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栽傅
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1 动物学研究 2011, Oct. 32(5): CN /Q ISSN Zoological Research DOI: /SP.J 花鲈微卫星标记分离及其多态性分析 * 赵燕, 季相山, 曾勇庆, 丁雷, 杨萍萍, 王慧 ( 山东农业大学动物科技学院, 山东泰安 ) 摘要 : 该文利用 FIASCO 法 (fast isolation by AFLP of sequences containing repeats) 和 GenBank 数据库搜索法开发花鲈微卫星标记, 并对筛选的标记进行多态性检测两种方法共获得条能够设计引物的序列, 扩增结果显示 15 对引物具有多态性, 多态性微卫星位点的等位基因数为 2~10 个 15 个多态性位点中, 4 个位点偏离了 Hardy-Weinberg 平衡 ; 各位点间没有连锁不平衡现象 ; 仅位点 SP52 可能存在无效等位基因 ; 除 SP17 和 SP468 外, 其余引物的 PIC 值均在 0.5 以上, 可用于花鲈群体遗传分析等研究关键词 : FIASCO 法 ; 数据库查询法 ; 花鲈 ; 微卫星中图分类号 : Q95-33; Q 文献标志码 : A 文章编号 : (2011) Isolation of microsatellite markers for Lateolabrax japonicus and polymorphic analysis ZHAO Yan, JI Xiang-Shan, ZENG Yong-Qing, DING Lei, YANG Ping-Ping, WANG Hui * (College of Animal Science and Technology, Shandong Agriculture University, Taian , China) Abstract: To investigate population structure and marker assisted breeding, fast isolation by AFLP of sequences containing repeats (FIASCO) and GenBank database mining were used to develop novel microsatellite markers for sea perch (Lateolabrax japonicus). Genomic DNA fragments containing SSR sequences were captured by hybridization to (GT) 13 biotin-labeled probe and were ligated to PMD18-T vector. Among 150 randomly chosen clones from the SSR-enriched library, 66 sequences contained microsatellite motif over five repeats. In addition, 0 cdna sequences and 132 ESTs of Lateolabrax japonicus were downloaded from GenBank and screened for di-, tri- and tetra-nucleotide repeats, while 22 sequences were found to contain microsatellites. As a result, 15 microsatellite loci were shown to be polymorphic in 30 Lateolabrax japonicus individuals, with the alleles ranging from two to ten, the observed heterozygosities from , and the expected heterozygosities from Four loci (SP17, SP52, SP94 and SP468) were deviated from HWE in the sampled population after Bonferroni s correction, and no linkage disequilibrium was found among all loci (P<0.003), whereas null alleles were detected at locus SP52 (P<0.05). Among 15 polymorphic loci, the PIC values, which can be used for related population genetics analysis, were all above 0.5, with the exception of SP17 and SP468. Key words: FIASCO; Database mining; Lateolabrax japonicus; Microsatellite 微卫星具有多态性丰富易于快速检测等特点, 在种质资源保存利用遗传结构和遗传变异及遗传连锁图谱构建等方面的研究中发挥着非常重要的作用, 已经发展成为当前主流的分子标记之一 (Wang et