中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷第 12 期 2013 年 6 月 1649 分类标准, 不便于独活的药材管理, 同时给临床用药带来极大的安全隐患由于独活的用药部位为植物的干燥根, 在鉴定过程中, 传统的形态分类学特征表现的极不明显除

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俟薛
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1 1648 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷第 12 期 2013 年 6 月药材与资源基于 ITS 序列对独活 17 个种的分子鉴定 * 彭禄, 余岩, 王志新, 赵丽华, 何兴金四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室, 四川成都摘要 : 目的通过对 17 个种共 26 个独活样本的 ITS 序列分析, 为国内中药市场上的常见独活的分子鉴定提供依据, 并探索其科学分类标准方法对 26 个样本的 ITS 进行 PCR 扩增和测序通过 MEGA 5.0 软件比较各序列间的差异性, 计算 K2P 遗传距离 ; 采用邻接法构建 NJ 系统树并应用 Network 软件进行中间连接网法分析构建单倍型网状图结果 NJ 系统树和单倍型网状图显示,26 个样本聚集为 5 大类群, 综合分析后将 17 种独活归为 4 大类 ; 重齿毛当归 Angelica pubescens 的 ITS 序列具有特征碱基片段, 可明显区别于其他样本 ; 除牛尾独活类中 3 个样本不能通过 ITS 序列鉴定到种以外, 其他样本均可以通过 ITS 序列鉴定到种结论 ITS 序列可为药用独活的鉴定和分类提供有力证据, 四带芹类可以作为独活的首选替补品, 牛尾独活类其次, 九眼独活为最后之选关键词 : 独活 ;ITS 序列 ; 分子鉴定 ;PCR 扩增 ;NJ 系统树 ; 单倍型网状图中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) DOI: /j.issn Identification of 17 species of Angelicae Pubescentis Radix based on ITS analysis PENG Lu, YU Yan, WANG Zhi-xin, ZHAO Li-hua, HE Xing-jin Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry of Education, School of Life and Science, Sichuan University, Chengdu , China Abstract: Objective To provide the evidence for the molecular identification of Angelicae Pubescentis Radix (APR) and discuss the scientific classification standard through ITS analysis on 26 samples of APR from 17 species. Methods ITS of 26 populations was amplified and sequenced. The differences among the different samples were compared and K2P genetic distances of ITS sequence were calculated. NJ tree was constructed and haplotype network map was obtained by using the Network software. Results NJ tree and haplotype network map suggested that 26 populations were clustered into five groups, and the 17 APR could be sorted into four types after comprehensive analysis. Angelica pubescens was different from other species due to the distinct base sequence in the ITS sequence. All species were identified by ITS analysis except for the three species in Heracleum L. Conclusion The ITS sequence is powerful for the identification and