科研信息化技术与应用 2013, 4(3): 应用 / APPLICATION 当归药材及其混伪品 ITS2 条形码鉴定 辛天怡, 姚辉, 韩建萍, 宋经元 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所濒危药材繁育国家工程实验室, 北京 摘要 : 关键词 : 为了确保该药材的

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1 科研信息化技术与应用 2013, 4(3): 应用 / APPLICATION 当归药材及其混伪品 ITS2 条形码鉴定 辛天怡, 姚辉, 韩建萍, 宋经元 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所濒危药材繁育国家工程实验室, 北京 摘要 : 关键词 : 为了确保该药材的质量及临床安全用药, 需要对常用中药当归及其混伪品进行分子鉴定 本文介绍了利用 ITS2 条形码进行鉴定的方法 : 对 ITS2 序列进行 PCR 扩增, 并将纯化后的 PCR 产物进行双向测序, 运用 CodonCode Aligner 拼接后, 基于 HMMer 注释方法去掉两端的 5.8S 区和 28S 区获得 ITS2 条形码, 用 MEGA5.0 软件进行相关数据分析, 构建 NJ 树 结果表明 : 当归与其混伪品 ITS2 条形码间存在明显差异, 基于 ITS2 条形码构建的 NJ 树能够将当归及其混伪品区分开 因此, ITS2 条形码可有效地鉴别中药当归及其混伪品, 为保证其临床用药安全提供了新的技术手段 当归 ;ITS2 条形码 ; 鉴定 Authentication of Angelicae Sinensis Radix and Its Adulterants by Analysis of ITS2 Barcode Xin Tianyi, Yao Hui, Han Jianping, Song Jingyuan The National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing , China Abstract: In this paper, a method using ITS2 barcode to identify Angelicae sinensis Radix and its adulterants is introduced. Firstly, the PCR technique was performed to get the ITS2 barcodes and purified PCR products were sequenced bi-directionally. Then sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner. To remove the 5.8S and 28S region, the hidden Markov model (HMM)-based annotation methods were used. Finally, the ITS2 barcodes were aligned with Clustal-W and the genetic distances were computed by MEGA 5.0 according to the Kimura-2-Parameter (K2P) model. The Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed. The results showed that there is obvious genetic divergence in the ITS2 sequences between Angelicae sinensis Radix and its adulterants. NJ tree based on 基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( ); 国家高技术研究发展计划 (863 计划 ) (2012AA021602); 长江学者和创新团队发展计划 (IRT1150) 76

2 辛天怡等 : 当归药材及其混伪品 ITS2 条形码鉴定 Keywords: ITS2 barcodes can distinguish Angelicae sinensis Radix and its adulterants. This concludes that ITS2 region as a DNA barcode can effectively provided a new technique for identification of Angelicae sinensis Radix. Angelicae sinensis Radix; ITS2 barcode; identification DNA 条形码技术是指采用基因组中一段公认标 准的 相对较短的 DNA 片段作为标记, 进行物种鉴 定的分子诊断新技术 该技术作为新兴的物种鉴定方 法, 不受生物发育阶段和形态的限制, 具有较强的通 用性, 近些年受到国内外研究人员的广泛关注 [1-5], [2] Chen 等于 2010 年发表文章, 提出 ITS2 序列能够作 为标准 DNA 条形码用于药用植物及其近缘物种的鉴 [3] 定 同时,Yao 等基于大样本量分析证实 ITS2 序列 