al, 2009) FIASCO 法 (fast isolation by AFLP of sequences containing repeats) 是基于 AFLP 技术的一种非常有效的分离微卫星位点的方法 (Zane et al, 2002) 它将 AFLP 与杂交选择相结合, 能够简单快速提高阳性率, 发展前景较大, 已经在黄鳝 (Monopterus albus) (Li et al, 2007) 鳜鱼(Siniperca chuatsi) (Kuang et al, 2009) 等多种鱼类微卫星的开发上使用数据库搜索法是从公用的 DNA 序列数据收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家 863 计划项目 (2008AA101010); 国家发改委生物育种高技术专项 ( ); 山东省农业良种工程重大项目 (2007LZ013); 博士后创新基金项目 ( ) 通讯作者 (Corresponding author), 王慧 ( ), 女, 教授, 博导,Tel: ; wanghui2328@sdau.edu.cn

2 516 动物学研究 32 卷库 (GenBank EMBL 和 DDBJ 等 ) 中查找所研究物种的序列信息, 并用于开发微卫星标记的一种简单经济有效的方法 (Brown et al, 1996) 当前已开发的花鲈微卫星标记较少, 仅 Jiang et al (2007, 2008) 发表了 22 个微卫星标记, 其中有 13 个微卫星标记为混合微卫星, 不适于种群遗传学研究, 远远满足不了花鲈遗传育种等研究的需要在微卫星开发的几种方法中, 从基因组文库中筛选, 耗时费力, 效率较低 ; 从近缘中扩增, 成功率较低本研究选择目前应用较广泛的 FIASCO 法构建花鲈部分基因组文库及参照 GenBank 上花鲈的相关序列设计微卫星引物两种方法, 对花鲈微卫星位点的多态性进行研究, 这可为花鲈群体遗传结构的分析遗传资源的保护利用和分子标记辅助育种等打下基础 1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用花鲈活体样本捕自山东烟台近海, 共 30 个个体, 取其尾鳍置于 75% 酒精中, 保存于 20 冰箱中备用 1.2 微卫星富集文库的构建与序列测定用蛋白酶 K 消化和酚 / 氯仿抽提法从花鲈的鳍条中分离纯化基因组 DNA (Sambrook & Russell, 2002) 基因组 DNA 用限制性内切酶 MseⅠ 酶切后回收 250~1000 bp 的片段, 回收产物与接头 oligo-mse ⅠA (HO 5'-TACTCAGGACTCAT-3' OH) 和 oligo-mse ⅠB (HO 3'-GAGTCCTGAGTAGCAG-5' OH) 连接建立 17.5 μl 连接体系 ( 接头 20 μmol/l, 2.5 μl; T4 DNA ligase 6 U, 10 buffer 1.75 μl, 纯化的酶切产物 10 μl), 置 16 水浴中过夜连接利用预扩引物 MseⅠ- N(5'-ATGAGTCCTGAGTAAN-3') 对连接了接头的 DNA 片段进行 PCR 扩增, 程序为 94 预变性 5 min, 94 变性 30 s, 53 退火 30 s, 72 延伸 1 min, 共进行 30 个循环, 最后 72 延伸 10 min 回收 250~1 000 bp 的预扩增片段用于杂交分析杂交体系包含生物素标记的 (GT) 13 的探针 6.0 μl(40 μmol/l), 杂交液 (6 SSC + 0.1% SDS)70 μl, 预扩增回收产物 20 μl 磁珠经 250 μl 的 TEN 100 (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, 100 mmol/l NaCl, ph 7.5) 洗涤 3 次, 每次 5 min 后, 将杂交产物和 300 μl TEN 100 加入到预处理过的磁珠中, 室温反应 30 min 分别用 400 μl TEN 1000 (0.2 SSC + 0.1% SDS) 和洗脱液 (0.2 SSC + 0.1% SDS) 各洗涤磁珠 3 次, 每次 5 min, 其间不时用移液器轻轻吹打, 重悬磁珠最后用 400 μl 1 SSC 洗涤磁珠 5 min 加 50 μl TE, 95 水浴中变性 5 min, 洗脱含有微卫星序列的单链 DNA 以洗脱的含有微卫星的单链 DNA 为模板再次用引物 MseI-N 进行扩增, 扩增程序同上, 回收 250~ 1000 bp 的片段将回收的目的片段连接到 pmd18-t 载体中并转化至大肠杆菌 DH5α 中, 涂平板后挑取单克隆, 用引物 MseI-N 进行 PCR 检测, 挑选阳性克隆送上海生物工程技术服务有限责任公司测序利用 DNAMAN Version 4.0 和 GenBank 中的 Blastn 软件对测得序列进行比对, 去掉冗余序列 1.3 GenBank 数据库搜索输入 Laterolabrax japonicus 作为搜索关键词, 在 NCBI 公共数据库 (http: // 搜索核苷酸序列, 下载所有相关序列以 FSATA 格式保存备用 1.4 序列分析及微卫星引物设计利用 SSRHUNTER 1.3( dna/ssrhunter.html) 软件, 对以上两种方法得到的序列进行分析, 含二碱基三碱基四碱基重复 5 次以上的为含微卫星的序列根据微卫星的侧翼序列, 利用软件 Premier 5.0 设计引物, 并交由上海生物工程技术服务有限责任公司合成 