 X 染色体上, 那么选择女胚会有生育性反转胎儿的风险所以我们选取 X 染色体着丝粒探针和 Y 染色体 SRY 探针进行杂交, X 和 SRY 的荧光信号不在同一条染色体上, 说明该患者的 SRY 基因没有易位到 X 染色体上, 可以选择女胚植入经过临床 -35-

4 检测和遗传咨询, 该夫妻进行了 2 次 PGD, 遗憾的是第 1 次获卵 16 枚, 受精 5 枚, 因形成胚胎数目少, 未进行 PGD, 放弃移植 ; 第 2 次取卵 11 枚, 受精 8 个, 活检 7 个胚胎 (5 个新鲜胚胎, 2 个解冻胚胎 ), 只有 1 个胚胎 FISH 结果为 XX, 其余胚胎信号异常, 移植后仍未孕 ; 第 3 次获卵 22 枚, 受精 14 枚, 活检 13 枚, 2 枚 FISH 信号为 XX, 移植后仍未孕从胚胎活检和受精情况分析, 患者的精子头部严重畸形, 受精后大部分胚胎 FISH 信号异常, 其原因可能与精子染色体异常相关, 因为我们仅选取 18 和 X 探针进行杂交, 其他的染色体异常无法判断男性的 Y 染色体决定男性性别分化男性性征的维持和男性生育 ; 决定男性性别分化的 SRY 基因位于 Y 染色体短臂, Yq12 区即 Y 长臂远侧 2/3 为结构异染色质区 ; Yq11 区存在与生精相关的基因, 称为无精症因子 (AZF) [10] AZF 进一步划分为 AZFa AZFb AZFc 这 3 个区域, AZFa 基因缺失的患者主要表现为唯支持细胞综合征, 无精子生成 ; AZFb 基因的缺失主要表现为精子成熟障碍 ; AZFc 基因的缺失 [11] 则表现多样, 从无精子到少精子甚至正常精子数我们选取 AZFa AZFb AZFc 这 3 个区域的 6 个 STS 位点对该患者进行了 Y 染色体微缺失的检测, 这 6 个位点的缺失频率超过 AZF 区域所有缺失的 95%, 可检测出临床上大部分 Y 染色体微缺失患者通过检测未见该患者生精基因缺失, C- 显带证实患者 Yq12 区存在, 且患者 SRY 基因也存在, 因此认为患者的环状 Y 染色体可能为长臂和短臂末端断裂后黏性末端连接形成环状, Y 染色体的大部分结构存在, 所以该患者性腺发育尚可精子数量少, 活力差的原因为 Y 染色体的结构异常所致, 而不是 Y 染色体微缺失造成综上所述, 嵌合型环状 Y 染色体核型临床比较少见, 这类患者临床症状也表现不一辅助生育技术的发展帮助这些患者有了获得后代的机会, 但同时也将异常的 Y 染色体传递给了后代所以准确的细胞遗传学和分子遗传学检测及正确的遗传咨询可以帮助这些患者避免异常染色体的世代传递, 从而达到优生的目的参考文献 : [1] Pandiyan N, Jequier AM. Mitotic chromosomal anomalies among infertile men. Hum Reprod, 1996, 11(12): [2] Blanco J, Farreras A, Egozcue J, et al. Meiotic behavior of the sex chromosomes in a 45,X/46,X,r(Y)/46,X, dic r(y) patient whose semen was assessed by fluorescent in situ hybridization. Fertil Steril, 2003, 79(4): [3] Melzer PS, Guan XY, Trent JM. Telomere capture stabilizes chromosome breakage. Nat Genet, 1993, 4(3): [4] Pezzolo A, Perroni L, Gimelli G, et al. Identification of ring Y chromosome: cytogenetic analysis, Southern blot and fluorescent in situ hybridization. Ann Genet, 1993, 36(2): [5] Tsai LP, Lee KF, Fang JS, et al. Molecular cytogenetic analysis and clinical manifestations of a case with de novo mosaic ring chromosome 7. Mol Cytogenet, 2011, 4(1):5. [6] Ravel C, Siffroi JP. Y chromosome structural abnormalities and Turner s syndrom. Gynecol Obstet Fertil, 2009, 37 (6): [7] Premi S, Srivastava J, Panneer G, et al. Startling mosaicism of the Y-chromosome and tandem duplication of the SRY and DAZ genes in patients with Turner syndrome. PLoS One. 2008, 3(11):e3796. [8] Chandley AC, Edmond P. Meiotic studies on a subfertile patient with a ring Y chromosome. Cytogenetics, 1971, 10 (4): [9] Lin WW, Lamb DJ, Wheeler TM, et al. In situ end-labeling of human testicular tissue demonstrated increased apoptosis in conditions of abnormal spermatogenesis. Fertil Steril, 1997, 68(6): [10] Tiepolo L, Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluoescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet, 1976, 34(2): [11] Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S, et al. Human Y chromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet, 1996, 5(7): (2011 年 7 月 2 日收稿 ) -36-