可以作为植物物种鉴定的通用条形码, 并以其为基础 初步建立了药用植物 DNA 条形码数据库网络查询系 统 ( 年, 中国植 物条形码工作组 (Chinese Plant BOL Group) 研究表明, ITS 条形码具有最高的物种分辨率, 当该序列难以扩 增和测序时, 可采用 ITS2 条形码作为补充, 建议将 ITS/ITS2 序列作为种子植物的核心 DNA 条形码 [4] 2010 版药典规定当归 (Angelicae sinensis Radix) 来源于伞形科 (Apiaceae) 当归属 (Angelica) 植物当归 (A. sinensis (Oliv.) Diels), 具有补血活血, 调经止痛, 润肠通便的功效 [6] 当归的用药历史悠久, 自东汉末 年 神农本草经 以来, 历代本草对其均有记载 在 临床上当归的用途十分广泛, 素有 十方九归 之 说, 并被誉为 血家圣药 现代研究表明, 当归含 有挥发油 阿魏酸 藁本内酯等多种化学成分, 具有 调节血液循环系统 平滑肌抑制 抗炎 镇痛 增强 免疫力等多种药理作用 [7-9] 由于其广泛的用途及市 场前景, 使得当归的价格逐年上涨, 掺伪现象频出, 文献报道的混伪品主要有欧当归 (Levisticum officinale Koch) 大叶当归 (A. magaphylla Diels) 金山当归 (A. valida Diels) 疏叶当归 (A. laxifoliata Diels) 青海当 归 (A. nitida Wolff) 和东当归 (A. acutiloba Kitag) 等, 文献中多采用性状 显微和理化鉴别等方法对上述混 伪品进行鉴别 [10-13] [14], 张春等曾采用硅胶干燥的叶片 获得 rdna ITS 序列对当归及其混伪品进行分析和鉴 别, 本研究以当归药材直接获取 ITS2 条形码序列, 旨 在寻求一种快速 便捷的方法对当归及其混伪品进行 鉴定, 规范当归药材市场, 保证临床用药安全 1 材料与方法 1.1 材料 本研究共涉及当归及其混伪品共 40 条序列, 当归药材样本分别来源于北京绿野药业有限公司, 标本号 YC0133MT01, 河北安国药材市场, 标本号 YC0133MT02; 当归新鲜叶片采自甘肃省岷县, 标本 号 PS1205MT01 (GenBank 登录号 GQ434694); 经中 国医学科学院药用植物研究所林余霖老师鉴定, 凭证 标本保存于药用植物研究所标本馆 其余当归及其混 伪品共 37 条 ITS 序列下载自 GenBank, 通过剪切即 可获得相应的 ITS2 序列 样品信息详见表 DNA 提取 当归药材样本用 75% 乙醇擦拭药材表面后刮去 外皮, 取内部的药材约 40 mg, 硅胶干燥叶片样本取 [15] 约 20 mg, 依照文献所述样本处理方法, 采用植物 基因组 DNA 提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co., China) 提取总 DNA 1.3 PCR 扩增和测序 PCR 扩增 测序引物正向 ITS2F 为 5 - ATGC G A T A C T T G G T G T G A A T - 3, 反向 I T S 3 R 为 5 -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 [2] PCR 反应 体积为 25 µl, 体系内含 MgCl 2 2 µl (25 mmol L -1 ) dntps 2 µl (2.5 mmol L -1 ) Mg µl (25 mmol L -1 ) 引物各 1 µl (2.5 µmol L -1 ) Taq 聚合酶 0.2 U 总 DNA 约 2 µl 扩增程序 :94 变性 5 min, 再进 行 40 个循环 (94 变性 30 sec,56 退火 30 sec, 77

3 科研信息化技术与应用,2013, 4 (3) 表 1 研究所用材料信息表 Table 1 Samples used in the present study and the sequence characteristics 中文名 拉丁名 凭证标本号 GenBank No. 序列长度 (bp) GC 含量 (%) 当归 Angelica sinensis YC0133MT 当归 A. sinensis YC0133MT 当归 A. sinensis PS1205MT01 GQ 当归 A. sinensis AY 当归 A. sinensis DQ 当归 A. sinensis FJ 当归 A. sinensis FJ 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis GU 当归 A. sinensis JX 欧当归 Levisticum officinale AF 欧当归 L. officinale GU 欧当归 L. officinale U 东当归 A. acutiloba AB 东当归 A. acutiloba AB 东当归 A. acutiloba AB 东当归 A. acutiloba AB 东当归 A. acutiloba AB 东当归 A. acutiloba AB 东当归 A. acutiloba DQ 东当归 A. acutiloba GU 金山当归 A. valida DQ 金山当归 A. valida GU 金山当归 A. valida JX 青海当归 A. nitida DQ 青海当归 A. nitida EU 青海当归 A. nitida FJ 青海当归 A. nitida FJ 青海当归 A. nitida FJ 青海当归 A. nitida GU 青海当归 A. nitida JX 疏叶当归 A. laxifoliata JX 疏叶当归 A. laxifoliata JX 疏叶当归 A. laxifoliata JX 疏叶当归 A. laxifoliata GU

