Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No Clematis chinensis Osbeck Clematis hexapetala Pall. Clematis manshurica

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1 Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No. 4 ITS2 ITS2 DNA NJ Schultz ITS2 ITS2 ITS2 220 bp 230 bp NJ 83% ITS2 DNA DNA ITS2 R A doi /j. issn Molecular identification of radix et rhizoma clematis and its adulterants based on ITS2 DNA barcode ZENG Xu LI Li YE Ning et al. Department of Resources Science of Traditional Chinese Medicines China Pharmaceutical University Nanjing China Corresponding author LIU Zhi-hua zhliu@ implad. ac. cn QIN Min-jian minjianqin@ 163. com Abstract Objective To discriminate radix et rhizoma clematis and its adulterants and also assure the quality and clinicalsafety of this traditional Chinese medicinal material. Methods In the study ITS2 sequence of the clematis and its adulterants were evaluated according to sequence length GC content intra - specific variation as well as the inter - specific divergence. NJ tree of radix et rhizoma clematis its adulterants had been constructed using MEGA4 software. The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website constructed by Schultz et al. Results The length of ITS2 sequence of the origin plants of radix et rhizoma clematis were 220 bp and 230 bp respectively. In the phylogenetic tree the three origin plants could be clustered together and the favorability rating was 85 %. From the branches of the plants the distribution center of the clematis genera in southwesten China conformed with the theory of center spread periphery. The difference between radix et rhizoma clematis and other species could be found in the number size position of loop and the angle of helix exsertion based on comparing the ITS2 secondary structure of the origin plants of radix et rhizoma clematis and its adulterants. Conclusion can be used to correctly identify radix et rhizoma clematis and its adulterants and it plays an important role in the identification of traditional Chinese medicine. Key words Radix et rhizoma clematis DNA barcoding ITS2 Identification D xzeng. liulab@ gmail. com zhliu@ implad. ac. cn minjianqin@ 163. com ITS2 转载

2 Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No Clematis chinensis Osbeck Clematis hexapetala Pall. Clematis manshurica Rupr Genbank Smilax Clematis 2 3 Inula neruosa Wall. Sarandra glabra Thunb. NaRai 1 Material 4 Clematis hexapetala GQ Clematis manshurica GU Clematis lasiandra GU Paeonia lactiflora Pall. Clematis pogonandra GU Clematis uncinata GU Sarcandra glabra GQ Sarcandra glabra GQ Sarcandra glabra AF Sarcandra glabra AF DNA DNA barcoding Podophyllum hexandrum Podophyllum hexandrum GQ AJ DNA Podophyllum hexandrum AJ Paeonia lactiflora GQ Smilax lasioneura AY Smilax herbacea AY PaulHebert C COI DNA 9 70% DNA 15 mg 30 mg DNA Tiangen Biotech Co. China DNA rdna 5. 8S 26S rrna PCR ITS2 ITS2 5'-GCGATACTTGGTGTGAAT- DNA 3' 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3' DNA PCR MgCl 2 2 μl 25 mm dntp 2 μl 2. 5 mm PCR buffer 2. 5 μl μl 2. 5 ITS2 μm Sangon Co. China 1. 0 U Biocolor DNA BioScience & Technology Co. China DNA 1 Clematis chinensis Clematis hexapetala Clematis hexapetala Genbank Latin Name Genbank No. GU GU AY055385

3 Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No. 4 1 μl 25 μl PCR PolyC PolyG GC Tiangen Biotech Co. China 69. 5% Clematis manshurica ABI 3730XL Applied Biosystems Co. USA CodonCode Aligner ITS HMMer S 26S ITS2 MEGA Kimura 222 Parameter K2P NJ neighbour-2-joining method NJ Genbank ITS bootstrap Schul- bp151 bp C-G tz ITS2 Schultz 16 1 bp 5 bp 209 ITS2 ITS PolyC PolyG GC 69. 9% Clematis hexapetala 220 bp 230 bp PolyC PolyG GC 69. 9% Kimura-2 bp 222 bp 230 bp K2P K2P ITS2 ITS2 K2P Clematis chinensis 230 bp 1

4 Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No ITS2

5 Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No ITS2 DNA ITS2 ITS % DNA 92. 7% ITS2 DNA % ITS2 3 3 Ⅳ Ⅳ % 2 Ⅳ I Ⅲ ITS Helleboroideae 21 ITS2 DNA 2 ITS2 NJ bootstrap %

6 Global Traditional Chinese Medicine July 2011 Vol. 4 No S J J J J J DNA barcoding J DNA J Hebert PD Ratnasingham S Waard JR. Barcoding animal life cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related specie J. Proc Biol Sci S1 S96-S Hebert PD Cywinska A Ball SL et al. Biological identifi-cations through DNA barcodes J. Proc Biol Sci Chen SL Yao H Han JP et al. Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species J. PloS One e Yao H Song JY Liu C et al. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals J. PloS One e Gao T Yao H Song JY et al. Evaluating the Feasibility of U- sing Candidate DNA Barcodes in Discriminating Species of the Large Asteraceae Family J. BMC Evolutionary Biology DNA J Pang XH Song JY Zhu YJ et al. Using DNA barcoding to i- dentify species within Euphorbiaceae J. Planta Medi DNA J Pang XH Song JY Zhu YJ et al. Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification J. Cladistics Schultz J Muller T Achtziger M et al. The internal transcribed spacer 2 database-a web server for not only low level phylogenetic analyses J. Nucleic Acids Res M Hong DY Pan KY Turland NJ. Flora of China S. Beijing Science Press St. Louis the Missouri Botanical Garden Press ITS

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