5 Genetic Analysis of One Patient with Mosaic 45,X/46,Xr(Y) Min-jie SHAO, Xue-feng GAO, Li-ping JIAO, Li-ping YANG, Jin HUANG, Nan ZHAO, Xiao-wei ZHANG, Yan-ling WEI, Dan LI, Liang CHANG, Qiu-fang ZHANG ( Department of Obstetrics & Gynecology, The Third Hospital of Peking University, Beijing, ) ABSTRACT Objective: To analyze the karyotype of one patient with mosaic 45,X/46Y,r(Y) by using cytogenetic and molecular biology techniques. Methods: The patient s karyotype was determined by G-banding, C- banding and fluorescence in situ hybridization (FISH)(CEPX, LSI SRY, CEP18). Y chromosome microdeletion was detected by PCR technique. Results: The patient s karyotype was confirmed as 46,X,r(Y)(p11.3q12)[85]/45,X[15]. No deletion was detected in the Yq11 zone. Conclusion: Some complex chromosomal abnormalities can be diagnosed by using both cytogenetics and FISH, which can provide accurate genetic and reproductive counseling to the patient. Key words: ring Y chromosome; fluorescence in situ hybridization (FISH); microdeletion; preimplantation genetic diagnosis (PGD) $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ ( 正文见第 10 页 refer to p10) Effect of Adhesion Molecule E-cadherin on the Invasiveness of Human Trophoblast Cells and Outcome of Pregnancy Hong-bo ZHAO, Li-rong XUE, Da-jin LI (Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, Shanghai, ) ABSTRACT Objective: To investigate the regulation of adhesion molecule E-cadherin expression on the invasiveness of human trophoblast cells and its relationship to the occurrence of natural abortion. Methods: The endogenous E-cadherin expression was increased or decreased in human choriocarcinoma cell line JEG-3 and Bewo by wild type E-cadherin plasmid transfection or small interference RNA (sirna) transfection, and then the invasiveness of human trophoblast cells was detected using Transwell assay. Western blotting was then used to compare the difference in E-cadherin expression between villi obtained from 4 normal pregnancy women and that from 4 natural abortion women. Results: The invasiveness of Bewo and JEG-3 cells transfected with wild type E-cadherin plasmid significantly decreased(p<0.05) accompanied with the increase of endogenous E- cadherin expression. The invasiveness of Bewo and JEG-3 cells transfected with E-cadherin small interfering RNA significantly increased (P<0.05) accompanied with the decrease of endogenous E-cadherin expression. E- cadherin expression in villi obtained from natural abortion women was higher than that from normal pregnancy women. Conclusion: E-cadherin plays a key role in the regulation of invasiveness of human trophoblast cells, and its expression level may correlate with the outcome of pregnancy. Key words: trophoblast cells; E-cadherin; cell invasion -37-

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Microsoft Word _new_.doc HEREDITAS (Beijing) 2011 8, 33(8): 895 900 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告 DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00895 QF-PCR 在染色体异常男性不育症诊断中的应用齐漫龙, 张媛媛, 刘晓亮, 何蓉, 赵彦艳, 110004 为评估定量荧光 PCR (QF-PCR) 方法在男性不育遗传学诊断中的应用价值,