4 辛天怡 等: 当归药材及其混伪品 ITS2 条形码鉴定 72 延伸 45 sec) 最后 72 延伸 10 min PCR 扩 2.2 当归及其混伪品 ITS2 条形码序列长度 GC 含 增产物经纯化后 使用 ABI 3730XL 测序仪双向测序 量及序列差异 当归的 15 条参考序列 ITS2 条形码序列的长度范 围为 226~229 bp GC 含量范围为 55.5~55.8% 见表 1.4 数据分析 测序峰图使用 CodonCode Aligner 3.7 (CodonCode Co., USA) 进行拼接及校对 研究所涉及的全部实验 1 比对后序列长度为 229 bp 序列之间没有变异位 点 种内平均 K2P 距离为 0 以及下载的序列采用基于隐马尔科夫的 HMMer 注 当归混伪品共 25 条 ITS2 条形码序列长度范围 释方法去除两端 5.8S 和 28S 区段即可获得 ITS2 条 为 222~229 bp GC 含量范围为 53.7%~58.1% 当归 形码序列 [16] 对本研究涉及的全部当归 ITS2 序列 及其 5 种混伪品的共 40 条 ITS2 条形码在序列长度及 应用 CodonCode Aligner 软件获得其 consensus 序 GC 含量上均有差异 见表 1 所有样品 ITS2 序列比 列 采用 MEGA (Molecular Evolutionary Genetics 对后长度为 230 bp 共有 49 个变异位点 以单倍型 Analysis) 5.0 软件基于K2P模型计算遗传距离 并采 展示的变异位点情况见图 2 当归及其混伪品种间平 用邻接法(Neighbor-Joining, NJ) 建立系统发育树 (NJ 均 K2P 距离为 种间最小 K2P 距离为 树) 进行物种鉴别 NJ 树各分支的置信度自举检测 (bootstrap)1000 次[17] 2.3 当归与其近缘物种的 NJ 树鉴定 邻接法是依据遗传距离构建系统发育树的方法 采用聚类分析[18] 该方法建树运算速度较快 能够在 2 结果及分析 较短的时间内进行数据分析 因此本研究选择构建 2.1 当归 ITS2 条形码 consensus 序列 NJ 树对当归及其近缘物种的亲缘关系进行研究 从 对当归 15 条参考序列 (见表 1) 应用 CodonCode Aligner 软件获得其 consensus 序列 如图 1 所示 基于 ITS2 序列构建的 NJ 树 (图 3) 可以看出 当归及 其混伪品共 6 个物种主要聚为二大支 除欧当归外 70 bp 140 bp 210 bp 229 bp 图1 当归 ITS2 条形码 consensus 序列 Fig. 1 The ITS2 consensus sequence of Angelicae sinensis Radix 当归 欧当归 东当归 金山当归 青海当归 疏叶当归 图2 当归与其近缘物种的变异位点 (每一纵列数字代表发生变异的碱基位点) Fig. 2 The variable sites between Angelicae sinensis Radix and its adulterants 79

5 科研信息化技术与应用,2013, 4 (3) Angelica laxifoliata JX Angelica laxifoliata JX Angelica laxifoliata GU Angelica laxifoliata JX 疏叶当归 Angelica valida DQ Angelica valida GU Angelica valida JX Angelica nitida DQ 金山当归 Angelica nitida EU Angelica nitida FJ Angelica nitida FJ Angelica nitida FJ 青海当归 Angelica nitida GU Angelica nitida JX Angelica acutiloba DQ Angelica acutiloba GU Angelica acutiloba AB Angelica acutiloba AB Angelica acutiloba AB 东当归 63 Angelica acutiloba AB Angelica acutiloba AB Angelica acutiloba AB Levisticum officinale GU Levisticum officinale U78449 欧当归 Levisticum officinale AF Angelica sinensis GU Angelica sinensis FJ Angelica sinensis DQ Angelica sinensis YC0133MT Angelica sinensis YC0133MT02 Angelica sinensis GQ Angelica sinensis AY Angelica sinensis FJ 当归 Angelica sinensis GU Angelica sinensis GU Angelica sinensis GU Angelica sinensis GU Angelica sinensis GU Angelica sinensis GU Angelica sinensis JX 图 3 基于 ITS2 序列构建的当归及其混伪品 NJ 树 ( 自展支持率 50%) Fig. 3 Phylogenetic tree of Angelicae sinensis Radix and its adulterants constructed with the ITS2 sequences using NJ method. The bootstrap scores (1 000 replicates) are shown ( 50%) for each branch 80