1.5 微卫星标记的多态性检测利用合成的引物分别在 30 个花鲈个体中进行 PCR 扩增用于分析其多态性 PCR 反应总体积为 20μL, 内含 20 ng 的模板 DNA, 0.2 μmol/l 的引物, 200 μmol/l 的 dntps, 1.5 mmol/l 的 Mg 2 +, 1 X PCR 反应缓冲液, 1 U 的 Taq DNA 聚合酶 PCR 反应为 30 个循环, 每个循环包括 : 94 变性 30 s, 退火 30 s, 72 延伸 1 min; 首次循环前预变性 5 min; 最后一次循环结束后 72 再延伸 10 min PCR 扩增产物经 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸银染色后数码相机拍照保存 1.6 数据分析微卫星标记呈共显性, 可直接根据每个个体产生的条带的位置确定基因型, 利用 Popgene32 处理数据, 计算多态性位点的等位基因数目观测杂合

3 5 期赵燕等 : 花鲈微卫星标记分离及其多态性分析内容 517 度 (H O ) 期望杂合度(H E ), 并按下列公式计算多态性信息含量 (PIC): n n 1 n i j i i= 1 i= 1 j= i+ 1 PIC = 1 P 2P P 其中,P i 和 P j 分别为第 i 和第 j 个等位基因的频率, n 为等位基因个数利用 MICRO-CHECKER Version 软件估计位点的无效等位基因频率所有多重比较均经 Bonferroni 校正 2 结果 2.1 FIASCO 法筛选的微卫星标记从构建的文库中随机挑取 150 个克隆, 利用预扩引物进行 PCR 鉴定, 共得到阳性克隆 94 个, 阳性率为 62.7%; 对阳性克隆测序得到 66 个含微卫星序列的克隆, 阳性序列比例为 70.2% 66 条微卫星序列中共含微卫星座位 108 个, 其中 CA/GT 重复序列 97 个, 占 89.8%, GA/CT 重复 4 个, 占 3.7%, 其他重复序列 7 个, 占 6.5% 在这些含微卫星重复的序列中, 微卫星重复数在 10 次以上的, 占 70.3% 在这些位点的重复序列中, 共 3 个复合型 (sp52 sp416 sp468), 其他为完美型利用 DNAMAN 4.0 和 GenBank 中的 Blastn 软件对这 66 条微卫星序列进行比对, 去掉冗余序列后全部提交 GenBank, 并利用 Premier 5.0 软件共设计引物 42 对, 部分微卫星序列及引物信息见表 GenBank 数据库搜索结果截至 2010 年 2 月, 在 GenBank 数据库中共搜索到 0 条花鲈核苷酸序列及 132 条 EST 序列, 经 SSRHUNTER 1.3 软件分析, 含微卫星的序列为 22 条, 其中 8 条为基因的全长 cdna 序列 ; 1 条为基因的部分 cdna 序列 ; 13 条为 EST 序列在 22 条微卫星序列中含微卫星座位 29 个, 其中 CA/GT 重表 1 FIASCO 法获得的部分花鲈微卫星序列 Tab. 1 Microsatellite sequences obtained by FIASCO 位点登陆号核心序列引物序列退火温度 Locus GenBank accession No. Repeat motif Primer (5-3 ) Tm ( C) SP17 GQ (CA) 6 SP40 GQ (TG) 19 SP48 GQ (AC) 30 SP52 GQ (CT) 11 (CA) 14 SP68 GQ (AC) 17 SP92 GQ (GT) 7 SP94 GQ (TG) 20 SP416 GQ (AC) 15 C(CA) 5 F: CCATCTGCACCACGCTAC R: CCCAAGGTCACAGGCTACA F: TGCCTCTGTGGTCTTCC R: CACAACGGCATTCAGC F: CCCCACCACCACCACTA R: TCGGCT GAACAACCAGAG F: TCAACCATCACTCGCTCCC R: CTCTTGTATGAACTCTGGCAATC F: GGCATAATGTCAGCTACAC R: TTGTAAGGACGTGATGG F: GCAGCTTTGGTTTAGTTTAG R: GCCCGTTGAAGGTGTCT F: GGGCAGAGGTAAAGGAGG R: GGCTCGGCTCCAGTATGA F: CGATGTTAGCCATTGTCC R: GTTGGGAACAATGGACTTT SP468 GQ (TG) 27 C(GT) 38 N 31 (GT) 65 T(TG) 5 F: CTGTGGGAGGATTGGG R: CACGCAACAGATATGAGTGT SP493 GQ (TCA) 5 F: TGGTGGCACTGCTGTCTT R: GACCCATACAAGGATGATAGTG