classification of medicinal APR. Tetrataenium-type plant could be the first choice as succedaneum and followed by Heracleum-type plant, then Aralia-type plant be the last candidate as well. Key words: Angelicae Pubescentis Radix; ITS sequence; molecular identification; PCR amplification; NJ tree; haplotype network map 独活为我国传统中药, 收载于中国药典 2010 年版, 唯一指定原植物体物种为伞形科当归属重齿毛当归 Angelica pubescens Maxim. f. biserrata Shan et Yuan 作为传统中药, 独活具有祛风通络活血舒筋宣通百脉散寒止痛等功效 [1] 现代临床研究表明, 其有抗肿瘤抗炎镇痛镇静抑制血小板聚集和降压作用 [2], 是一味极具研究价值的中药然而, 在国内中药市场流通的独活来源极为混杂, [3] 饶高雄等根据独活商品来源应用习惯等特征, 将独活分为 4 大类, 包括肉独活类 ( 主要为当归属 Angelica L. 植物 ) 牛尾独活类( 主要为独活属 Heracleum L. 植物 ) 九眼独活类( 主要为楤木属 Aralia L. 植物 ) 其他独活类( 主要为前胡属 Peucedanum L. 山芹属 Ostericum Hoffm. 羌活属 Notopterygium H. Boiss. 等植物 ), 涉及到 2 科 6 属共计 60 余种植物如此复杂的药用来源和不科学的收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 教育部博士点基金资助项目 ( ); 中国科学院大科学装置开放研究项目 (2009-LSF-GBOWS-01); 科技部科技基础性工作专项重点项目 (2007FY110100) 作者简介 : 彭禄 (1989 ), 男, 重庆云阳人, 硕士研究生, 研究方向为伞形科药用植物分子鉴定 Tel: (028) l.peng89@gmail.com * 通信作者何兴金, 教授, 博士生导师 Tel: (028) xjhe@scu.edu.cn

2 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷第 12 期 2013 年 6 月 1649 分类标准, 不便于独活的药材管理, 同时给临床用药带来极大的安全隐患由于独活的用药部位为植物的干燥根, 在鉴定过程中, 传统的形态分类学特征表现的极不明显除前胡属植物具有根颈部短粗常存留有枯萎叶鞘纤维和环状叶痕等明显特征易于辨别外, 其他科属植物根茎描述为圆柱形纺锤形圆锥形等, 均属于模糊特征, 不能用于鉴别然而, 之前的研究主要集中于各种独活的化学成分分析及临床应用, 对独活的真伪鉴别, 主要集中于形态学解剖学研究 [4-5] DNA 条形码概念 (DNA barcoding) 自 2003 年 [6] 被 Hebert 等提出以后, 引起了科学界的广泛关注它是利用一段短的标准的 DNA 序列进行物种鉴定的新方法, 该方法不受药材形态所影响, 被广泛用于传统中药道地药材的鉴定中 [7-8] 同时,ITS 序列因为具有核苷酸序列上的高度变异性, 又具有长度上的保守性, 非常适用于解决较低分类阶元上的植物系统发育问题 [9], 被广泛应用于易混淆生药品种及近缘生药品种的鉴定例如, 何首乌 [10] 巴戟天 [11] 丹参 [12] [13] 钩藤属等药用植物与其易混品之间的鉴定, 且能够做到准确的鉴别 [14] 本实验从 60 余种独活植物中筛选出之前有过化学成分分析报道或临床应用研究的主要中药来源共 17 种, 隶属于 2 科 5 属植物因未被广泛使用且从成品药材的外形上就可以甄别的或者有文献指出其形态上可以区分且成分上也不适合作为独活使用的物种, 作为伪品处理例如, 羌活属植物卵叶羌活 Notopterygium forbesii de. Boissieu var. oviforme (Shan) H. T. Chang, 其根茎松软, 在成品药材使用中易于辨别且药用价值不高 [15], 所以不列入本研究范围通过测定并分析其 ITS 序列, 希望能够从分子层面上解决独活的鉴定问题, 保证临床用药安全 ; 同时希望重新探索独活的分类标准, 以便科学地对独活来源进行归类管理 1 材料研究所选样品和材料共涉及 2 科 5 属 17 种共 26 个居群根据所采集样本的地理分布情况采集量的多少, 从来自全国 6 省市近 100 份伞形科植物样本中选取 19 份经硅胶快速干燥的叶片, 所有样本及凭证标本存放于四川大学植物标本馆, 鉴定人为何兴金教授及余岩博士部分序列来源于 GeneBank, 详细信息见表 1 表 1 材料来源 Table 1 Sources of materials 类群凭证标本来源 GeneBank 