6 辛天怡等 : 当归药材及其混伪品 ITS2 条形码鉴定 其余混伪品聚为一大支 ; 当归与欧当归聚为同一大 支 在每一大支中, 每个物种的 ITS2 序列均单独聚 为一小支, 呈现良好的单系性 ITS2 条形码能够完 全将当归及其混伪品区分开 3 讨论 当归作为我国传统的活血化瘀类药物, 因其广 泛的用途以及各地用药习惯不同, 导致市场上的品种 较为混乱, 其中最主要的两种混伪品为东当归和欧当 归 东当归于 20 世纪 70 年代在我国吉林省延吉市引 种成功, 作为朝鲜族的民族药广泛应用 ; 欧当归原产 亚洲西部, 欧洲及北美各国多有栽培, 我国于 1957 年自欧洲引种该种, 民间以其作为当归的代用品 ; 而 1987 年资源普查之后, 我国明确提出禁止以欧当 归和东当归代替当归入药 [19] 因此, 选择快速 简便 的方法对当归及其混伪品进行鉴定显得尤为重要 传 统中药鉴定主要依靠基原 性状鉴别, 但这类方法都 需要鉴定专家长期的经验积累, 对于鉴定人员主观 判断能力的依赖性较强 DNA 条形码技术实验操作 简便, 不受药材性状的限制, 能够直接从基因水平上 提供鉴别依据, 对于不同入药部位的中药材均可鉴定 其基原 已报道的文献中大多采用硅胶干燥叶片或 新鲜组织, 极少数采用药材为对象进行 DNA 提取 扩增, 以获得可用与分析的条形码 [15, 20-27] ITS2 条形 码长度较短, 扩增 测序难度低, 适用于部分 DNA [2] 降解的中药材样品扩增 Chen 等的研究发现 ITS2 序列在物种水平上鉴定的成功率超过 90%, 证实了 ITS2 序列在物种水平具有较高的鉴定效率 因此, 本研究选取 2 个当归药材样本 1 个原植物样本进行 试验, 成功获得当归 ITS2 条形码序列, 序列比对结 果无变异位点, 因此仅提交一条序列至 GenBank, 登 录号 GQ 通过比对显示所得当归 ITS2 条形码 与 GenBank 中已提交的序列相同,15 条当归 ITS2 序 列均能够完全与其混伪品序列区分, 显示该条形码能 够为该药材的准确鉴定提供分子依据 [28] 薛华杰等基于 ITS 序列对东亚当归属植物进 行了分类学研究, 其对 ITS 序列的分析结果支持狭义 当归属不是单起源的自然分类群, 当归与狭义当归属 的多数植物之间均具有一定的差距, 其归属问题值得 商榷 自 GenBank 下载该作者提交的当归 ITS 序列 ( 登录号 :DQ263570), 采用 HMMer 注释法获得 ITS2 序列后同本研究所得当归 ITS2 条形码进行比对, 无 变异位点存在 该文献在当归属系统分类学方面为 [14] 本研究提供了理论支持 张春等基于 rdna ITS 序 列对中药当归及其混伪品进行研究, 采用硅胶干燥 的叶片进行 DNA 提取并获得当归及其混伪品 ITS 序 列, 通过比对发现当归与混伪品间的碱基差异显著, 去除当归与欧当归相同的碱基后, 共有 13 个当归 的特异鉴别位点 ; 当归及其混伪品种间 K2P 距离为 0.074~0.135, 支持本研究所得结果 本研究中, 在基 于 ITS2 条形码构建的当归及其混伪品 NJ 树中, 当 归及其 5 种混伪品各自聚为一小支, 显示出良好的单 系性 ; 混伪品东当归 青海当归 金山当归 疏叶当 归共聚为一大支, 欧当归和当归聚为一大支, 显示当 归与欧当归之间的亲缘关系较近, 而与其他 4 个物种 亲缘关系相对较远 此外, 当归及其混伪品种间最小 K2P 距离为 0.074, 远远大于当归种内 K2P 距离 因 此,ITS2 条形码能够有效地鉴别中药当归及其混伪 品, 为保证其临床用药安全提供了新的技术手段, 并 且有利于对其药材资源的保护和合理开发利用 参考文献 [1] Li DZ, Liu JQ, Chen ZD, et al. Plant DNA barcoding in China[J]. Journal of Systematics and Evolution, (3): [2] Chen SL, Yao H, Han JP, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[j]. PLoS one, (1): e8613. [3] Yao H, Song JY, Liu C, et al. Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals[j]. PLoS one, (10): e [4] Li DZ, Gao T, Li HT, et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants[j]. Proceedings of the National Academy of 81