4 518 动物学研究 32 卷复序列 14 个, 占 48.3%, GA/CT 重复 10 个, 占 34.5%, 三碱基重复序列 5 个, 占 17.2% 在这些含微卫星重复的序列中, 微卫星重复数在 10 次以上的仅 6 个, 重复数在 5~7 次间的为 22 个 (75.8%) 在 8 条基因的全长 cdna 序列中, 微卫星座位多数位于内含子 3 -UTR 5 -UTR 等区域, 仅有 1 个位于外显子区域 ( 表 2) 2.3 微卫星标记多态性分析两种方法筛选的微卫星序列共设计引物对, 利用 8 尾花鲈的 DNA 对各引物扩增情况作初步筛选, 发现 32 对能扩增出与期望 PCR 产物大小相等或相近的片段, 其中 15 对引物的扩增片段有稳定的多态性 ( 表 3), 其余的都为单态应用这 15 对引物对 30 个个体进行了 PCR 扩增, 扩增条带清晰稳定, 其中微卫星引物 SPd10 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱见图 1 在野生花鲈 30 个个体中, 15 个花鲈多态性微卫星位点共检测到 89 个等位基因, 平均每个位点 5.9 个等位基因, 表现出高度多态性, 各等位基因大小在 141~349 之间 ( 表 3) Popgene32 分析结果显示, 15 个多态性微卫星位点的观测杂合度在 ~ 序的微卫星序列中, CA/GT 重复序列 97 个, 占之间, 期望杂合度在 ~ 之间经 Bonferroni 校正后 (P < 0.003), 各位点间没有连锁不平衡现象, 4 个微卫星位点 (SP17 SP52 SP94 和 SP468) 偏离了 Hardy-Weinberg 平衡 MICRO- CHECKER 软件分析表明仅位点 SP52 可能存在无效等位基因同时, 对 15 对微卫星引物的多 Tab. 2 表 2 GenBank 数据库查询得到的部分微卫星序列 Microsatellite sequences obtained by bioinformatic screening in GenBank 位点登陆号基因区域核心序列引物序列退火温度 Locus GenBank No. Gene Targetregion Repeat motif Primer (5-3 ) Tm ( C) SPd1 AY Myostatin 内含子 (TC) 11 (CT) 6 (CT) 7 F: GCACGGTTTGTAAGGTTT R: GCCCGGACTATGCGACT SPd CC chemokine 3'-UTR (GT) 10 F: ACCTCCCTGTCAGGCATC R: GTTTATCCCCAAAGTGGTTT 56.5 SPd Ljp Member RAS oncogene family 未知 (AG) 7 F: ACTTTCTCCCGCAACATG R: TACCTGTGGAGCAGCGAC SPd 未知未知 (TTA) 10 SPd10 FJ PPAR 3'-UTR (TCA) 14 SPd11 AY VAMP2 5'-UTR (AG) 13 SPd14 AY Hepc2 3'-UTR (CAA) 6 SPd15 AY8951 Prion 外显子 (AGC) 7 SPd16 AY Hepc2 3'-UTR (GT) 5 F: GTTAGGTGACGGGAAGATGT R: CAAAAGGCATGTGGATGTG F: TTACACCAGTGGCATAGTTG R: GAGCCAGCCCAGTTTGT F: CGAACGGAAGAGGAGGCAT R: CTTCGCTCGGTTCACGGT F: AATGAGCAACGACAATCCAG R: CATTACCTACAGCGTGACCAG F: TGCCACGATGGGGAGATTA R: GAGCTTGTTGGTTTTGATTGTG F: AGCCTCTTTATAGACAGGTTTC R: GTTGTTGGTGTTTACTATCCCT SPd18 DQ Nuclear S7 Ribosomal Protein 内含子 (GT) 8 未设计 SPd19 GU Phosphoenolpyruvate carboxykinase 5'-UTR (CT) 6 F: ACTTCCTCGTCTTTCCTTT R: GCTGGCACAGACTCACAT 50 SPd22 AB Internal transcribed spacer 1 未知 (AC) 5 未设计

5 5 期赵燕等 : 花鲈微卫星标记分离及其多态性分析内容 519 Fig. 1 图 1 微卫星标记 SPd10 在花鲈 30 个个体中的扩增图谱 Amplification results of microsatellite locus SPd10 in 30 Lateolabrax japonicus individuals 位点 Locus Tab. 3 样本数 n 表 3 15 个多态性花鲈微卫星标记分析结果 Characteristics of 15 polymorphic microsatellite markers in Lateolabrax japonicus 等位基因数 No.of alletes 等位基因范围 Allele size range 观测杂合度 (H O ) 期望杂合度 (H E ) 多态信息含量 (PIC) SP17* ~ SP ~ SP ~ SP52* ~ SP ~ SP ~ SP94* ~ SP ~ SP468* ~ SP ~ SPd ~ SPd ~ SPd ~ SPd ~ SPd ~ * 示显著偏离 Hardy-Weinberg 平衡 (P<0.003) *Show significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.003). 