序列号重齿毛当归 1 Lcy 安徽金寨县 JX 重齿毛当归 2 Lcy 安徽金寨县 JX 白亮独活 0046 XZ0025 西藏江达县 HQ 白亮独活云南中甸县 HQ 白亮独活 0087 XZ0005 西藏芒康县 HQ 白亮独活 0094 yy 四川康定县 HQ 独活 yy 云南中甸县 HQ 短毛独活云南中甸县 HQ 短毛独活四川康定县 HQ 短毛独活 0095 WF 云南德钦县 HQ 短毛独活 0117 YC 云南丽江市 HQ 尼泊尔独活 0172 yy575 西藏吉隆县 HQ 鹤庆独活 0032 yy 云南迪庆州 HQ 狭翅独活 0041 yy 云南中甸县 HQ 平截独活 0018 yy 陕西宝鸡市 HQ 卧龙独活 0048 dyy 四川汶川县 HQ 永宁独活四川阿坝州 HQ 永宁独活 0056 XZ0030 四川德格县 HQ 永宁独活 0081 dyy 四川马尔康 HQ 绿花山芹 GU 大齿山芹 GU 华中前胡 HQ 龙眼独活 U66924 柔毛龙眼独活 U41672 长白楤木 AJ 食用土当归 AJ786236

3 1650 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷第 12 期 2013 年 6 月 2 方法总 DNA 提取采用改良的 CTAB 法 [16] PCR 扩增 [17] 反应体系沿用 Yu 等所用的方法所有测得的序列均已上传 GeneBank, 序列号见表 1 所有序列使用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 进行排序, 进一步使用 MEGA 5.0 软件手工校正通过 MEGA 5.0 软件计算 K2P(Kimura-2-parameter) 距离, 比较各序列间的差异性然后, 采用邻接 (neighbor-joining,nj) 法构建系统树同时, 应用软件 Network 对独活 26 个居群的 ITS 序列进 [18] 行基于简约性原则的中间连接网法分析 (median-joining networks) 构建单倍型网状图 3 结果 3.1 序列特征 PCR 扩增效率和测序成功率本研究包括了 26 个居群的 ITS 基因序列研究的 19 条片段 PCR 扩增效率和测序效率均较高, 分别为 100% 和 92% ITS 序列全长 598~608 bp, 排序的长度为 618 bp, 含 260 个变异位点,GC 量为 53.6% 种独活的 ITS 序列分析 K2P 遗传距离分析重齿毛当归 A. pubescens 白亮独活 H. candicans Wall. ex DC. 短毛独活 H. moellendorffii Hance 以及永宁独活 H. yungningense Hand. -Mazz. 不同产地样品的 K2P 遗传距离均为 0 17 种独活的平均 K2P 遗传距离为其中, 鹤庆独活 H. rapula Franch. 与狭翅独活 H. stenopterum Diels 的遗传距离最小, 仅为 0.002; 独活属尼泊尔独活 H. nepalense D. Don. 与楤木属龙眼独活 Aralia fargesii Franch. 的遗传距离最大, 为各物种之间的 K2P 遗传距离详见表 NJ 树基于 26 条 ITS 序列构建的 17 种独活的 NJ 树, 结果见图 1 整个 NJ 系统树包含 5 个大分支, 分别为五加科楤木属 A 支, 山芹属的 B 支, 前胡属和当归属构成的 C 支, 白亮独活组成的 D 支以及独活属其他植物构成的 E 支各个分支的支持率均在 96% 以上 Network 单倍型网状分析 Network 单倍型网状分析主要是利用分析物种的单倍型来探讨其谱系亲缘关系 [19], 但近年来被探索应用于中药材的分子鉴定研究本研究单倍型网状图所显示结果主要分为 5 个区域, 见图 2 楤木属主要集中在 A 区, 山芹属集中在 B 区,C 区为前胡属和当归属植物, D 区为白亮独活和尼泊尔独活, 而独活属其他植物表 2 ITS 序列的种间 K2P 遗传距离 Table 2 K2P genetic distances of intra-specific ITS sequences 样本白亮独活短毛独活永宁独活尼泊尔独活卧龙独活平截独活狭翅独活鹤庆独活独活重齿毛当归绿花山芹大齿山芹华中前胡柔毛龙眼独活龙眼独活食用土当归长白楤木白亮独活短毛独活永宁独活尼泊尔独活卧龙独活平截独活狭翅独活鹤庆独活独活重齿毛当归绿花山芹大齿山芹华中前胡柔毛龙眼独活龙眼独活食用土当归长白楤木