7 科研信息化技术与应用,2013, 4 (3) Sciences, (49): [5] 陈士林. 中药 DNA 条形码分子鉴定 [M]. 北京 : 人民卫生出版社, [6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 ( 一部 )[S]. 北京 : 中国医药科技出版社. 2010, 124 [7] 康军. 当归化学成分及其药理作用研究进展 [J]. 医药产业资讯, (23): [8] 夏泉, 张平, 李绍平等. 当归的药理作用研究进展 [J]. 时珍国医国药, (3): [9] 侯文启. 当归有效成分 HPLC 和 HPLC-MS 比较分析 [J]. 中国中医药咨讯, (2): [10] 王翰华, 胡双丰. 当归及其常见伪品东当归和欧当归的鉴别 [J]. 中国医药指南, (5): 4-5. [11] 张林英, 何兴金. 四川当归属植物资源及其开发利用 [J]. 中国野生植物资源, (1): [12] 肖吉元, 杨扶德, 罗文蓉等. 当归与欧当归的鉴定学比较研究 [J]. 西部中医药, 2012(8): [13] 马丽娜. 当归及混伪品的鉴别 [J]. 健康必读 : 下半月, 2011(4): [14] 张春, 王晓丽, 朱烨等. 中药当归及其混伪品的 rdna ITS 序列分析与鉴别 [J]. 四川农业大学学报, (2): [15] 辛天怡, 姚辉, 罗焜等. 羌活药材 ITS/ITS2 条形码鉴定及其稳定性与准确性研究 [J]. 药学学报, (8): [16] Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al., 5.8 S-28S rrna interaction and HMM-based ITS2 annotation[j]. Gene, (1-2): 50. [17] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods[J]. Mol. Biol. Evol. 2011, 28(10): [18] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[j]. Mol. Biol. Evol. 1987, 4(4): [19] 孙红梅, 张本刚, 齐耀东等. 当归药材资源调查与分析 [J]. 中国农学通报, (23): [20] 韩建萍, 李美妮, 罗焜等. DNA 条形码鉴定洋金花及其伪品 [J]. 药学学报, (11): [21] Pang X., Song J, Zhu Y, et al., Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification[j]. Cladistics, (2): [22] 朱英杰, 陈士林, 姚辉等. 重楼属药用植物 DNA 条形码鉴定研究 [J]. 药学学报, (3): [23] Gao T, Yao H, Song J, et al., Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2[J]. Journal of ethnopharmacology, (1): [24] Gao T, Yao H, Song J, et al., Evaluating the feasibility of using candidate DNA barcodes in discriminating species of the large Asteraceae family[j]. BMC Evolutionary Biology, (1): 324. [25] Pang X., Song J, Zhu Y, et al., Using DNA barcoding to identify species within Euphorbiaceae[J]. Planta medica, (15): [26] 陈士林, 姚辉, 宋经元等. 基于 DNA barcoding ( 条形码 ) 技术的中药材鉴定 [J]. 世界科学技术 中医药现代化, (3): [27] 罗焜, 马培, 姚辉等. 多基原药材秦艽 ITS2 条形码鉴定研究 [J]. 药学学报, (12): [28] 薛华杰, 闫茂华, 陆长梅等. 基于 ITS 序列的东亚当归属植物的分类学研究 [J]. 植物分类学报, (6): 收稿日期 :2012 年 12 月 5 日辛天怡 : 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 硕士研究生 主要研究方向为中药资源学 xintianyi87@sina.com 姚辉 : 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 副研究员, 博士 主要研究方向为中药资源学 hyao@implad.ac.cn 韩建萍 : 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 副研究员, 博士 主要研究方向为中药资源学 jphan@implad.ac.cn 宋经元 : 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 研究员, 博士 主要研究方向为中药资源学 jysong@implad.ac.cn 82

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