态性信息含量 (PIC) 进行了评估, SP17 位点提供的信息含量为 ; SP468 为 , 其余引物的 PIC 值均在 0.5 以上, 可用于花鲈群体遗传分析等研究 3 讨论目前开发微卫星标记的方法很多, 概括起来有 3 种 : (1) 从基因组文库中筛选微卫星 ; (2) 从数据库或有关文章中查询 ; (3) 从近缘物种中筛选微卫星 (Zhan et al, 2008) 本文研究发现, 数据库搜索法得到的花鲈微卫星位点的多态率为 41.7%, 多态性较高其他的研究也得到类似的结果, 如 Ji et al(2009) 搜索 GenBank 数据库中的牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 全 cdna 序列, 得到 15 个具有高多态性的微卫星位点, 多态率为 46.8%; Furukawa et al (2004) 用同样的方法搜索到 11 个具有多态性的河豚微卫星位点, 多态率为 73% 从数据库中查找微卫星位点, 虽然省时省力, 但受限于数据库中提交序列的数量, 多数物种因提交的序列较少只能开发出有限的多态性微卫星标记 FIASCO 法是 Zane et al (2002) 年提出的一种高效的筛选微卫星标记的方法此法一经提出, 便被迅速广泛地应用于许多物种的微卫星位点的筛选 (Reed et al, 2001) 本文利用 FIASCO 法构建了花鲈 (GT) 13 的微卫星富集文库, 在所有测序的微卫星序列中,CA/GT 重复序列 97 个, 占 89.8% 而通过传统的筛选小插入片段基因文库的方法分离微卫星标记, 得到的阳性克隆比例极低 (0.1%~6.4%, 平均 1.96%) (Zane et al., 2002) 虽然微卫星可分布于基因组的任何地方, 但是在真核生物中, 微卫星位于非编码区的频率远高于

6 520 动物学研究 32 卷位于编码区的 (Toth et al, 2000) 本文研究发现, 在花鲈 8 条基因的全长 cdna 序列中, 微卫星座位多数位于内含子 3'-UTR 5'-UTR 等区域, 仅有 1 个位于外显子区域, 占 12.5%, 这与其它脊椎动物中微卫星在外显子区的分布频率 (9%~15%)(Moran et al, 1993; Jurka et al, 1995) 基本一致这种微卫星位点在编码区的低频现象可能是为了防止蛋白质翻译时发生移码突变的一种保护机制 (Metzgar et al, 2000; Li et al, 2007) 本研究得到的 15 个多态性微卫星位点中有 4 个 (SP17 SP52 SP94 和 SP468) 偏离了 Hardy-Weinberg 平衡偏离 HWE 的原因有很多, 例如, 无效等位基因检测个体不具有代表性交配群体等软件分析表明, 仅位点 SP52 可能存在无效等位基因, 造成其他 3 个位点偏离 HWE 的原因可能是检测个体数目过小, 检测的个体不具代表性等所致微卫星位点的多态性一般用 3 个指标评价 : 等位基因的数目杂合度和多态性信息含量值 (PIC) 其中等位基因数目和杂合度能较好地反映群体中等位基因的丰富程度和均匀程度, 而多态性信息含量值反映了微卫星位点能够提供的遗传信息容量本研究得到的花鲈 15 个多态性微卫星位点共检测到 89 个等位基因, 平均每个位点 5.9 个等位基因, 表现出高度多态性, 且 15 个多态性微卫星位点的观测杂合度在 ~ 之间, 期望杂合度在 ~ 之间 ; 而 Jiang et al(2007) 对 22 个微卫星位点的多态性分析显示, 其观测杂合度在 0.114~0.914 之间, 期望杂合度在 0.111~0.938 之间, 这表明花鲈野生群体具有较高的遗传多样性据 Gu et al (2008), 当 PIC>0.5 时, 表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息本文研究结果表明, 15 个花鲈多态性微卫星位点中的 13 个位点 PIC 值均大于 0.5, 说明本文新开发的微卫星位点提供的遗传信息容量大, 能为群体遗传性分析提供有力的工具本文利用 FIASCO 法和数据库查询法两种方法开发了花鲈微卫星位点 15 个, 并对其多态性进行了研究, 结果表明数据库查询法简便快捷, 多态性好 ; FIASCO 法富集效率高, 适合用于花鲈微卫星标记大规模的开发开发的多态性微卫星标记可为花鲈群体遗传学研究连锁图谱构建等提供有力的支持参考文献 : Brown SM, Hopkins MS, Mitchell SE Multiple methods for the identification of polymorphic simple sequence repeats (SSRs) in sorghum [sorghum bicolor (L.) Moench] [J]. Theol Appl Genet, 93: Furukawa S, Takeshima H, Otaka T, Misuboshi T, Shirasu K, Ikeda D, Kaneko G, Nishida M, Watabe S Isolation of microsatellite markers by in silico screening implicated for genetic linkage mapping in Japanese pufferfish Takifugu rubripe s[j]. Fish Sci, 70: Gu XY, Zeng QG, You ZJ, Lin ZH Isolation and characteristics of six microsatellite primers of tegillarca granosa[j]. Oceanol Limnol Sin, 39: [ 顾晓英, 曾庆国, 尤仲杰泥蚶 (Tegillarca granosa)6 个微卫星引物的分离和鉴定. 海洋与湖沼. 