4 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷第 12 期 2013 年 6 月图 1 基于 ITS 序列构建的 NJ 系统树 Fig. 1 NJ tree based on ITS sequences 图 2 药用独活 26 个 ITS 单倍型构建的中间连接网状图 Fig. 2 Median-joining network of ITS haplotypes for 26 APR 共同组成 E 区从图可见,D 区与 E 区之间间隔较远,A 区与 B 区相隔较近 4 讨论 E 独活的分类问题 D 100 C B 99 A 短毛独活 (0068) 短毛独活 (0117) 短毛独活 (0070) 短毛独活 (0095) 狭翅独活 (0041) 鹤庆独活 (0032) 独活 (0039) 永宁独活 (0081) 永宁独活 (0038) 永宁独活 (0056) 卧龙独活 (0048) 平截独活 (0018) 尼泊尔独活白亮独活 (0087) 白亮独活 (0094) 白亮独活 (0046) 白亮独活 (0079) 华中前胡 (HQ256686) 重齿毛当归 (JX022900) 重齿毛当归 (JX022899) 绿花山芹 (GU390413) 大齿山芹 (GU390409) 柔毛龙眼独活 (U41672) 长白楤木 (AJ786232) 龙眼独活 (U66924) 食用土当归 (AJ789236) 短毛独活 0068 狭翅独活 E A 独活短毛独活 0070 短毛独活 0095 龙眼独活长白楤木卧龙独活短毛独活 0117 柔毛龙眼独活平截独活鹤庆独活食用土当归永宁独活 0081 永宁独活 0056 绿花山芹白亮独活 0046 永宁独活 0038 白亮独活 0087 B 大齿山芹重齿毛当归 2 白亮独活 0079 重齿毛当归 1 白亮独活 0094 尼泊尔独活 D 华中前胡 C 在本研究中无论是 NJ 树, 还是网状分析图都共同指出 5 个大的分支 ( 网状分析图为 5 个大的分布区 ) 其中, 华中前胡和重齿毛当归构成 C 支 ( 区 ), 山芹属独立构成 B 支 ( 区 ), 说明当归属与前胡属亲缘关系很近, 而与山芹属关系较远本研究结果 [20] 与薛华杰等的研究一致白亮独活和尼泊尔独活构成 D 支 ( 区 ), 与独活属其他植物 E 支 ( 区 ) 分 [17] 开, 与 Yu 等的研究结果一致研究认为白亮独活尼泊尔独活等应从独活属划分到四带芹属 Tetrataenium (DC.) Manden. 中, 本研究结果的 NJ 树中白亮独活和尼泊尔独活构成 D 支, 在网状分析图中 [17] 白亮独活和尼泊尔独活构成 D 分布区, 支持 Yu 等的观点, 并为其补充了网状分析和分布上的证据 [3] 饶高雄等的分类标准, 虽然能够涵盖到所有的独活来源, 但将山芹属前胡属及羌活属等植物归为 4 大类中的其他类, 有待商榷笔者收集前人针对独活药用化学成分的比较分析资料和结果来看, 本研究中的独活属 [21] 四带芹属 [22-23] [24] 当归属 [25] 和前胡属样本的化学成分以香豆素类化合物为主在楤木属中, 其化学成分主要以皂苷类黄酮类为主, 仅发现其含有少量的香豆素类化合物 [26-27] 虽然绿花山芹大齿山芹在中国部分省份作为独活药用 [15], 但其根所含化学成分却以脂肪酸和甾醇为主, 不具有独活的药用价值同时,NJ 系统树以及网状分析图中, 山芹属都构成独立的分支 ( 区 ) 所以, 建议将山芹属植物作为伪品处理, 从独活的 4 大类中剔除 [3] 本研究在饶高雄等的分类方法基础上, 将化学成分与 ITS 序列整合分析后, 建议将独活的分类做以下处理, 以达到对独活来源的个科学分类管控详细分类为肉独活类 ( 包括伞形科当归属前胡属 ), 牛尾独活类 ( 伞形科独活属 ), 龙眼独活类 ( 五加科楤木属 ), 四带芹类 ( 伞形科四带芹属 ) 4.2 基于 ITS 序列对独活的分子鉴定问题及可行性分析 ITS 序列作为核糖体 DNA 中的具有高度保守性的序列, 近些年被广泛用于药用植物的分子鉴定, 并取得较为理想的效果 [7-14] 通过对比来源于 2 科 5 属的共 17 种 26 个居群 ( 样品 ) 的独活 ITS 碱基序列, 发现重齿毛当归在 219~224 bp 的碱基为 AATACG,413~415 bp 为 GAT,429~435 bp 为 GTACGGA,567~569 bp 为 CGT, 具有明显的分子标记, 可区别于其他所有样品因此, 用 ITS 分子标记来鉴定中国药典 2010 年版中的正品独活 ( 即重齿毛当归 ) 是可行的, 因为重齿毛当归具有非常明显的 ITS 特征碱基片段同时,NJ 系统树所表现的支持率均较高除了 E 分支内的狭翅独活鹤庆独活以及独活以平行支出现以外, 其他物种都能做到单独分支 ( 即基本上可以鉴定到种 ) K2P 遗传距离图也显示除牛尾独活类植物部分种间距离较小以外, 其他物种都能做到单独分支所以鉴定牛尾独活类到种一级程度还需要增添其他证据但其他种类种间