39: ] Ji XS, Chen SL, Ma HY, Xu TJ, Liao XL, Jiang YL Isolation and characterization of 19 EST-linked polymorphic microsatellite loci for olive flounder (Paralichthys olivaceus) [J]. Aquac Res, 40: Jiang X, Liao MJ, Liu YJ, Gao T, Yang GP Isolation and characterization of 22 polymorphic microsatellite DNA markers of Japanese sea bass (Laterolabrax japonicus). [J]. Mol Ecol Notes, 7: Jiang X, Yang G, Liao M, Liu Y, Gao T, Wang D, Wei Q, Zou G Microsatellite DNA polymorphism of Japanese sea bass (Laterolabrax japonicus) inhabiting Chinese and Japanese coasts[j]. J Appl Ichthy, 24: Jurka J, Pethiyagoda C Simple repetitive DNA sequences from primates: compilation and analysis[j]. J Mol Evol, 40: Kuang GQ, Lu SQ, Zheng SM, Wu Q Isolation and evaluation of 18 microsatellite markers in Siniperca chuatsi (Basilewsky) [J]. Mol Ecol Resour, 9: Li WT, Liao XL, Yu XM, Cheng L, Tong J Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in a sex-reversal fish, rice field eel (Monopterus albus) [J]. Mol Ecol Notes, 7: Metzgar D, Wills C Evolutionary changes in mutation rates and spectra and their influence on the adaptation of pathogens[j]. Microbes Infect, 2: Moran C Microsatellite repeats in pig (Sus domestica) and chicken (Gallus domesticus) genomes[j]. J Hered, 84: Reed K M, Beanie C W Isolation of 105 microsatellite loci from an ovine genomic library enriched for microsatellites[j]. Anim Biotech, 12: Toth G, Gaspari Z, Jurka J Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis[j]. Genome Res, 10: Wang JP, Yu XW, Shen PY, Microsatellite loci of portunus trituberculatus: isolation and characterization[j]. Oceanol Limnol Sin, 40: [ 王建平, 余晓巍, 沈庞幼, 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 微卫星位点的分离和序列分析海洋与湖沼, 40: ] Zane L, Bargelloni L, Patarnello T Strategies for microsatellite isolation: a review[j]. Mol Ecol, 11: Zhan AB, Bao ZM, Hu XL, Wang S, Peng W, Wang ML, Hu JJ, Liang CZ, Yue ZQ Characterization of 95 novel microsatellite markers for Zhikong scallop Chlamys farreri using FIASCO-colony hybridization and EST database mining[j]. Fish Sci, 74: Zhang YW, Zhang YP, Oliver AR Microsatellites and its application[j]. Zool Res, 22(4): [ 张云武, 张亚平微卫星及其应用. 动物学研究, 22(4): ]

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Microsoft Word - 李学军.doc 41 1 Vol.41, No.1 2010 1 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jan., 2010 (Sarotherodon melanotheron) 5 * 1, 2 1 2 2 (1. 453007; 2. 201306) 5, 6, : (1) 6 5 22 49, 190 204, 190/190 204/204 270/223 270/243; (2)