5 1652 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷第 12 期 2013 年 6 月距离和分支较为明显, 可成功鉴定到种研究表明,ITS 序列可以作为独活的分子鉴定主力证据, 应用于国内中药市场上, 去伪存真辨真识劣, 保证临床用药品质和安全而牛尾独活类植物如果要准确鉴定到种, 则需要增加分子标记的片段, 可能需要增加叶绿体 DNA 片段作为辅助的联合分子标记片段才能有效准确鉴定到种 [17] 4.3 独活的化学成分与 NJ 树联合分析问题探讨中国药典 2010 年版中指定的独活的原植物为 1 个种, 即重齿毛当归就传统中药独活根的药用效果而言, 具有治疗效果的是独活的化学成分, 前人通过对重齿毛当归和牛尾独活类植物的化学成分进行研究, 结果表明具有治疗效果的是独活根的药用成分香豆素类化合物 [21-25] 作为独活的重齿毛当归和牛尾独活类植物, 或者说整个独活属植物, 都表现出紧密的亲缘关系从分子系统树 (NJ 树 ) 上看来, 当归属独活属以及前胡属组成了一个更为广泛的大类群, 系统支持率高达 99%, 而山芹属和楤木属与重齿毛当归相隔较远因此, 从分子标记分析结果看来, 山芹属和五加科的楤木属不应该纳入独活的范围前人的化学成分研究显示, 山芹属和五加科的楤木属的药用植物根中主要化学成分不是香豆素类化合物 [25-26] 而独活属的成员, 尤其是白亮独活和牛尾独活类植物, 其根部含有大量起药用治疗效果的独活化学成分, 因此, 结合分子标记和药用化学成分分析结果, 认为四带芹类和牛尾独活类可以作为独活的首选替补品使用 4.4 独活分子鉴定的单倍型网状分析本实验除了应用分子标记 ITS 的常规分析方法对 2 科 5 属 17 种 26 个样本进行研究, 还尝试运用网状分析方法, 通过分析对其单倍型, 推演其祖先筑巢和分布区扩散的方法, 分析重齿毛当归和独活属植物的分布区和扩散分布等进化历程从图 2 来看, 重齿毛当归与整个独活属植物具有较紧密的亲缘关系, 尤其与华中前胡和四带芹类非常接近从进化历程来讲, 牛尾独活类四带芹类与肉独活类具有共同的祖先结合 17 种独活化学成分分析以及分子证据, 认为四带芹类作为独活的首选替补品, 牛尾独活类其次, 九眼独活类为最后之选参考文献 [1] 中国药典 [S]. 一部 [2] 林黎, 钱晓萍, 刘宝瑞. 中药独活的化学成分及其抗肿瘤活性的研究进展 [J]. 现代肿瘤研究, 2011, 19(2): [3] 饶高雄, 杨祺, 戴万生. 中药独活羌活的本草沿革和植物来源 [J]. 云南中医学院学报, 1994, 17(4): [4] 李建雄, 袁桂香. 药用独活的资源与鉴定 [J]. 基层中药杂志, 1998, 12(2): 5-6. [5] 赵颖, 何兴金, 张桥英, 等. 独活属药用部位的解剖学研究 [J]. 西华师范大学学报, 2004, 25(1): [6] Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes [J]. Proc Biol Sci, 2003, 270: [7] 朱英杰, 陈士林, 姚辉, 等. 重楼属药用植物 DNA 条形码鉴定研究 [J]. 药学学报, 2010, 45(3): [8] 刘美子, 宋经元, 罗焜, 等. DNA 条形码序列对 9 种蒿属药用植物的鉴定 [J]. 中草药, 2012, 43(7): [9] 田欣, 李德铢. DNA 序列在植物系统学研究中的应用 [J]. 云南植物研究, 2002, 24(2): [10] 张宏意, 石祥刚. 不同产地何首乌的 ITS 序列研究 [J]. 中草药, 2007, 38(6): [11] 丁平, 方琴. 巴戟天与常见混伪品的 rdna-its 序列分析及其分子鉴定 [J]. 中草药, 2005, 36(6): [12] 汪红, 王强. 丹参及鼠尾草属植物的 rdna-its 序列分析 [J]. 中草药, 2005, 36(9): [13] 陶刚, 刘涛, 朱英, 等. 贵州中药材钩藤属植物的分子鉴定 [J]. 中药材, 2008, 31(6): [14] 于华会, 杨志玲, 杨旭, 等. 药用植物种植资源 ITS 序列研究进展 [J]. 中草药, 2010, 41(3): [15] 单人骅, 佘孟兰, 王铁僧, 等. 中国植物志 ( 第 55 卷第 1 分册 ) [M]. 北京 : 科学出版社, [16] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull, 1987, 19: [17] Yu Y, Stephen R D, He X J, et al. Phylogeny and biogeography of Chinese Heracleum (Apicaceae tribe Tordylieae) with comments on their fruit morphology [J]. Plant Syst Evol, 2011, 296: [18] Bandelt H J, Forster P, Rohl A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies [J]. Mol Biol Evol, 1999, 16: [19] 王晓雄, 乐霁培, 孙航, 等. 青藏高原高山流石滩特有植物绵参的谱系地理学研究 [J]. 植物分类与资源学报, 2011, 33(6):

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Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus